HPLC болон хялгасан судсыг ашиглах. Фармакокинетик ба био хүртээмжийн судалгаа - фармакокинетик ба фармакодинамикийн сэтгүүл Өндөр хүчин чадалтай шингэний хроматографи

Гар бичмэл хэлбэрээр

МЕЛНИКОВ Игорь Олегович

АМИН ХҮЧЛИЙН ШИНЖИЛГЭЭНИЙ БИЧГИЙН АРГА ЗҮЙН БОЛОВСРУУЛАХ,

БОГИНО ПЕПТИД БА ОЛИГОНУКЛЕОТИД

RP HPLC БОЛОН ХЯЛГАЛТ ХЭРЭГЛЭХ

ЭЛЕКТРОФОРЕЗ

Мэргэжил: 02.00.02 – Аналитик хими

Химийн шинжлэх ухааны нэр дэвшигчийн зэрэг олгох диссертаци

МОСКВА 2006 Диссертацийн ажлыг Москвагийн нэрэмжит Нарийн химийн технологийн академийн Аналитик химийн тэнхимд хийж гүйцэтгэсэн.

М.В. Ломоносовын нэрэмжит Биорганик химийн хүрээлэнгийн аналитик уургийн химийн бүлэгт. Академич М.М. Шемякин, Ю.А. Овчинников РАС.

Шинжлэх ухааны захирал:

Химийн шинжлэх ухааны нэр дэвшигч, дэд профессор Глубоков Юрий Михайлович

Албан ёсны өрсөлдөгчид:

Химийн шинжлэх ухааны доктор, профессор Макаров Николай Васильевич Химийн шинжлэх ухааны нэр дэвшигч Кириллова Юлия Геннадьевна

Тэргүүлэх байгууллага:

нэрэмжит биохимийн физикийн хүрээлэн. Н.М. Эмануэль РАС

Хамгаалалт 2006 оны 12-р сарын 20-ны өдрийн 12:00 цагт Москвагийн нэрэмжит Нарийн химийн технологийн академийн Д 212.120.05 диссертацийн зөвлөлийн хурлаар болно. М.В. Ломоносов хаягаар: 119571, Москва, Вернадскийн өргөн чөлөө, 86, өрөө. М-119.

Диссертацийг Москвагийн Улсын Нарийн Химийн Технологийн Академийн номын сангаас олж болно. М.В. Ломоносов.

Диссертацийн зөвлөлийн эрдэм шинжилгээний нарийн бичгийн дарга, химийн шинжлэх ухааны нэр дэвшигч Ю.А. Ефимова Хамааралтай байдалажил. Одоогийн байдлаар эмнэлзүйн судалгаа нь хамгийн түгээмэл, аюултай нийгмийн ач холбогдолтой өвчнийг оношлох багажийн микроаналитик аргыг ашиглахад улам бүр төвлөрч байна. Эдгээр аргуудын нэлээд хэсэг нь цаг тухайд нь, өндөр чанартай оношийг бүрэн гүйцэд хийж чаддаггүй бөгөөд тэр бүр хүний ​​биохимийн байдлыг хянах орчин үеийн шаардлагад нийцдэггүй.

Физиологийн шингэний нэг хэсэг болох чөлөөт амин хүчлүүд ба богино пептидүүд нь үйл ажиллагааны чухал ач холбогдолтой. Зарим тохиолдолд тэдгээр нь зарим өвчний молекулын маркер болж чаддаг.

Тэдний концентрацийн өөрчлөлт нь ихэвчлэн бодисын солилцооны эмгэгтэй холбоотой байдаг бөгөөд энэ нь тодорхой өвчний хөгжлийг харуулдаг. Амин хүчлийн шинжилгээний ихэнх аргууд нь тэдгээрийг тодорхойлоход хангалттай мэдрэмтгий биш, сонгомол биш, эсвэл амин хүчлүүдийн деривацийг шаарддаг бөгөөд энэ нь тэдгээрийг тодорхойлох үйл явцыг ихээхэн хүндрүүлдэг. Үнэгүй генийн кодлогдсон амин хүчлүүдийн энгийн бөгөөд хэмнэлттэй дүн шинжилгээ хийх асуудал бүрэн шийдэгдээгүй байна. Үүний зэрэгцээ, амин хүчлүүдийн эмнэлзүйн шинжилгээ нь өндөр мэдрэмжтэй, сонгомол тодорхойлохын тулд баганын өмнөх болон дараах өөрчлөлтийг шаарддаг. Физиологийн шингэн дэх молекулын маркерын агууламжийн өөрчлөлт нь өвчтөний тодорхой өвчинд удамшлын урьдал нөхцөлтэй холбоотой байж болно. Тиймээс судалж буй өвчний шалтгааныг тогтоох найдвартай байдлыг нэмэгдүүлэх, эмчилгээг илүү үр дүнтэй болгохын тулд ДНХ-ийн хэсгүүдийн харьцуулсан шинжилгээ хийх шаардлагатай байна.

Үүний зэрэгцээ, амин хүчил, нуклеотидын шинжилгээнд шаардлагатай импортын тоног төхөөрөмж нь дүрэм ёсоор үнэтэй бөгөөд ихэнх клиник лабораторид хүртээмжгүй байдаг. Өвчний төрөл тус бүрт маш олон төхөөрөмж өндөр мэргэшсэн байдаг тул оношилгооны аргууд нь тоног төхөөрөмж болон арга зүйн хувьд олон удаа давхардсан байдаг нь нөхцөл байдлыг улам хүндрүүлж байна.

Энэ нь эмнэлзүйн судалгааны зардлыг эрс нэмэгдүүлж, харьцуулалтыг хүндрүүлж байна.Зохиогч Оросын ШУА-ийн Биорганик химийн хүрээлэнгийн аналитик уургийн химийн бүлгийн дарга, ахлах эрдэм шинжилгээний ажилтан, химийн шинжлэх ухааны нэр дэвшигчид талархал илэрхийлэв. I.V. Назимовыг байнгын тусламж, анхаарал, үр дүнгийн талаар ярилцсан.

олж авсан шинжилгээний үр дүнгийн тайлбар. Тиймээс биополимер ба тэдгээрийн хэсгүүдийн бүтцийн шинжилгээнд зориулж чөлөөт болон өөрчлөгдсөн амин хүчил, богино пептид, олигонуклеотидыг өндөр мэдрэмжтэй, хурдан, найдвартай тодорхойлох дотоодын үйлдвэрлэлийн олон нийтэд нээлттэй аналитик төхөөрөмжийг ашиглах боломжийг өргөжүүлэх шинэ аргуудыг хөгжүүлэх, Эмнэлзүйн оношлогооны зорилгоор шинжлэх ухааны нэн яаралтай ажил юм.

Ажлын зорилго. ЗорилгоДиссертацийн ажил нь дотоодын багажийн баазыг ашиглан чөлөөт болон өөрчлөгдсөн амин хүчил, богино пептид, олигонуклеотидыг шинжлэх багажийн өндөр мэдрэмжтэй микро аргуудын цогцолборыг боловсруулах явдал юм.

Шинжлэх ухааны шинэлэг зүйл.

1. Хэт ягаан туяаны фотометрийн болон рефрактометрийн шууд илрүүлэх аргуудаар капилляр бүсийн электрофорез, мицелляр электрокинетик хроматографи ашиглан өөрчлөгдөөгүй генетикийн кодлогдсон α-амин хүчлийг тодорхойлох аргуудыг боловсруулсан.

2. Цусны сийвэн дэх бага молекул аминотиолыг флюориметрийн болон хэт ягаан туяаны шууд фотометрийн илрүүлэх аргаар урвуу фазын өндөр үзүүлэлттэй шингэн хроматографи болон капилляр бүсийн электрофорез ашиглан хамтран тодорхойлох аргуудыг боловсруулж, эмнэлзүйн практикт хэрэглэж байна.

3. Флюориметрийн илрүүлэлттэй капилляр гель электрофорез ашиглан аллелийн өвөрмөц полимеразын гинжин урвалын бүтээгдэхүүний шинжилгээнд үндэслэн венийн тромбозын мутант генийн фрагментийг тодорхойлох аргыг боловсруулсан.

Практик ач холбогдол . Амин хүчлийн шинжилгээний боловсруулсан арга нь генетикийн хувьд кодлогдсон амин хүчлүүдийн бичил хэмжээг урьдчилан деривацилалгүйгээр тодорхойлох боломжийг олгодог бөгөөд энэ нь одоо байгаа шинжилгээний схемийг ихээхэн хялбаршуулдаг. Судасны ослын молекулын маркер (гомоцистеин, цистеин, глутатион), түүнчлэн венийн тромбозын мутант генийн хэсгүүдийг шинжлэх цогц аргуудыг боловсруулж, практикт ашиглахыг санал болгов. Гүйцэтгэсэн ажлын үр дүнд капилляр электрофорезын нэг төхөөрөмж дээр уураг болон нуклейн бүрэлдэхүүн хэсгүүдийн биохимийн шинжилгээг хийх дотоодын төхөөрөмжийг үр дүнтэй ашиглах боломжийг харуулах боломжтой болсон. Энэхүү ажилд боловсруулсан аргыг ашиглан цусны сийвэн дэх хүхэр агуулсан амин хүчил, пептидийг тодорхойлохдоо шигдээс болон шигдээсийн өмнөх нөхцөл байдал найдвартай тогтоогдсон олон арван өвчтөний эрсдэлт хүчин зүйлийг үнэлэхэд ашигласан. Гүйцэтгэсэн ажлын үр дүнг шинжлэх ухааны төвд боловсруулсан зарим нийгмийн ач холбогдолтой өвчний (зүрхний шигдээс, цус харвалт, тромбоз) молекулын оношлогооны бүх нийтийн, хэмнэлттэй автоматжуулсан багаж хэрэгсэл, аргуудын биоанагаахын шинжилгээний цогцолборыг бий болгох, практикт туршихад ашигласан. ОХУ-ын ШУА-ийн Аналитик багаж хэрэгслийн хүрээлэн.

Хамгаалалтад оруулсан:

капилляр бүсийн электрофорез ба мицелляр электрокинетик хроматографийн тусламжтайгаар генетикийн хувьд кодлогдсон амин хүчлийг усан уусмалд урьдчилан үүсэлтгүйгээр тодорхойлох арга;

фтороген урвалжууд (монобромобиман ба 5-иодоацетамидофлуоресцеин) ашиглан бага молекул жинтэй плазмын аминотиолыг дерватизаци хийх оновчтой нөхцөл;

RP HPLC ба капилляр электрофорез ашиглан цусны сийвэн дэх бага молекул жинтэй аминотиолыг шинжлэх арга;

цусны сийвэн дэх гомоцистеины агууламжийг RP HPLC болон капилляр бүсийн электрофорезийн аргаар тодорхойлох үр дүн;

Шугаман поли-N, N'dimethylacrylamide дахь капилляр гель электрофорез ашиглан венийн тромбозын мутант генийг тодорхойлох арга.

Ажлын баталгаажуулалт. Үндсэн үр дүнМолекулын шингэний хроматографи ба хялгасан судасны электрофорезийн тухай Бүх Оросын 8-р симпозиум (2001 оны 10-р сарын 15-19, Москва, Орос), Био шинжлэх ухаан дахь салгах аргын олон улсын 3-р симпозиум (5-р сарын 13-18, Москва, 20, 2001) -д бүтээлээ танилцуулав. , ), "Ломоносов-2005" суурь шинжлэх ухааны бакалавр, аспирант оюутнуудын олон улсын бага хурал (Химийн секц. 2005 оны 4-р сарын 12-15, Москва, Орос), "Анагаахын биотехнологийн өнөөгийн тулгамдсан асуудал" шинжлэх ухаан, практикийн II бага хурал (9-р сарын 12) -14 2005, Анапа, ОХУ), нэрэмжит ОХУ-ын Биотехнологичдын нийгэмлэгийн 3-р их хурал. Ю.А. Овчинников (2005 оны 10-р сарын 25-27, Москва, Орос), MITHT-ийн залуу эрдэмтдийн 1-р бага хурал. М.В. Ломоносов (2005 оны 10-р сарын 13-14, Москва, Орос), Аналитик шинжлэх ухааны олон улсын конгресс ICAS-2006 (2006 оны 6-р сарын 25-30, Москва, ОХУ), Европын биохимийн нийгэмлэгүүдийн холбооны 31-р олон улсын конгресс (6-р сарын 24-29) , Стамбул, Турк), Уураг, пептид, полинуклеотидыг салгах олон улсын 26 дахь симпозиум (2006 оны 10-р сарын 16-20, Австри, Инсбрук).

Хэвлэлүүд. Диссертацийн материалд үндэслэн 12 бүтээлийг өгүүлэл, хураангуй хэлбэрээр нийтлэв.

Диссертацийн бүтэц. Диссертаци нь танилцуулга, уран зохиолын тойм, туршилтын хэсэг, үр дүнгийн хэлэлцүүлэг, дүгнэлт, иш татсан уран зохиолын жагсаалтаас бүрдэнэ.

Диссертацийн материалыг 147 хуудас, 19 хүснэгт, 42 зураг агуулсан. Утга зохиолын эх сурвалжийн жагсаалт нь 187 нэрээс бүрдэнэ.

Танилцуулгадсэдвийн үндэслэлийг өгч, судалгааны зорилго, хамгаалалтад оруулах заалтуудыг томъёолж, түүний шинжлэх ухааны шинэлэг байдал, практик ач холбогдлыг тэмдэглэв. Судалгааны үр дүнг турших, хэвлэн нийтлэх, түүнчлэн диссертацийн бүтэц, хамрах хүрээний талаархи мэдээллийг өгдөг.

1-р бүлэг. Судалгаанд хамрагдаж буй нэгдлүүдийг шинжлэх аргуудын талаархи ерөнхий мэдээллийг өгсөн болно. Хроматографийн аргууд болон нийтээр хүлээн зөвшөөрөгдсөн таних хэд хэдэн аргуудыг илүү дэлгэрэнгүй тайлбарласан болно. Цусны сийвэн дэх бага молекул жинтэй аминотиолууд, түүнчлэн ДНХ-ийн хэсгүүдийг тодорхойлох аргуудыг авч үздэг. Амин хүчил, богино пептид, олигонуклеотидын шинжилгээний одоо байгаа аргуудын харьцуулалтыг хийж, энэ чиглэлээр цаашдын судалгааны ач холбогдлыг нотолсон болно.

2-р бүлэг. Материал, урвалж, ашигласан уусмал бэлтгэх арга, ажлыг гүйцэтгэх талаархи мэдээллийг өгдөг.

3-р бүлэг. Үр дүн, хэлэлцүүлэг.

Физиологийн шингэн дэх чөлөөт амин хүчлүүдийн (AA) агууламж нь хэд хэдэн өвчний оношлогооны үзүүлэлт юм. Гүйцэтгэсэн судалгаа нь тэдгээрийг хурдан, найдвартай салгаж, тодорхойлох боломжийг олгодог техникийг боловсруулахад чиглэгддэг. Ийм АА-ийн хольцын шинжилгээг капилляр бүсийн электрофорез (CZE) ба мицелляр электрокинетик хроматографи ашиглан хийсэн.А-ийн хугарлын илтгэгчийг CZE аргаар АА-ийн хольцыг ашиглан рефрактометр илрүүлэх урт 90 см, үр дүнтэй урт 75 см. .

A) Буфер: 60 мМ натрийн борат, рН 11.0. Хүчдэл: 20 кВ. Гүйдэл: 93 мкА. Температур: арын цахилгаан дээжийн оновчтой найрлагын 21.0 ° C Тарилгын хугацаа: 7.0 сек (цахилгаан кинетик, дээжийг шахах үеийн хүчдэл - 5 кВ). Троллыг танилцуулав. Энэ зорилгоор АА-ийн хэмжээг туршсан - 0.1 нг; аланин, тирозин - 0.2 нг.

4 - пролин; 5 - аланин; 6 - тирозин; 7 - Серин; - аспарагины хүчил; 9 - метионин.

CAPS буфер системүүд, түүнчлэн тэдгээрийн янз бүрийн хослолууд нь өөр өөр шинж чанар, шинж чанар бүхий радикалууд, амин бүлгийн хамгийн өөр pKa утгатай 8 АА-ийн загвар хольцын жишээг ашиглан. Боратын тулгуур электролит ашиглан ийм хольцыг салгах жишээг 1-р зурагт үзүүлэв.

Энэ аргаар чөлөөт АА-ыг ялгах хамгийн оновчтой дэвсгэр электролит нь 60 мМ боратын буфер (рН 11.0) агуулсан уусмал юм.

Үүнийг ашиглан янз бүрийн хүчин зүйлийн (хүчдэл, гүйдэл, капиллярын дотоод диаметр ба үр дүнтэй урт, дээж нэвтрүүлэх арга) ялгах үр ашигт үзүүлэх нөлөөг судалж, туршилтын нөхцөлд хольцыг бүрэн салгах боломжгүй болохыг харуулсан. бүх кодлогдсон АА. Туршилтаас харахад шилжилтийн хугацааны зөрүү 1 минутаас хэтэрсэн АС-уудыг хүлээн зөвшөөрч болно. Ийм учраас сонгодог CZE арга нь глицин, аланин, валин, лейцин, изолейцин, гистидин, фенилаланин, тирозин, түүнчлэн аспартик, глутамины хүчил, цистеины хамт оршиж байгааг ялгаж, тодорхойлж чадахгүй. Тэдний хувьд сонгох чадварын коэффициент нь маш бага бөгөөд 1-тэй ойролцоо байна. Аргинин, лизин, пролин, серин, аспарагины хүчил, метионин нь амархан тусгаарлагдаж, тодорхойлогддог, i.e. 5.5-10.0, 15, 19.5-20.8 минутын шилжилтийн хугацаатай АК-ууд. Энэ бүлгийн АК-ийн сонгомол байдлын коэффициент нь 1.1 - 1.3 хооронд байна. Фосфатыг дэмжигч электролит (рН 11.4) хэрэглэх үед ижил төстэй ерөнхий салгах загвар ажиглагдсан боловч оргил нарийвчлал муутай байв. Гүйцэтгэсэн судалгаагаар рефрактометрийн төгсгөлтэй сонгодог CZE нь хамгийн сайн тохиолдолд усан уусмал дахь 8 АА-аас илүүгүй бүрэн салгах, тодорхойлох боломжийг олгодог. Энэ тохиолдолд ийм хольц дахь заасан салгах боломжгүй АА-ийн агууламж хоёроос хэтрэхгүй байх ёстой.

АА-ыг ялгах үр ашиг нь рН 7-тай суурь электролитэд метанол нэмэхэд мэдэгдэхүйц сайжирдаг. 150 мМ фосфатын буфер (рН 2.0) -ийг 30% боть нэмсэн үед. метанол, генетикийн хувьд кодлогдсон 20 АА-аас 16-г нь салгах боломжтой байсан (Зураг 2). Харамсалтай нь энэ хольцыг бүрэн салгахад нэлээд хугацаа шаардагдана.

Капилляр: дотоод диаметр 75 мкм, нийт урт - 65 см, үр дүнтэй урт - 50 см.

Температур: 28.0 oC. Дээж тарих хугацаа: 1.5 сек (вакуум).

Тодорхойлолт: 1 - лизин, 2 - аргинин, 3 - гистидин, 4 - глицин, 5 - аланин, 6 - валин, 7 - изолейцин, 8 - лейцин, 9 - серин, 10 - треонин, 11 - метионин, 12 - фенилаланин, 13 - глютамины хүчил, 14 - пролин, 15 - аспарагины хүчил, 16 - тирозин.

pH 7-д хэрэглэсэн сонгодог CZE нь шаардлагатай ялгах чанарыг хангаагүй тул чөлөөт АА-ийн шинжилгээнд хэт ягаан туяаг шууд илрүүлэх MEKC аргыг хэрэглэхээр шийдсэн. Натрийн додецил сульфатыг (SDS) буфер уусмалд угаалгын нунтаг болгон нэмсэн. Ажлын явцад суурь электролитийн бүрэлдэхүүн хэсгүүдийн янз бүрийн концентрацийг ашигласан. Хамгийн сайн үр дүнг 133 мм борын хүчил, 33 мм натрийн борат, 100 мм SDS, рН 9.5 агуулсан арын электролит ашиглан олж авсан. Тодорхой найрлагатай электролитийг ашиглах нь үндсэн бүсэд байрлах арын электролитийн рН-ийн утгыг нэгэн зэрэг тодорхойлохын зэрэгцээ шинжлэгдсэн АА-ийн тоог эрс нэмэгдүүлсэн. Зураг дээр. Зураг 3-т 14 АА хольцын электроферограммыг үзүүлэв.

Цагаан будаа. 3. Хэт ягаан туяаг шууд илрүүлэх мицелляр электрокинетик хроматографийн аргаар 14 чөлөөт АА-ийн хольцыг ялгах Капилляр: дотоод диаметр 50 мкм, нийт урт 122 см, үр дүнтэй урт 35 см. Буфер:

133 мМ борын хүчил, 33 мМ натрийн тетраборат (рН 9.5) 100 мМ натрийн додецил сульфат. Хүчдэл: 20 кВ. Гүйдэл: 48 мкА. Температур: 27.5 oC. Дээж тарих хугацаа: 3.0 сек (вакуум).

Хэрэглэсэн АА-ийн хэмжээ 5.0 нг байв. Аланин, валин, изолейцин, глицин - 7.0 нг.

Тодорхойлолт: 1 – валин, 2 – аланин, 3 – изолейцин, 4 – глицин, 5 – серин, 6 – треонин, 7 – тирозин, 8 – гистидин, 9 – фенилаланин, 10 – аргинин, 11 – лизин, 12 – цистеин, 13 - метионин, 14 - глютамины хүчил. * - Системийн оргил үе.

Шилжилт хөдөлгөөний цаг хугацааны олж авсан утгууд нь анхаарал татаж байна.

Хэдийгээр үр дүнтэй хялгасан судасны урт нь бага боловч тэдгээр нь дүрмээр бол сонгодог CZE-тэй харьцуулахад өндөр байдаг бөгөөд энэ нь MEKC-ийн шинж чанартай нэлээд сайн тохирдог. Энэ нь капиллярын нэгж уртад хэрэглэх хүчдэлийн хэмжээтэй холбоотой байж болно. Хувьсах гүйдлийг салгахад шаардагдах шилжилтийн хугацааны зөрүү нь CZE-тэй харьцуулахад хамаагүй бага байна. Энэ нь 0.5 минут байхад хангалттай.

Эрүүл донорын цусны сийвэнд ихэвчлэн чөлөөт төлөвт байдаг генетикийн кодлогдсон 14 АА-г ялгах нөхцлийн талаар илүү нарийвчилсан судалгаа хийсэн. Арын электролитийн рН ба төрөл бүрийн органик уусгагчийн нэмэлтийн нөлөөг дээд зэргийн нарийвчлалын зэрэгт судалсан. Туршилтаас харахад 14 АА хольцыг бүрэн салгахын тулд рН-ийн утга 9.0-10.0 хооронд байх ёстой. Заасан хязгаараас гадуур рН-ийн утгуудад АК-ийн шаардлагатай нарийвчлалыг хангадаггүй. Мэдээжийн хэрэг, рН 9-д энэ нь pKa (AA) утгуудын зөрүүгээс, рН 10-д DDSNAC коньюгатуудын хэсэгчилсэн задралаас үүдэлтэй. Органик уусгагч нэмэлтүүдийн нөлөөг метанол, 2-пропанол, ацетонитрил ашиглан судалсан. Органик уусгагчийн аль нэгийг нэмснээр шилжилт хөдөлгөөний хугацаа болон сонгомол байдлын коэффициентүүд мэдэгдэхүйц өөрчлөгдөхөд хүргэдэг болохыг олж авсан мэдээлэл харуулж байна. Өөрчлөлтийн шинж чанар нь нэмэлт бодисын шинж чанар, агууламжаар тодорхойлогддог. Метанол ба ацетонитрил нь судлагдсан АА-ын салалтыг сайжруулдаггүй бөгөөд энэ нь R нь органик уусгагч молекул болох холимог AA-SDS-R коньюгат үүсгэх чадвар багатайтай холбоотой бололтой. 3-5% 2-пропанол нэмэх нь бүрэлдэхүүн хэсгүүдийн нягтралын түвшинг мэдэгдэхүйц сайжруулж, АА-ийн шилжих хугацааг харьцангуй бага хэмжээгээр нэмэгдүүлдэг. 2-пропанолын концентраци нэмэгдэхийн хэрээр АА-ийн шилжих хугацаа мэдэгдэхүйц нэмэгдэж байгаа нь тодорхойлох хурд буурахад хүргэдэг. Тусгайлан хийсэн судалгаагаар 50 мм борын хүчил, 33 мм натрийн борат, 50 мм СДС агуулсан арын электролит нь органик уусгагч (2-пропанол) -ийн үр дүнтэй хэмжээгээр АА-ыг хамгийн сайн ялгах боломжтой болохыг харуулсан. Зураг дээр. Зураг 4-т 14 АА хольцын электроферограммыг үзүүлэв.

Үзүүлсэн өгөгдөл нь генетикийн кодлогдсон 14 АА-аас 13-ыг нь үр дүнтэй салгаж байгааг харуулж байна. Нийт тусгаарлах хугацаа минутаас хэтрэхгүй. Шилжилтийн хугацаа Sr нь 0.03 байна. Аланин, валин, гистидиний хувьд 0.06-0.08-тай ойролцоо Sr-ийн бага зэрэг том утга ажиглагдаж байна.

Цагаан будаа. 4. Хэт ягаан туяаг шууд илрүүлэх MEKC-ээр 14 АА хольцыг ялгах Капилляр: дотоод диаметр 75 мкм, нийт урт 61 см, үр дүнтэй урт 41 см.

Буфер: 33 мм натрийн тетраборат, 100 мм борын хүчил, 50 мм СДС, 5% 2-пропанол, рН=10.2. Хүчдэл: 25 кВ. Гүйдэл: 65 мкА. Температур: 29.5 oC. Дээж тарих хугацаа: 1.5 сек (вакуум). Хэрэглэсэн АА-ийн хэмжээ 0.5 нг байв.

Тодорхойлолт: 1 - Лизин; 2 - пролин; 3 - фенилаланин; 4 - аланин; 5 - валин; 6 - глицин;

7 - гистидин; 8 - Тирозин; 9 - лейцин + изолейцин; 10 - Серин; 11 - треонин; 12 - глютамины хүчил; 13 - Цистеин.

Шийдвэрлэлтийн хүрсэн түвшин нь авч үзсэн АА-ыг тоон тодорхойлох судалгаа хийх боломжтой болсон. Мэдэгдэж байгаа найрлагатай 14 АА загвар хольцын шинжилгээг хийсэн. Судалгаанаас үзэхэд 3-5% 2-пропанол агуулсан боратын буферийн уусмал ашиглан хэт ягаан туяаг шууд илрүүлэх MEKC арга нь 30-аас бага тохиолдолд 6-8% алдаатай (Sr) 14-16 генетикийн кодлогдсон АА-ыг тодорхойлох боломжийг олгодог. минут. Хүлээн авсан үр дүнгийн үнэн зөвийг "оруулсан-олдсон" аргыг ашиглан нэмэлтээр гүйцэтгэсэн (Хүснэгт 1). MEKC аргыг ашиглан генетикийн кодлогдсон АА-ийн агуулгыг тодорхойлох зөв эсэхийг шалгах (mo(AA) = 0.50 нг; оруулсан - 1.00 нг) Цусны сийвэн дэх гомоцистеин болон бусад бага молекул жинтэй аминотиолуудын шинжилгээ Гомоцистеин (Hcy) ба түүнийг дагалдах аминотиолууд (AT) (кодлогдсон амин хүчил - цистеин (Cys), трипептид глутатион (GSH)). Цусны сийвэн нь зүрх судасны тогтолцооны үйл ажиллагааны доголдлын молекул шинж тэмдэг юм. Энэхүү судалгааны гол зорилго нь ийм өвчний найдвартай эрсдэлт хүчин зүйл болох гомоцистеины агууламжийг тодорхойлох аргыг боловсруулах явдал байв.

Цусны сийвэн дэх бага молекул жинтэй аминотиолын тоон шинжилгээнд дисульфидын холбоог багасгах, цусны сийвэн дэх уураггүйжүүлэх, аминотиолыг зохих урвалжаар өөрчлөх, өөрчилсөн аминотиолуудыг RP HPLC эсвэл CE-ээр нэг буюу өөр илрүүлэх аргаар ялгах, тодорхойлох зэрэг орно. Энэ ажилд исэлдсэн болон уурагтай холбоотой аминотиолуудыг трифенилфосфины тусламжтайгаар багасгасан. Хүнд металлын катионуудыг арилгахын тулд EDTA нэмэлтийг ашигласан. Санал болгож буй бууруулах арга нь тасалгааны температурт дисульфидүүдийг хурдан (15 минут) ба бүрэн хэмжээгээр (96%) бууруулж, сульфгидрилийн бүлгүүдийг ялгаруулдаг. Чөлөөт AT-ийн агуулгыг хэмжих стандарт аргыг ашиглан бууруулах урвалын гарцыг тодорхойлсон. Өндөр молекул жинтэй сийвэнгийн уургуудыг 5-сульфосалицилийн хүчилээр тунадасжуулсан.

Судалгааны явцад түүний концентрацийг оновчтой болгосон бөгөөд энэ нь саармагжуулах үе шатанд шингэрүүлснээс болж мэдрэмжээ алдахаас сэргийлсэн.

Чөлөөт сульфгидрилүүдийн өөрчлөлтийг монобромобиман (mBrB) эсвэл 5-иодоацетамидо-флуоресцеин (5-IAF) ашиглан хийсэн. Шаардлагатай рН-ийн утгыг AT-ийг өөрчлөхөд ашигласан урвалжаас хамааран дитаноламин (pK a = 8.9) ба натрийн ортофосфат ашиглан хадгалсан. Диетаноламиныг хэрэглэснээр зорилтот бүтээгдэхүүн үүсэхийг масс спектрометрээр шууд хянах боломжтой болсон. AT деривативыг тодорхойлохын тулд фотометрийн болон флюориметрийн илрүүлэх аргыг ашигласан. Деривативууд нь шингээлт, флюориметрийн болон массын (MALDI-TOF, ESI) спектроскопоор тодорхойлогддог. Фотометрийн болон флюориметрийн илрүүлэлтийг Hcy деривативуудын шингээлтийн спектр (Hcy-MB - 234 нм) ба флюресценцийн спектрийн (390 нм (өдөөх) ба 478 нм (флюресценц)) дагуу сонгосон долгионы уртад хийсэн. Hcy-AF коньюгатийн флюресценцийн спектрээс үзэхэд флюориметрийн илрүүлэлтийн үед өдөөх хамгийн оновчтой долгионы урт нь 462 нм, флюресценцийн хувьд 504 нм байна.

Монобиман ба флуоресцеины деривативыг тодорхойлохын тулд ижил детектор ашиглах үндсэн боломжийг тодорхойлох аргуудыг нэгтгэхийн тулд 390 нм долгионы урттай өдөөх үр ашгийг судалсан. Үүссэн флюресценцийн хамгийн их эрч хүч, үүний үр дүнд илрүүлэх мэдрэмж нь өдөөлтөд 462 нм долгионы урттай цацрагийг ашиглах үеийнхээс хамаагүй бага байв.

Бие даасан монобромобиман (MB) ба ацетамидофлуоресцеины (AF) AT деривативууд болон тэдгээрийн загвар хольцуудад дүн шинжилгээ хийсэн. Монбромобиманы бие даасан деривативууд Cys, Hcy болон GSH нь 6.01 ± 0.19, 10.76 ± 0.17 ба 11.89 ± 0.11 (Зураг 5) 1 хадгалах хугацаатай (мин) ялгарсан.

Мэдэгдэж буй найрлагатай аминотиолуудын хольцыг хэрэглэх үед хадгалах хугацаа ижил байна. Туршилтын олж авсан өгөгдөл нь өөрчлөлтийн урвалын гарцыг тооцоолох боломжтой болсон. Энэ нь 97% -иас багагүй байсан бөгөөд энэ нь мэдэгдэж буй өгөгдөлтэй сайн нийцэж байгаа боловч дээж бэлтгэх илүү хатуу нөхцөлд авсан. Үүссэн деривативуудыг хольцоос тусгаарлаж, масс спектрометрээр тодорхойлсон.

Флуоресцеины деривативууд Cys, Hcy болон GSH нь 8.49 ± 0.12 хадгалах хугацаа (мин) -ээр ялгарсан; 10.46 ±0.15 ба 12.96 ±0.14 тус тус (Зураг 6).

Хроматографийн шинжилгээг дотоодын өндөр хүчин чадалтай шингэн хроматограф "MiliChrom A-02" (ЭкоНова, Новосибирск) дээр хийсэн. 5. Монбромобимантай өөрчилсөн аминотиолуудын загвар хольцын RP HPLC. Cys-MB-50.0 µM, Hcy-MB-25.0 µM, GS-MB-25.0 µM.

Флюориметрийн илрүүлэлт (гадаа = 390 нм, экс = 478 нм) Зураг. 6. 5-иодоацетамидофлуоресцеинтэй өөрчилсөн аминотиолуудын загвар хольцын RP HPLC. Cys-AF-100.0 µM, Hcy-AF-150.0 µM, GS-AFµM. Флюориметрийн илрүүлэлт (abs = 390 нм, esp = 478 нм) 5-IAF-ийг шошго болгон ашиглах үед тиол-флюресцент коньюгатуудын оргилуудыг тиол-монобиманы коньюгаттай харьцуулахад илүү сайн нягтардаг. Флюресцент шошгоны оргилын эрчмийг бууруулах замаар туршилтаар тодорхойлсон AT өөрчлөлтийн урвал 5-IAF-ийн гарц 95% байв. Бүх үүссэн деривативуудыг хольцоос тусгаарлаж, масс спектрометрээр тодорхойлсон.

Хүлээн авсан өгөгдөл нь гомоцистеины тоон хэмжээг тодорхойлох аргыг боловсруулах үндэс суурь болсон. Шалгалт тохируулгын муруйг байгуулахын тулд 2.5-аас 100 мкм хүртэлх хольцын дээжийг ашигласан. Сонгосон интервалд Hcy-ийн физиологийн концентрацийн хүрээ (5-50 μM) орно. mBrB-ийг шошго болгон ашигласан. Холимог дахь гомоцистеины агууламжаас хроматографийн оргил хэсгийн шалгалт тохируулгын хамаарал нь судлагдсан концентрацийн хүрээнд шугаман бөгөөд тэгшитгэлээр тодорхойлогддог.

Оргил талбайгаар тодорхойлох үр дүнгийн харьцангуй стандарт хазайлт нь 0.083-аас хэтрэхгүй, нөхөн сэргээх хугацаа - 0.026. MB деривативын флюориметрийн илрүүлэлтийн илрүүлэх хязгаар нь 1 μM (Зураг 7).

Цагаан будаа. 7. Hcy-ийн концентрацаас хамааран хроматографийн оргилын талбайн өөрчлөлт Аргын үр нөлөөг санал болгож буй аргаар бэлтгэсэн бие даасан бодис болон цусны сийвэнгийн дээжийн хроматограммыг харьцуулах замаар баталгаажуулна. Гүйцэтгэсэн судалгаанууд нь цусны сийвэн дэх гомоцистеин, цистеин, глутатионыг тоон тодорхойлох аргыг боловсруулж, дээр дурдсан эсрэгбиемүүдийн MB дериватив хэлбэрээр тогтмол шинжилгээнд амжилттай ашиглах боломжийг олгосон (Зураг 8). . Аргыг боловсруулахдаа нэмэлт хяналтыг "оруулсан-олсон" аргыг ашиглан хийсэн (Хүснэгт 2).

Цагаан будаа. 8. Эрүүл донороос цусны сийвэнгийн RP HPLC. Cys-MB-192.4 µM, HcyMB-10.1 µM, GS-MB-15.7 µM. Флюориметрийн илрүүлэлт HPLC микро багана ашиглан MB дериватив хэлбэрээр Hcy-ийг тодорхойлох Боловсруулсан аргыг ашиглан эрүүл өвчтөнүүд болон зүрх судасны янз бүрийн хэлбэрийн өвчнөөр өвчилсөн цусны сийвэнгийн 50 гаруй дээжинд шинжилгээ хийсэн. Эрүүл өвчтөнүүдийн хувьд өглөө өлөн элгэн дээрээ судсаар авсан цусны сийвэн дэх AT-ийн дундаж агууламж (μM) нь:

Hcy 12.75 ±3.21, GSH 9.53 ±1.17, Cys 206.34 ±24.61. Хүлээн авсан концентрацийн утгууд нь уран зохиолд өгөгдсөн жишиг утгын хүрээнд багтдаг. Зүрх судасны өвчнөөр шаналж буй өвчтөнүүдийн хувьд цусны сийвэн дэх Hcy-ийн агууламж нь өвчний хүнд байдлаас хамаарна. Үр дүн нь өвчтөний эмнэлзүйн байдалтай холбоотой.

Фотометрийн гэх мэт хямд бөгөөд илүү түгээмэл илрүүлэх аргыг ашиглан AT-ийг шинжлэх боломжийг судалсан. Энэ нь цусны сийвэн дэх AT-ийн эмгэгийн өндөр түвшинг тодорхойлох боломжийг олгодог мэдрэмжийг өгдөг болохыг туршилт харуулсан. Фотометрийн илрүүлэлтийг ашиглах үед 5-IAF-ийг шошго болгон ашиглах нь зүйтэй, учир нь энэ нь оргил цэгүүдийг суурь түвшинд (Зураг 9) шийдэж, тоон үзүүлэлтийг гаргах боломжийг олгодог.

Цагаан будаа. 9. Монбромобиман (а) ба 5-иодоацетамидофлуоресцеин (b) -аар өөрчилсөн аминотиолуудын загвар хольцын RP HPLC. A) Cys-MB-50.0 µM, HcyMB-25.0 µM, GS-MB-25.0 µM. B) Cys-AF-50.0 µM, Hcy-AF-75.0 µM, GS-AF- 25.0 µM. Фотометрийн илрүүлэлт (a = 234 нм, b = 250 ба 300 нм) Тиймээс гүйцэтгэсэн ажил нь дээж бэлтгэх үе шатыг оновчтой болгож, шинжилгээнд хамрагдсан бүрэлдэхүүн хэсгийн тоон гарцын баталгаатай "зөөлөн нөхцөлд" явуулах боломжтой болсон. Үүний үндсэн дээр эрүүл, өвчтэй өвчтөнүүдийн цусны сийвэн дэх бага молекул жинтэй эсрэгбиеийн агууламжийг хурдан бөгөөд найдвартай тодорхойлох боломжийг олгодог аргыг боловсруулсан. Хэмжилтийн алдаа 8.5% -иас хэтрэхгүй. Хэмжсэн концентрацийн хүрээний доод хязгаар (2.5 μM) нь цусны сийвэн дэх Hcy-ийн буурсан агууламжийг тодорхойлохын тулд энэ аргыг ашиглах үндсэн боломжийг харуулж байна. Тайлбарласан аргын илрүүлэх хязгаар нь 1 μM байна. Боловсруулсан аргыг өвчтөний цусны сийвэнгийн бодит дээж дээр туршсан бөгөөд ердийн хэрэглээнд ашиглах боломжтой.

Цусны сийвэн дэх гомоцистеин болон бусад бага молекул жинтэй аминотиолуудыг тодорхойлох. 10. AT загварын хольцын CZE, шилжих хугацаа 6.18 ±0.16; цистеин өөрчлөгдсөн mBrB Hcy-MB-700.0 μM, Cys-MB-300.0 μM 6.83 ± 0.20 ба глутатион - 8.54 ± 0.17 минут (Зураг 10). GS-MB- 700.0 μM-тэй харьцуулахад. (шингээх = 234 нм).

Капилляр: дотоод диаметр 50 μм, бүрэн HPLC CZE аргыг ашигласан, урт нь 82 см, үр дүнтэй урт нь 62 см.

Буфер: 50 мМ натрийн тетраборат рН=11.0. AT шинжилгээний хугацааг 2-3 минутаар багасгах.

Хүчдэл: 25 кВ. Гүйдэл: 58 мкА.

(вакуум) хэт ягаан туяаг шууд илрүүлэх нь цусны сийвэн дэх бага хэмжээний Hcy-ийг тодорхойлоход хангалтгүй юм. Гомоцистений агууламж 10 мкМ байх үед дохио / дэвсгэр харьцаа 2.5-3, харьцангуй стандарт хазайлт нь 0.3-0.5 хооронд байна. Энэ аргыг эмгэгийн өндөр түвшинтэй (25 мкм) өвчтөнүүдийн цусны сийвэн дэх Hcy-ийн агууламжийг хянахад хэрэглэнэ. Эдгээр концентрацийг тодорхойлоход харьцангуй стандарт хазайлт нь MB-Cys-ийн хувьд 0.12, MB-Hcy-ийн хувьд 0.18, MB-GS-ийн хувьд 0.17 байна.

Флюориметрийн илрүүлэлт бүхий хялгасан судасны бүсийн электрофорезийг капилляр ион анализаторт "Нанофор 02" (INP RAS, Санкт-Петербург) дээр хийсэн Hcy-ийн MV дериватив хэлбэрээр флюориметрийн RP HPLC болон фотометрийн илрүүлэлттэй CZE (n = 5); P = 0.95 ) AF деривативуудын загвар хольцыг шууд фотометрийн (Зураг 11) болон флюориметрийн (Зураг 12) илрүүлэх (Хүснэгт 3) бүхий CZE аргаар судалсан. Фотометрийн илрүүлэлтийг 492 нм долгионы уртад хийсэн бөгөөд энэ нь 5-IAF-ийн өдөөх долгионы урттай тохирч байна. Флюориметрийн илрүүлэлтийн хувьд өдөөх долгионы урт 473 нм, цацрагийн долгионы урт 514 нм байв. 5-IAP ашиглах нь флюориметрийн илрүүлэлттэй CZE аргаар Hcy-ийг тодорхойлох мэдрэмжийг нэмэгдүүлэх боломжтой болох нь тогтоогдсон.

Шингээлт, 492 нм Зураг. Зураг 11. AT загварын хольцын CZE, мо- Зураг. 12. Флюориметрийн Hcy-AF-100.0 μM, Cys-AF-300.0 µM, GS-AF-Hcy-AF-015, 5-иодоацетамидо-өөрчлөгдсөн 5-иодоацетамидофлуоресцеинтэй шууд хэт ягаан туяаны флуоресцеинтэй өөрчилсөн AT-ийн загварын холимог CZE. µM, Cys-AF-15.0 µM, GS-AFµM. (abs = 473 нм, exp = 514 нм) 700.0 мкМ. (шингээх = 492 нм).

Капилляр: дотоод диаметр 50 μм, нийт капилляр: дотоод диаметр 50 μм, нийт урт 68 см, үр дүнтэй урт 53 см. урт 65 см, үр дүнтэй урт 57 см.

Буфер: 25 мм натрийн тетраборат, 25 мм фосфат Буфер: 25 мм натрий тетраборат, 25 мм натрий фосфат рН = 11.2. Хүчдэл: 20 кВ. Одоогийн хүч: натрийн рН = 11.2. Хүчдэл: 20 кВ. Одоогийн хүч чадал:

22 мкА. Температур: 25.0 oC. Оролтын хугацаа нь 18 мкА байна. Температур: 25.0 oC. Дээж тарих хугацаа: 5 сек (электрокинетик, хүчдэл: 5 сек (электрокинетик, хүчдэл) Цусны сийвэн дэх гомоцистеины агууламжийг RP HPLC болон капилляр электрофорез ашиглан тодорхойлох боловсруулсан аргуудыг ХК биоанагаахын шинжилгээний практикт нэвтрүүлсэн. Medical Technologies, Ltd.

капилляр гель электрофорез ашиглан.Физиологийн шингэн дэх молекулын маркерын агууламжийн өөрчлөлт нь өвчтөний тодорхой өвчинд удамшлын урьдал нөхцөлтэй холбоотой байж болно. Тиймээс судалж буй өвчний шалтгааныг тогтоох найдвартай байдлыг нэмэгдүүлэх, эмчилгээг илүү үр дүнтэй болгохын тулд ДНХ-ийн хэсгүүдийн харьцуулсан шинжилгээ хийх шаардлагатай байна.

Энэ ажилд бид венийн тромбозын мутант генийн фрагментуудын жишээн дээр аллелийн өвөрмөц ПГУ-ын тусламжтайгаар ДНХ молекул дахь мутацийг тодорхойлоход бэлэн байгаа дотоодын CE төхөөрөмжийг ашиглах боломжийг судалсан. 25-100 μм диаметртэй өөрчлөгдөөгүй кварцын шилэн капилляруудыг ашиглан капилляр гель электрофорез (CGE) аргаар нуклеотидуудыг салгав. Тусгаарлах матриц болгон дотоодын үйлдвэрлэлийн шугаман поли-N,N-диметилакриламид (pDMA) ашигласан. Энэхүү полимерийн сонголт нь CGE-ийн чип хувилбарт ашиглах боломжтой холбоотой юм. pDMA-ийг Synthol ХК-д диметилакриламидын мономероос радикал полимержих замаар нийлэгжүүлсэн. Гинжний уртыг температурыг өөрчлөх эсвэл радикал цэвэрлэгч нэмэх замаар хянадаг. 5-8% pDMA мономер агуулсан полимеруудыг ашигласан. Арын электролит болгон 0.1 М TBE (0.1 М TRIS, 0.1 М борын хүчил, 2.5 мМ EDTA; рН = 8.3) ба 0.1 М TAPS (N-tris(гидроксиметил)метил)-ийг суурь электролит болгон ашигласан. 3-аминопропансульфон хүчил; рН = 8.3) Судалгаанд хамрагдсан бүх полимерууд нь уугуул флюресцент багатай (0.5 AU) байв. 0.1M TAPS ашиглан бэлтгэсэн полимерууд нь хялгасан судсыг гелээр дүүргэхгүйгээр 5 хүртэл салгах боломжийг олгодог бол TBE агуулсан нь 3-аас ихгүй байхыг зөвшөөрдөг. Эдгээр полимерууд нь барууны аналогитай харьцуулахуйц нягтралтай боловч илүү хямд байдаг.

5-15 нуклеотидын урттай флюресцентээр тэмдэглэгдсэн полинуклеотидын хольцын судалгаа. тус бүр нь 10-9 М-ийн агууламжтай, гинжин хэлхээний урт нь 100 нт хүртэл олигонуклеотидыг салгах оновчтой полимер найрлагыг тодорхойлох боломжтой байв. (Зураг 13). Энэ нь 6% мономер, 7М мочевин, 0.1М TAPS агуулсан pDMA-д суурилсан гель юм.

Цагаан будаа. 13. Урттай полинуклеотидын хольцыг салгах Капилляр: дотоод диаметр - 50 мкм, нийт урт - 45 см, үр дүнтэй урт - 38,5 см Полимер: 6% pDMA мономер, 0,1М TAPS, 7М мочевин. Ажиллаж буй электролит: 0.1M TAPS. Хүчдэл:

10 кВ. Гүйдэл: 4.3 мкА. Температур: 25.0 oC. Дээжийг шахах хугацаа 10 секунд (электрокинетик, дээж цуглуулах хүчдэл 10 кВ).

Салгах нөхцлийг (хүчдэл, гүйдэл, үр дүнтэй урт ба хялгасан судасны диаметр) оновчтой болгосноор нийт урт нь 100 нт-ээс бага олигонуклеотидын үндсэн шугам хүртэл салгах боломжтой болсон. ба уртын зөрүү 1 n.o. (Зураг 14.).

Цагаан будаа. 14. 1 bp уртын зөрүүтэй полинуклеотидын хольцыг салгах.

Капилляр: дотоод диаметр - 50 мкм, нийт урт - 65 см, үр дүнтэй урт - 57,5 ​​см Полимер: 6% pDMA мономер, 0,1М TAPS, 7М мочевин. Ажиллаж буй электролит: 0.1M TAPS. Хүчдэл:

11 кВ. Гүйдэл: 5.1 мкА. Температур: 25.0 oC. Дээжийг шахах хугацаа 10 секунд (электрокинетик, дээж цуглуулах хүчдэл 10 кВ).

Олж авсан мэдээлэл нь венийн тромбозын мутант генийг (хүний ​​цусны бүлэгнэлтийн системийн V хүчин зүйлийн Лейден ген) хурдан, үр дүнтэй оношлох системийг боловсруулах үндэс суурь болсон.

Зэрлэг ба мутант төрлийн бүтээгдэхүүнийг хамтдаа тодорхойлох боломжийг нотлохын тулд (5 bp ялгаа) дараах ПГУ-ыг хийсэн: 1.

Зэрлэг төрлийн ДНХ (мутаци байхгүй) + зэрлэг төрлийн праймер; 2. Зэрлэг төрлийн ДНХ (мутацигүй) + праймер FV Leiden; 3. Гетерозигот мутаци бүхий ДНХ FV Leiden + праймер FV Leiden; 4. ДНХгүй FV Leiden праймер. Урвалын бүтээгдэхүүнийг формамидаар боловсруулж, усаар шингэлсний дараа флюориметрийн илрүүлэлттэй CGE шинжилгээнд хамруулсан. 1 ба 3-р дээжийн шинжилгээ нь ПГУ-ын дараа хольцонд бүтээгдэхүүн байгаа эсэхийг харуулсан ба 2, 4-р дээжинд байхгүй болохыг харуулсан. Энэ хэв маягийг батлахын тулд бид мутант праймер/мутантын бүтээгдэхүүн болон зэрлэг төрлийн праймер/зэрлэг төрлийн бүтээгдэхүүний дээжийн холимогийг 1:1 харьцаагаар шинжлэв (Зураг 15).

Цагаан будаа. 15. Мутантын болон мутант бус ПГУ-ын бүтээгдэхүүнийг хамтарсан тодорхойлох Капилляр: дотоод диаметр – 50 мкм, нийт урт – 45 см, үр дүнтэй урт – 38,5 см Полимер 6% pDMA мономер, 0,1 М TAPS, 7 М мочевин. Ажиллаж буй электролит: 0.1M TAPS. Хүчдэл: 12 кВ.

Гүйдэл: 6.5 мкА. Температур: 25.0 oC. Дээж авах хугацаа: 10 сек (электрокинетик, дээж авах хүчдэл – 10 кВ).

Олж авсан өгөгдөл нь FV Leiden мутаци болон зэрлэг төрлийн аллелийн өвөрмөц ПГУ-ын бүтээгдэхүүнийг хамтарсан тодорхойлох боломжийг харуулж байна. Санал болгож буй арга барил, тухайлбал, янз бүрийн урттай аллелийн өвөрмөц праймер ба нийтлэг тоолуурын праймерыг сонгох, нэгтгэх, дараа нь флюориметрийн илрүүлэлт бүхий CGE шинжилгээ хийх замаар генетикийн хувьд тодорхойлогдсон бусад өвчнийг оношлоход өргөжүүлж болно. Амин хүчил ба богино пептидийн шинжилгээнд ашигладаг дотоодын стандарт тоног төхөөрөмжийг ашиглан олигонуклеотидыг шинжлэх боломжтой гэдгийг тэмдэглэх нь зүйтэй.

1. Рефрактометрийн болон хэт ягаан туяаны шууд илрүүлэлт бүхий мицелляр электрокинетик хроматографи болон капилляр бүсийн электрофорез ашиглан генетикийн кодлогдсон амин хүчлийг урьдчилан деривативгүйгээр шинжлэх аргуудыг боловсруулсан. Суурь электролитийн найрлага, рН-ийн утга, түүнчлэн органик уусгагчийг ялгах үр ашигт үзүүлэх нөлөөг судалсан.

2. Хэт ягаан туяаг шууд илрүүлдэг мицелляр электрокинетик хроматографийн аргыг ашиглан генетикийн кодлогдсон 14 чөлөөт амин хүчлүүдийн загвар хольцын тоон тодорхойлолтыг хийсэн.

3. Флюориметрийн илрүүлэлттэй урвуу фазын HPLC ашиглан эрүүл болон өвчтэй өвчтөний цусны сийвэн дэх бага молекул жинтэй аминотиолын агууламжийг хурдан найдвартай тодорхойлох аргыг боловсруулсан. Цусны сийвэн дэх гомоцистеины бага түвшинг тодорхойлохын тулд энэ аргыг ашиглах үндсэн боломжийг харуулав. Боловсруулсан аргыг өвчтөний цусны сийвэнгийн бодит дээж дээр туршиж үзсэн.

4. Цусны сийвэн дэх гомоцистеины эмгэгийн өндөр концентрацийг капилляр бүсийн электрофорезийн аргаар фотометрийн илрүүлэлтээр тодорхойлох боломжийг харуулсан. Боловсруулсан аргыг өвчтөний цусны сийвэнгийн бодит дээж дээр туршиж үзсэн. 5-иодоацетамидофлуоресцеиныг шингээх, флюрогенийн шошго болгон ашиглах боломжийг судалсан.

5. Венийн тромбозын мутант генийн фрагментийг (FV Leiden мутаци) флюориметрийн илрүүлэлттэй капилляр гель электрофорезоор сонгон тодорхойлох аргыг боловсруулсан. 100 хүртэлх нуклеотидын гинжин хэлхээтэй нуклеотидыг шинжлэх боломжийг харуулсан. мөн 1 n.o уртын зөрүүтэй.

Диссертацийн үндсэн материалыг дараах бүтээлүүдэд толилуулж байна.

1. Мельников И.О., Назимов И.В., Стукачева Е.А., Глубоков Ю.М. Цусны сийвэн дэх гомоцистеин болон бусад бага молекул жинтэй аминотиолуудын агууламжийг тодорхойлох. // J. Анал. Хими. -2006. -Т. 61. -No 11. -С. 1185-1191 он.

2. Мельников И.О., Глубоков Ю.М., Назимов И.В. Рефрактометрийн болон хэт ягаан туяаны шууд илрүүлэлт бүхий чөлөөт амин хүчлүүдийн капилляр электрофорез. // Inf.-anal. мэдээллийн товхимол "MITHT-ийн шинжлэх ухааны тэмдэглэлүүд." М.:

MITHT. -2004 он. Боть. 11. -С. 54-57.

3. Мельников И.О., Глубоков Ю.М., Назимов И.В. Флюресцент ба хэт ягаан туяаг шууд илрүүлэх капилляр электрофорез ба RP HPLC-ээр бага молекул жинтэй аминотиолын шинжилгээ. // J. "Орчин үеийн өндөр технологийн технологи." М.: Байгалийн ухааны академи, -2005. -Үгүй 3. -Х.40-41.

4. Мельников И.О., Назимов И.В., Стукачева Е.А., Глубоков Ю.М. Судасны шалгуур болох гомоцистеиныг HPLC ба HPCE тодорхойлохөвчний эрсдэлт хүчин зүйл. // FEBS J. -2006. -В. 273. -С.1. -П. 256.

5. Мельников И.О., Назимов И.В., Лобазов А.Ф., Попкович Г.В. Өөрчлөгдөөгүй амин хүчлүүдийн капилляр электрофорез. // Хураангуй. тайлан Молекул шингэний хроматографи ба хялгасан судасны электрофорезийн талаархи Бүх Оросын 8-р симпозиум, Москва, 2001 оны 10-р сар, P. 23.

6. Мельников И.О., Назимов И.В., Лобазов А.Ф., Попкович Г.Б. Рефрактометрээр кодлогдсон өөрчлөгдөөгүй амин хүчлүүдийн капилляр электрофорезИлрүүлэх. // Био шинжлэх ухаан дахь салгах олон улсын 3-р симпозиум, Москва, 2003 оны 5-р сар, P. 263.

7. Мельников И.О., Стукачева Е.А., Глубоков Ю.М., Назимов И.В. Цусны сийвэн дэх гомоцистеин болон бусад бага молекул жинтэй аминотиолуудыг CEF ба RP HPLC аргаар тодорхойлох. // "Ломоносов-2005" Суурь шинжлэх ухааны оюутнууд, аспирантуудын олон улсын бага хурлын материал.

М.: МУБИС, 2005. Химийн секц. -Т. 1. -С. 31.

8. Назимов И.В., Мельников И.О., Глубоков Ю.М., Сивоплясова Е.А. Гомоцистеиныг зүрх судасны өвчний эрсдэлт хүчин зүйл болгон тодорхойлох багажийн микро аргууд. // Анапа, 2005 оны 9-р сар, "Эмнэлгийн биотехнологийн өнөөгийн асуудлууд" 2-р эрдэм шинжилгээ, практикийн бага хурлын материалууд, -С. 15-16.

9. Мельников И.О., Назимов И.В., Сивоплясова Е.А., Глубоков Ю.М. Цусны сийвэн дэх гомоцистеины тоон хэмжээг тодорхойлох бичил аргууд. // Оросын биотехнологичдын нийгэмлэгийн 3-р их хурлын материал. Ю.А. Овчинникова, Москва, 2005 оны 10-р сар, -С. 61.

10. Мельников И.О., Сивоплясова Е.А., Глубоков Ю.М., Назимов И.В. Хроматографийн шинжилгээний аргыг ашиглан зүрх судасны өвчний эрсдэлт хүчин зүйлсийг тодорхойлох. // Залуу эрдэмтдийн 1-р бага хурлын материалууд MITHT im. М.В. Ломоносов, Москва, 2005 оны 10-р сар, -С. 31.

11. Мельников И.О., Назимов И.В., Стукачева Е.А., Глубоков Ю.М. Цусан дахь бага молекул жинтэй аминотиолуудыг ялгах, тодорхойлохурвуу фазын өндөр үзүүлэлттэй шингэн хроматографи ба капилляр электрофорез. // Аналитик шинжлэх ухааны олон улсын конгресс ICAS-2006, Москва, 2006 оны 6-р сар, -П. 204.

12. Мельников И.О., Назимов И.В., Патрушев Л.И., Алексеев Я.И., Глубоков Ю.М., Мосина А.Г. Хүний лейден генийн мутацийг тодорхойлохөндөр гүйцэтгэлтэй капилляр гель электрофорез. // Уураг, пептид, полинуклеотидыг салгах 26 дахь олон улсын симпозиум, LMP, Инсбрук, Австри, 2006 оны 10-р сар, -П. 24.

Үүнтэй төстэй бүтээлүүд:

“Дмитрий Сергеевич Копчук 5-АРИЛ-2,2’-БИПИРИДИН, ТЭДНИЙ ЛЮМИНЕСЦЕНТ ЦОГЦОЛБОРЫГ ЛАНТАНИД(III)-аар ФУНКЦИОНЖУУЛСАН 02.00.03. – Химийн шинжлэх ухааны нэр дэвшигчийн эрдмийн зэрэг хамгаалсан диссертацийн органик химийн хураангуй Екатеринбург 2010 ОХУ-ын анхны ерөнхийлөгчийн нэрэмжит УСТУ-УПИ-ийн дээд мэргэжлийн боловсролын улсын боловсролын байгууллагын органик химийн тэнхимд гүйцэтгэсэн. Ельциний ЭРДЭМ ШИНЖИЛГЭЭНИЙ УДИРДЛАГА: Химийн шинжлэх ухааны доктор Кожевников Дмитрий Николаевич АЛБАН ЁСНЫ ЭСРЭГЧИД: Химийн шинжлэх ухааны доктор...”.

“Венв Сергей Валерьевич е Электростатик харилцан үйлчлэл ба макромолекулын анхдагч бүтцийн тэдгээрийн өөрөө зохион байгуулалтад үзүүлэх нөлөөллийн онолын судалгаа 02.00.06 – Өндөр молекулын нэгдлүүд Физик-математикийн шинжлэх ухааны нэр дэвшигчийн зэрэг хамгаалах диссертацийн хураангуй Москва - 2011. М.В.-ийн нэрэмжит Москвагийн Улсын Их Сургуулийн Физикийн факультетийн Полимер ба талстуудын физикийн тэнхимд ажил хийсэн. Ломоносов. Эрдэм шинжилгээний удирдагч: эмч...”

"НИКОЛАЕВ АНДРЕЙ АЛЕКСАНДРОВИЧ 6 ба 1 0 ГРУПЙСДАЛКИЛФОСФИТАМИ 02.00.08. 02.00.08. 02.00.08. 02.00.08. 02.00.08. 02.00.08. 02.00.08. Ашигт малтмалын эрдмийн нэгдлүүдийн химийн найрлага дахь 6 ба 10 ГРУПЙС ДАЛКИЛЛИЙН ХАРИЛЦААНЫ ОНОЛ, ТУРШИЛТЫН СУДАЛГАА. Шинжлэх ухаан Казань - 2008 Ажил гүйцэтгэсэн нэрэмжит Химийн хүрээлэнгийн өндөр молекул ба органик элементийн нэгдлүүдийн тэнхимд. А.М.Бутлеровын муж..."

“Вилесов Александр Сергеевич Янз бүрийн орчин дахь фосфорын полимер хэлбэрийн цацраг-химийн синтез 02.00.01. – Органик бус хими Химийн шинжлэх ухааны нэр дэвшигчийн эрдмийн зэрэг хамгаалсан диссертацийн ХУРААНГУЙ Москва 2009 Энэхүү ажлыг Д.И. Менделеева Шинжлэх ухааны удирдагч: Оросын ШУА-ийн корреспондент гишүүн, химийн шинжлэх ухааны доктор, профессор Наталья Павловна Тарасова Албан ёсны ажилтан..."

“Словохотов Юрий Леонидович АТОМ БҮТЭЦ, ШИНЭ ФУЛЕРЕНИЙН ҮҮСГЭЛИЙН БОЛОР ХИМИЙН Онцлогууд 02.00.03 – Органик хими 02.00.04 – Физик хими 02.00.04 – Физик хими Москвагийн Шинжлэх ухааны докторын зэрэг хамгаалах диссертацийн хураангуй70202-р Москвагийн Химийн хүрээлэнд гүйцэтгэсэн. А.Н.Несмеяновын нэрэмжит Органик элементийн нэгдлүүдийн тухай Оросын Шинжлэх Ухааны Академийн Химийн шинжлэх ухааны доктор, Албан ёсны ажилтан..."

Варнавская Ольга Алексеевна 2,2-ДИПИРИДИЛИНТЭЙ НЕОДИМ (III) ба ЕВРОПИЙ (III)-ийг ОРГАНИК ОРГАНИК ОРЧИНД 2,2-ДИПИРИДИЛИНТЭЙ нийлмэл болгох физик-химийн шинж чанарууд. химийн шинжлэх ухааны нэр дэвшигчийн зэрэгтэй Томск - 2010 Алтайн Улсын Их Сургуульд хийгдэж буй ажил, Барнаул Эрдэм шинжилгээний удирдагч: химийн шинжлэх ухааны нэр дэвшигч, дэд профессор Смагин Владимир Петрович Албан ёсны өрсөлдөгчид: доктор...”

Краснова Татьяна Александровна Полисульфон, поликарбоксилын хүчил ба антибиотикийн олигомеруудыг тодорхойлох, тодорхойлоход матриц (гадаргуу) идэвхжүүлсэн лазер десорбци/ионжуулалт бүхий масс спектрометрийн 02.00.02 - Аналитик хими Саратовын шинжлэх ухааны эрдмийн зэрэг олгох АНСТРАТ. - 2013 он Александр Григорьевич, Николай Григорьевич нарын нэрэмжит Владимир Улсын Их Сургуулийн химийн тэнхимд уг ажил хийгдсэн..."

"ШИНЖИЛГЭЭНИЙ Мэргэжил 02.00.02 - аналитик хими Химийн шинжлэх ухааны нэр дэвшигчийн зэрэг хамгаалах диссертацийн хураангуй Томск - 2012 www.sp-department.ru Энэхүү ажлыг Холбооны улсын төсвийн боловсролын дээд мэргэжлийн боловсролын үндэсний судалгааны байгууллагад гүйцэтгэсэн. .."

"СМИРНОВ Алексей Александрович Тэнцвэргүй бага температурт плазмын HBr ба түүний аргон, гелий, устөрөгчтэй хольц дахь физик, химийн процессууд 02.00.04 - Физик-химийн шинжлэх ухааны докторын диссертацын нэр дэвшигч. o 2010 онд хийгдсэн ажил Дээд мэргэжлийн боловсролын улсын боловсролын байгууллага Иваново улсын химийн технологийн их сургууль. Эрдэм шинжилгээний удирдагч: Химийн шинжлэх ухааны доктор, профессор Ефремов Александр Михайлович Албан ёсны өрсөлдөгчид:..."

«ВАСЮТИН Олег Алексеевич ФЕРРОСПИНЕЛИЙН АДСОРБЦИЙН ШИНЖИЙН СИНТЕЗИЙН НӨХЦӨЛИЙН НӨЛӨӨЛӨЛ, ИТТРИЙН ТӨМӨРГЭРИЙН ГАЗРЫН ҮНДЭСНИЙ ПОТЕНЦИОНТИМЕТРИЙН АРГААР ХИЧЭЭЛИЙН СУДАЛГАА. Химийн шинжлэх ухааны нэр дэвшигчийн эрдмийн зэрэг хамгаалсан диссертацийн хураангуй . Петербург 2012 Энэ ажил Санкт-Петербург хотын Химийн факультетийн коллоид химийн тэнхимд хийгдсэн..."

Мельникова Татьяна Игорьевна Висмут борат ба силленитийн найрлага, бүтцийн онцлогийг тодорхойлох ОНОЛЫН болон ТУРШИЛТЫН ҮЙЛЧИЛГЭЭНИЙ БҮТЭЭЛИЙГ ХӨГЖҮҮЛЭХ Мэргэжил 02.00.21 АШУҮИС-ийн Химийн шинжлэх ухааны Хатуу төлөвийн шинжлэх ухааны зэрэг. Москва 2011 Ажил дууссан, тэнхим дээр М.В.-ийн нэрэмжит Москвагийн Улсын Нарийн Шинжлэх Ухааны Химийн Технологийн Их Сургуулийн Хатуу биеийн физик, химийн тэнхим. Ломоносов Эрдэм шинжилгээний удирдагч: Доктор...”

“Старостина Ирина Алексеевна ЦАВАЛДАГ НЭГДЭЛ ДАХЬ ПОЛИМЕР, МЕТАЛЛЫН ХҮЧЛИЙН СУУРЬ ХАРИЛЦАХ 02.00.06 – Өндөр молекулын нэгдлүүд Химийн шинжлэх ухааны докторын зэрэг хамгаалах диссертацийн АВСТРАТ Казань - 2011 оны ажил. Казань улсын холбооны улсын төсвийн боловсролын дээд мэргэжлийн боловсролын судалгааны технологийн их сургуулийн шинжлэх ухааны зөвлөх Техникийн шинжлэх ухааны доктор, профессор Олег Владиславович Стоянов Албан ёсны өрсөлдөгчид Доктор...”

“ВАСИЛЬЕВ Владимир Петрович СПЕКТРАЛ - 02.00.04 SOLUTIONS дахь METALLOCENE COMPLEXES Zr ба Hf-ийн молекул хоорондын харилцан үйлчлэлийн LUMINESCENCE СУДАЛГАА. - физик хими Химийн шинжлэх ухааны нэр дэвшигчийн зэрэг хамгаалах диссертацийн хураангуй Черноголовка - 2008 ОХУ-ын ШУА-ийн Химийн физикийн асуудлын хүрээлэн, Өмнөд Холбооны Их Сургуулийн сурган хүмүүжүүлэх хүрээлэнд гүйцэтгэсэн. Шинжлэх ухааны удирдагч: Нэр дэвшигч. Химийн шинжлэх ухааны доктор ЛУКОВА Галина Викторовна Албан тушаалтан..."

“СПАНЧЕНКО Ольга Валерьевна ТЭЭВРИЙН МАТЕРИСЫН РНХ-ийн ФУНКЦИОНАЛ ТОПОГРАФИ 02.00.10 - биоорганик хими Химийн шинжлэх ухааны докторын зэрэг хамгаалсан диссертацийн хураангуй Москва - 2010 2 Уг ажлыг ШУА-ийн Химийн нэгдлийн тэнхимд гүйцэтгэсэн. Москва мужийн ..."

“КОШЕЛЕВ Екатерина Валентиновна CaY2S4-Yb2S3 ба CaYb2S4-Y2S3 ТОГТОЛЦОО ДАХЬ ХАТУУ ЭЛЕКТРОЛИТҮҮД Мэргэжлийн чиглэл: 02.00.05 – Электрохими Эрдмийн зэрэг хамгаалсан диссертацийн хураангуй: Химийн шинжлэх ухааны нэр дэвшигчийн зэрэг хамгаалсан. Физик Вятка улсын их сургуулийн Холбооны улсын төсвийн боловсролын байгууллагын хими, Киров Калинина Людмила Алексеевна, Шинжлэх ухааны удирдагч: Химийн шинжлэх ухааны нэр дэвшигч, Вятка улсын их сургуулийн дэд профессор,...

“Екатерина Константиновна Лаврентьева Шавар агуулсан системд загварчлах нь полимер нийлмэл сорбент ба цагаан алтны цахилгаан катализаторын шинж чанарыг хянах аргачлалын хувьд Мэргэшсэн чиглэл: 02.00.06 – өндөр молекулт нэгдлүүд 02.00.05 – цахилгаан химийн шинжлэх ухааны нэр дэвшигчийн диссертацийн хураангуй. физик-математикийн шинжлэх ухаан Москва – 2009 Физикийн тэнхимд хийгдсэн ажил...”

“Евгения Викторовна Корчагина ХИТОЗАН, ҮҮСГЭЛИЙГ ШИНГҮҮЛСЭН УССАН УУССАН НЭГДЭЛ 02.00.06 – өндөр молекулт нэгдлүүд, физик-математикийн шинжлэх ухаан, Физик-математикийн шинжлэх ухааны нэр дэвшигчийн эрдмийн зэрэг хамгаалах диссертацийн хураангуйг Москвад20 явуулсан12. Москвагийн Улсын Их Сургуулийн Физикийн факультетийн Полимер ба талстуудын физикийн тэнхимд..."

“Воробева Екатерина Георгиевна БАЙГАЛИЙН МОНОТЕРПЕНОЙДЫН АЗОТ АГУУЛСАН ҮҮСГЭЛД СУУРИЛСАН ПАЛЛАДИИЙН ХИРЛИЙН ЦОГЦОЛБОЛУУД 02.00.03 – Органик хими Эрдэм шинжилгээний ажлын хураангуйг 2012 оны 1-р сарын 1-ний өдрийн Химийн ухааны докторын зэрэг хамгаалсан. орос ОХУ-ын ШУА-ийн Уралын салбарын Коми шинжлэх ухааны төвийн Химийн академийн Шинжлэх ухааны хүрээлэн, Сыктывкар улсын их сургуулийн FSBEI HPE химийн тэнхимд. Эрдэм шинжилгээний удирдагч: Ольга Залевская...”

"Rykunov Alexey Alekey Alekandrove нь CAMKOMICE-ийн ATELATION-ийн НЭГДСЭН НЭГДСЭН НЭГДСЭН ХИЧЭЭЛИЙН ХИМИЙН ХИЧЭЭЛИЙН ХИМИЙН ХИМИЙН ХИМИЙН ХИМИЙН ХИМИЙН ХИМИЙН ХИМИЙН ХИЧЭЭЛИЙН ХИМИЙН ХИМИЙН ХИМИЙН ХИМИЙН ХИМИЙН ХИМИЙН ХИМИЙН ЗАСГИЙН АЖИЛЛАГАА Оросын хими-технологийн их сургуулийн Байгалийн ухааны факультетийн химийн квант. Д.И. Менделеев Эрдэм шинжилгээний удирдагч: Физик-математикийн шинжлэх ухааны доктор, профессор..."

КОРШУН Владимир Аркадьевич ОЛИГОНУКЛЕОТИДИЙН КОНЮГАТЫН НИЙСЛЭЛД ӨӨРЧЛӨГДСӨН ПИРИМИДИН нуклеозид ба Нуклеозид бус урвалжууд, тэдгээрийн шинж чанар, хэрэглээ 02.00.10 – Москвагийн Химийн шинжлэх ухааны доктор, Биоорганикийн 2-р зэрэгтэй. 012 онд ажил хийгдсэн Интерлейкин генийн инженерийн групп, Генийн экспресс механизмын лаборатори, Нуклейн хүчлийн химийн лаборатори, Органик синтезийн лаборатори, групп...”

Бичлэг

1 НОВОСИБИРСК УЛСЫН ИХ СУРГУУЛЬ Байгалийн ухааны факультет Аналитик химийн тэнхим Курсын ажил Урвуу фазын HPLC дахь пептидийн хадгалалтын хэмжээ ба хэт ягаан туяаны спектрийн таамаглал Гүйцэтгэсэн: Кучкина А.Ю., гр. 147 Эрдэм шинжилгээний удирдагч: Ph.D. Азарова I.N. Новосибирск-2005

2 АГУУЛГА 1. Оршил Уран зохиолын тойм 2.1. Пептидүүд. HPLC пептидийн амин хүчлүүд RP HPLC дахь пептидийн хадгалалтын хэмжээ ба хэт ягаан туяаны спектрийн таамаглал Туршилтын хэсэг Үр дүн ба тэдгээрийн хэлэлцүүлэг 4.1. Хроматографийн системийн тогтвортой байдалд хяналт тавих Пептидийн хадгалалтын эзлэхүүний тооцоо Шугаман “найрлага хадгалах” загвар Шугаман бус “найрлага хадгалах” загвар Пептидийн хэт ягаан туяаны спектрийн тооцоо Дүгнэлт Уран зохиол Хавсралт

3 1. ОРШИЛ Геномын бүтцийн талаарх мэдэгдэж буй мэдээлэлд үндэслэн амьд эсэд үйл ажиллагаа явуулдаг уургийг тодорхойлох нь протеомикийг орчин үеийн молекул биологийн хамгийн чухал зорилтуудын нэг гэж үздэг. Сүүлийн хэдэн жилийн хугацаанд зарим организмын геномыг бүрэн тайлсны дараа энэ асуудал үүссэн. Геномууд нь бие махбодоос илүү олон уураг кодлодог нь тогтоогджээ. Бүх уургийн нийлбэрээр сонирхож буй уургийг тодорхойлох нь дүрмээр бол шууд аргаар шийдвэрлэх боломжгүй арга зүйн нарийн төвөгтэй ажил юм. Пептидомик гэж нэрлэгддэг энэ төрлийн асуудлыг шийдвэрлэх арга замуудын нэг нь уургийн нийлбэрийг тодорхой протеазаар гидролиз хийж, үүссэн пептидийн нийлбэрийг капилляр электрофорез буюу өндөр үзүүлэлттэй шингэн хроматографи (HPLC) аргаар тусгаарладаг явдал юм. Эцсийн зорилго нь мэдэгдэж буй бүтцийн пептидийг (пептид) илрүүлэх явдал бөгөөд энэ нь судалж буй организмын геномоор кодлогдсон уургийн априори хэлтэрхий юм. Хэрэв дээжинд ийм пептид (үүд) илэрсэн бол уураг нь бие махбодид үйлдвэрлэгдэж байна гэж дүгнэнэ. Энэ төрлийн асуудлыг шийдвэрлэхэд гарч буй арга зүйн асуудлуудыг 2 бүлэгт хувааж болно. Эхний асуудал бол ихэвчлэн хэдэн мянган пептидээс бүрдэх хольцыг ялгах явдал юм. Хоёр дахь нь тусгаарлагдсан бие даасан пептидийн бүтцийг тодорхойлох явдал юм. Анхдагч хольцыг хуваах замаар салгах асуудлыг шийдэж, дараа нь салангид хэсгүүдийг салангид бүрэлдэхүүн хэсгүүдэд хуваана. Хоёрдахь асуудлыг голчлон масс спектрометрийн аргаар шийддэг бөгөөд энэ нь эцсийн эцэст бие даасан бүрэлдэхүүн хэсгүүдийн (пептид) молекулын массыг тодорхойлох боломжийг олгодог. Хэрэв пептид нь нэлээд "өвөрмөц" бүтэцтэй (амин хүчлийн багц) - эдгээрт ихэвчлэн урт (амин хүчлийн үлдэгдэлээс илүү) пептидүүд багтдаг - молекулын жин нь мөн "өвөрмөц" байх бөгөөд алдаатай тодорхойлох магадлал бага болно. . Пептидийг салгах процедур нь мэдэгдэж буй амин хүчлүүдтэй пептидийг тусгаарлахад чиглэгддэг тул асуулт гарч ирдэг: ийм пептидийн амин хүчлийн найрлагыг мэдэж, HPLC баганаас гарах хугацааг урьдчилан таамаглах боломжтой юу? Энэ аргыг 80-аад оны эхээр анх харуулсан. Энэхүү судалгааны зорилго нь масс спектрометрт шууд шахахад тохиромжтой хөдөлгөөнт фазыг ашиглан урвуу фазын HPLC (RP HPLC) горимд Milichrom A-02 хроматограф дээр пептидийн хадгалалтын хэмжээг урьдчилан таамаглах аргачлалыг боловсруулах явдал байв. 3

4 2. Уран зохиолын тойм 2.1. Пептидүүд. Амин хүчлүүд Пептидүүд нь пептидийн холбоогоор (-NH-CO-) холбогдсон α-амин хүчлийн үлдэгдэлээс үүссэн биополимерууд юм. Пептидийн ерөнхий томьёог дараах байдлаар илэрхийлж болно: NH 2 CH CO NH CH CO... NH CH R 1 R 2 Rn Уураг ба пептидийн хооронд тодорхой зааг байдаггүй, дүрмээр бол пептидүүд нь түүнээс ихгүй биополимер агуулдаг. 100 амин хүчлийн үлдэгдэл. Амин хүчлүүд нь молекулууд нь амин бүлэг агуулсан аливаа органик хүчил бөгөөд энэ нэр нь ихэвчлэн α-амин хүчлүүд гэсэн утгатай. Тэд биологийн чухал ач холбогдолтой. Уургийг бүрдүүлдэг ихэнх байгалийн амин хүчлүүдийн молекулууд нь ерөнхий томьёотой H 2 NCH R Бүтцийн томъёоноос харахад амин хүчлүүд (пролиныг эс тооцвол) бие биенээсээ зөвхөн R хажуугийн гинжин хэлхээний бүтцээр ялгаатай байдаг. Молекулууд нь хүчиллэг карбоксил бүлэг ба үндсэн амин бүлгийг хоёуланг нь агуулж байдаг тул амин хүчлүүд нь амфотерийн нэгдлүүд юм. Хүчтэй хүчиллэг орчинд карбоксил бүлэг нь голчлон задралгүй, амин бүлэг нь протонжсон байдаг. Хүчтэй шүлтлэг орчинд амин бүлэг нь чөлөөт суурийн хэлбэртэй, карбоксил бүлэг нь карбоксилатын анион хэлбэртэй байдаг. Талст төлөвт амин хүчлүүд нь zwitterion хэлбэрээр оршдог бөгөөд карбоксил бүлгийн протоныг амин бүлэгт шилжүүлдэг. Байгалийн пептид ба уургийн биосинтезд ердөө 20 амин хүчил оролцдог. Амин хүчлүүд ба тэдгээрийн шинж чанарыг хүснэгт 1. Хүснэгт 1. Амин хүчлүүд ба тэдгээрийн шинж чанарууд. Амин хүчлийн нэр Код Бүтэц p a - -NH 2 -R Глицин G H 2.35 9.78 Аланин A H 3 C 2.35 9.87 Валин V H 3 C CH CH 3 2.29 9.74 4

5 Name of amino acid Code Structure p a - -NH 2 -R Leucine L H 3 C CH CH 3 2.33 9.74 Isoleucine I H 3 C * CH CH 3 2.32 9.76 H 2 C Proline P HC NH 1.95 10.64 Phenylalanine F 2.20 9.31 Tryptophan W N H CH NH 2 2.46 9.41 Тирозин Y HO CH NH 2 2.20 9.21 10.46 Серин S HO 2.19 9.21 Треонин T HO * CH CH 3 2.09 9.10 Цистеин С HS 1.92 0. Х2О 80.7 хүчил 80.9 As. 3.36 Глютамины хүчил E HOOC 2.10 10.47 4.07 Аспарагин N H 2 N C O 2.14 8.72 Глютамин Q H 2 N C O 2.17 9.13 Лизин K H 2 N 2.16 9.06 10.54 Аргинин R H 2 N C NH 1.82 8.99 12.48 NH Гистидин H N N8thion, S34 MH301. 2.13 9.28 5

6 Хажуугийн хэлхээний шинж чанараас хамааран амин хүчлийг хоёр бүлэгт хуваадаг: туйлшралгүй (гидрофобик) алифатик эсвэл үнэрт R-бүлэг бүхий амин хүчлүүд; туйлширсан (гидрофиль) R бүлэг бүхий амин хүчлүүд. Эхний бүлэгт 8 амин хүчлүүд орно: аланин, валин, лейцин, изолейцин, метионин, пролин, фенилаланин, триптофан. Долоон амин хүчил нь сөрөг эсвэл эерэг цэнэгийг зөөвөрлөх боломжтой хажуугийн гинжин хэлхээнд бүлгүүдийг агуулдаг: аспартик ба глутамины хүчил нь рН 7.0 үед сөрөг цэнэгтэй; лизин, аргинин, гистидин нь үндсэн амин хүчлүүд бөгөөд тэдгээрийн хажуугийн хэлхээ нь эерэг цэнэгтэй байдаг; шүлтлэг нөхцөлд HPLC пептидүүдийн тирозин ба цистеины хажуугийн бүлгүүд сөрөг цэнэгтэй байж болно.Пептидийн хольцыг салгах нь маш хэцүү ажил юм. Одоогийн байдлаар RP HPLC нь пептидүүдийг ялгах хамгийн чухал арга юм. Пептидүүд нь туйлын бодис бөгөөд тэдгээр нь суурин фазын гидрофобик гадаргуутай харилцан үйлчлэлцэхээс сэргийлж, силанолын үлдэгдэл бүлгүүдтэй харилцан үйлчлэхэд хүргэдэг. Силанолын бүлгүүдийн харилцан үйлчлэлийг багасгахын тулд уусмалд хүчтэй хүчил эсвэл давс нэмнэ. Пептидийн туйлшралыг багасгахын тулд хроматографийг бага рН (3-аас доош) утгаар хийх ёстой. Хэрэв эдгээр зарчмуудыг дагаж мөрдвөл HPLC нь пептидүүдийг ялгах маш уян хатан арга болох нь батлагдлаа. Энэ нь энэ арга нь өндөр ялгах хурд, үр дүнг давтах чадвар, микрограмм бодисын хэмжээг шинжлэх чадвараараа онцлогтой холбоотой юм. RP HPLC-ийн өөр нэг давуу тал нь фракцуудыг бага хэмжээний дэгдэмхий уусгагчаар цуглуулах чадвар бөгөөд энэ нь цаашдын масс спектрометрийн шинжилгээг хялбаршуулдаг. Дүрмээр бол 0.1% trifloroacetic ба шоргоолжны хүчлийг дэгдэмхий уусгагч болгон ашигладаг. Трифтор цууны хүчил нь хэт ягаан туяаны бүсэд 205 нм хүртэл тунгалаг байдаг нь нарийн төвөгтэй хольцын хроматографийн үед маш сайн давуу тал юм. Үүнээс гадна пептидүүд нь трифтор цууны хүчилд маш сайн уусдаг. Урвуу фазуудаас пептидийн шүүрлийг ихэвчлэн органик хувиргагч нэмсэн градиент горимд явуулдаг. Хамгийн түгээмэл органик хувиргагч нь ацетонитрил юм. Энэ нь 200 нм хүртэл хэт ягаан туяаны бүсэд тунгалаг бөгөөд сайн сонгомол байдаг. 6

7 Пептидийн шинжилгээнд RP HPLC-ийг өргөнөөр ашиглахад түлхэц болсон өөр нэг хүчин зүйл бол тэдгээрийн хроматографийн үйлдлийг урьдчилан таамаглах чадвар юм. RP HPLC дахь пептидийн хадгалалтын хэмжээ болон хэт ягаан туяаны спектрийг урьдчилан таамаглах 25-аас бага амин хүчлийн үлдэгдэл агуулсан пептидийн хроматографийн шинж чанар гэсэн санаа. Тэдний амин хүчлийн найрлагыг мэдэх замаар урьдчилан таамаглах боломжтой гэж Ж.Мик анх хэлсэн. Урвуу үе шатанд пептидийн хадгалалт нь тэдгээрийн найрлагад орсон амин хүчлийн үлдэгдлийн гидрофобик чанараар тодорхойлогддог. Үнэрт эсвэл том алифатик гинж бүхий амин хүчлүүд нь хадгалахад гол хувь нэмэр оруулдаг. Дээр дурдсан зүйлс дээр үндэслэн Мик урвуу үе дэх пептидийн хадгалалтын хэмжээг пептидийг бүрдүүлдэг амин хүчлийн үлдэгдлийн нийлбэрээр тооцохыг санал болгов. Тэрээр шугаман (нэмэлт) "найрлага хадгалах" загварыг санал болгосон: V R = V 0 + Z N* + Z C* + Z i (1) V R пептидийн хадгалалтын хэмжээ, v 0 нь баганын чөлөөт эзэлхүүн; Z N* ба Z C* нь пептидийн чөлөөт -NH 2 ба - эсвэл өөрчлөгдсөн терминалын бүлгүүдийн хувь нэмэр юм; Z i нь i-р амин хүчлийн хувь нэмэр (хадгалах тогтмол). Meek градиент RP HPLC нөхцөлд 25 пептид хроматограф хийж, урвуу асуудлыг шийдэж, амин хүчлийн хадгалалтын тогтмолыг тооцоолсон. V R (тооцоолол)=f(v R (илэрхийлэл)) хамаарлын корреляцийн коэффициент нь 0.997 (ph 2.1) ба 0.999 (ph 7.4) байв. Корреляцийн өндөр коэффициентийг үл харгалзан энэ загвар нь физик утгатай зөрчилдөж байна, учир нь ийм аргаар олж авсан амин хүчлийг хадгалах тогтмолууд нь тэдгээрийн гидрофобик байдлын бодит ялгааг тусгаагүй бөгөөд зарим хувь нэмэр нь сөрөг утгатай байдаг. Нэмж дурдахад пептид дэх амин хүчлийн үлдэгдлийн тоо нэмэгдэхийн хэрээр хадгалалтыг тодорхойлдог урвуу фазтай түүний гидрофобик контактын гадаргуу нь шугаман бус байдлаар нэмэгддэг олон баримт байдаг. Ажлын зохиогчид пептидийн хадгалалтын хэмжээг амин хүчлийн үлдэгдлийн нийлбэрээр тооцдог гэсэн таамаглал дэвшүүлжээ. Пептидийн хадгалалтын хэмжээг тооцоолохын тулд тэд дараах загварыг санал болгосон: V R = A* ln (1+ Z j * n j) + B (2) 7

8 энд Z j нь амин хүчлүүдийн гидрофобик чанарт үндэслэн тооцоолсон эмпирик хадгалах параметр юм; А ба В тогтмолууд; n j - пептид дэх амин хүчлийн үлдэгдлийн тоо j. Энэ загвар нь тооцоолсон болон туршилтын пептидийн хадгалалтын хэмжээ хоорондын сайн хамаарлыг хангадаг. Загварын сул тал нь зөвхөн тодорхой хроматографийн системд (өгөгдсөн налуутай шугаман градиент, тогтмол урсгалын хурд, хөдөлгөөнт болон суурин фаз) хүчинтэй байдагт оршино. Тиймээс энэ загварын хэрэглээ маш хязгаарлагдмал. Тиймээс, хянагдаж буй ажлын зохиогчид градиент элюцийн онол дээр суурилсан өөр загварыг санал болгосон бөгөөд энэ нь хроматографийн системүүдийн өргөн хүрээний пептидийн хадгалалтын хэмжээг тооцоолох боломжийг олгодог. Хөдөлгөөнгүй фазтай пептидийн гидрофобик контактын боломжит талбай нь түүний молекул жингийн 2/3-ийн хүчин чадалтай пропорциональ байдаг тул зохиогчид пептидийн хадгалалтын хэмжээг тооцоолох функцийг сонгосон: V R = f (3). ) a, b, c нь тодорхой хроматографийн системийн шинж чанараас хамаарах тогтмолууд бөгөөд энэ зорилгоор сонгосон 15 пептидийн хроматографийн өгөгдлөөс туршилтаар тодорхойлсон. V R (тооцоолол)=f(v R (илэрхийлэл)) хамаарлын корреляцийн коэффициент 0.98 байна. Энэ аргын хэрэглээг хязгаарлаж буй томоохон дутагдал нь загвар пептидтэй хийсэн урьдчилсан туршилтаас тодорхой хроматографийн системийн a, b, c тогтмолуудыг тооцоолох хэрэгцээ бөгөөд энэ нь маш их хөдөлмөр шаардсан процедур юм. Уг ажил нь мэдэгдэж буй амин хүчлийн дараалал бүхий пептидийн хадгалалтын хэмжээ болон хэт ягаан туяаны спектрийг тооцоолж, дээр дурдсан параметрүүдэд амин хүчлүүдийн оруулсан хувь нэмрийг урьд нь тодорхойлсон. Эдгээр хувь нэмэрийн утгыг пептидийн хроматографи хийсэн ижил нөхцөлд олон долгионы урттай фотометрийн аргаар олж авсан амин хүчлүүдийн уусмалын хроматограммуудаас туршилтаар олсон. Ажлын зохиогчид пептидийн хадгалалтын хэмжээг тооцоолох дараах тэгшитгэлийг санал болгосон: V R = 209 [(Z i) + Z C*+N* + V 0 ] 1/3 990 (4) энд Z i нь хадгалах коэффициент юм. амин хүчил "i"; V 0 баганын чөлөөт эзэлхүүн; Z C*+N* нь пептидийн терминалын бүлгүүдийн нийт хадгалалтын тогтмол хэмжээ юм. Пептидийн хэт ягаан туяаны спектрийг тооцоолохдоо пептидийн спектрийг түүний бүх бүтцийн элементүүдийн спектрийн нийлбэр гэж үздэг. Санал болгож буй аргыг туршихын тулд 8 байна

9, 30 пептидийн хроматографи хийсэн бөгөөд тооцоолсон болон туршилтаар олсон хадгалалтын эзэлхүүний хоорондын хамаарлын коэффициент 0.95 байна. Пептидийн хэт ягаан туяаны спектрийг тооцоолох санал болгож буй арга нь таамаглах чадвартай байдаг. Энэхүү ажилд ацетонитрил болон дэгдэмхий бодис болох литийн перхлоратын усан уусмал (0.2 М LiCLO M HClO 4)-ийг цэвэрлэгч болгон ашигласан нь пептидийн дараагийн масс-спектрометрээр тодорхойлоход ихээхэн хүндрэл учруулж байна. Тиймээс бүх бүрэлдэхүүн хэсэг нь дэгдэмхий бодис бөгөөд масс спектрометрийн шинжилгээнд саад учруулдаггүй ацетонитрил - трифтор цууны хүчил агуулсан хөдөлгөөнт фазыг ашиглан аргыг боловсруулах нь бидэнд тохиромжтой санагдсан. 9

10 3. ТУРШИЛТЫН HPLC-ийг Milichrome A-02 хроматограф дээр ProntoSIL C 18 AQ фаз (Bischoff Analysentechnik und Geräte GmbH, Герман) бүхий 2x75 мм багана дээр дараах нөхцлөөр гүйцэтгэв: уусгагч А: 0.01 М трифтор цууны хүчил; цэвэрлэгч В: ацетонитрил; шугаман градиент: 5-аас 100% B хүртэл 40 мин; урсгалын хурд: 100 мкл/мин; баганын температур: 40 С; илрүүлэх: 210, 220, 230, 240, 250, 260, 280 ба 300 нм, τ = 0.18 сек; дээжийн хэмжээ: 4 мкл. Хроматографийн системийг турших шийдэл: KBr - 0.2 мг/мл; уридин - 0.2 мг / мл; кофеин - 1 мг / мл; м-нитроанилин - 0.1 мг / мл; о-нитроанилин-0.1 мг/мл; усанд уусгагч 2% ацетонитрил. Үндсэн бодисын массын эзлэх хувь 98% -иас багагүй бүх урвалжууд. Амин хүчлүүд (Серва, Герман), ацетонитрил “0-р зэрэглэл” (NPF “Kriochrome”, Санкт-Петербург), усгүй трифтор цууны хүчил (ICN Biomedicals, АНУ) зэргийг уг ажилд ашигласан. Пептидийн дээжийг В.В. Самуков ("Вектор" ТББ, Новосибирск) ба И.В. Назимов (IBCh RAS, Москва). Хроматографийн уусмал дахь амин хүчлүүдийн концентраци 0.2 1 мг / мл, пептид 0.1 2 мг / мл байна. Хроматограммыг Multichrome программ (Амперсенд ХК, Москва) ашиглан боловсруулсан. VR, 8 долгионы урт (S λ) дээр илэрсэн хроматографийн оргилуудын талбайг тооцоолохын тулд пептидийн хроматограммын график дүрслэлийг "CHROM P" программыг (ZAO Хроматографийн хүрээлэн "ЭкоНова, Новосибирск) ашигласан. 1-р зурагт үзүүлсэн муруйг шугаман болгох ажлыг Microsoft Excel программ (Microsoft Corporation) ашиглан гүйцэтгэсэн. 10

11 4. ҮР ДҮН, ТҮҮНИЙ ХЭЛЭЛЦҮҮЛЭГ 4.1. Хроматографийн системийн тогтвортой байдалд хяналт тавих Хроматографийн системийн тогтворжилтыг аргачлалаар зохицуулсан журмын дагуу хянана. Туршилтын уусмалыг хроматографи хийж, үүссэн хроматографаас 14 параметрийг тооцоолсон бөгөөд тус бүр нь хроматографийн системийн тодорхой үзүүлэлтийг хянадаг: VR баганын бромидын ионы чөлөөт эзэлхүүн; уридины спектрийн харьцаа S 280 /S 250; детекторын тааруулах нарийвчлал 250-280 нм; спектрийн харьцаа S 260 / S 280 кофейн детекторын шугаман хүрээ; спектрийн харьцаа S 260 /S 230 м - ялгаруулагчийн нитроанилины тохиромжтой A. О-нитроанилин оргилыг хянахад ашигласан: V R өгөгдсөн хэлбэрээс градиентийн хазайлт, спектрийн харьцаа, детекторын тааруулах нарийвчлал 210-300 нм, оргилын тэгш бус байдал А баганын савлагааны 10% зөрчил , S 210 дээжийн тунгийн нарийвчлал. Загварын уусмалын хроматографийн болон спектрийн параметрүүдийг үе үе хэмжих нь ашигласан хроматографийн системийн үйл ажиллагааны давтагдах чадварыг шалгах боломжийг бидэнд олгосон. Туршилтын үр дүнг Хүснэгт 2-д үзүүлэв. Хүснэгт 2. Хроматографийн системийн туршилтын үр дүн, n = 8. Бодисын параметр 11 Параметрийн дундаж утга S r (%) Бромид V R, мкл 148 1.0 Уридин S 280 /S 250 0.53 1.3 Кофеин S 260 /S 280 0.73 0.6 м-нитроанилин S 260 /S 230 0.80 1.0 о-нитроанилин V R, мкл,6 S 220 /S 210 1.71 0.5 S 230 /S 210 1.7160. 260 /С 210 0.58 0.9 S 250 /S 210 0.40 1.4 S 280 /S 210 0.59 0.9 S 300 /S 210 0.32 1.2 A 10% 1.05 1.1 Гаралтын дохио (оргил талбай) e.2.p. мкл 25.00 1.4

12 S r-ийн олж авсан утгууд нь тайлбарласан хроматографийн системийн тогтвортой байдлын талаар дүгнэлт гаргах боломжийг бидэнд олгодог пептидийн хадгалалтын хэмжээг тооцоолох Амин хүчлийн хадгалалтын коэффициентийг тооцоолоход шаардлагатай хроматографийн анхны өгөгдлийг эдгээр амин хүчлүүдийн хроматограммуудаас олж авсан. пептид GG болон GGG 3-т заасан нөхцөлд. Тэгшитгэлээр тооцоолсон амин хүчлийг хадгалах коэффициент: Z i = V Ri V 0 Z C*+N* (5) энд V Ri нь “i” амин хүчлийг хадгалах хэмжээ; V 0 баганын чөлөөт эзэлхүүн (хадгалах хэмжээ Br -, энэ хроматографийн системд энэ нь 148 мкл байсан); Z C+N нь пептидийн терминалын бүлгүүдийн нийт хадгалалтын тогтмол хэмжээ юм. Z C+N-ийг тэгшитгэлийг ашиглан тооцоолсон: Z C*+N* = V R (G) V 0 ((6) энд V R (G) нь глициний хадгалах хэмжээ, мкл; V R (GGG) ба v R (GG) GGG ба GG пептидийн хадгалалтын хэмжээ , мкл Төгсгөлийн бүлгүүдийн хадгалах коэффициентүүдийн нийлбэр [(-NH 2) + (-CONH 2)] нь бүлгүүдийн хадгалах коэффициентийн нийлбэртэй тэнцүү гэж үзсэн [(- NH 2) + (-)].Хроматографийн өгөгдөл болон пептидийн бүтцийн элементүүдийн тооцоолсон хадгалалтын тогтмолуудыг хүснэгт 3-т үзүүлэв.Хүснэгт 3. Амин хүчил ба пептидийн GG ба GGG-ийн хадгалалтын хэмжээ Пептидийн бүтцийн элементүүдийн хадгалах тогтмолууд Code V R. , мкл Z i, мкл код V R, мкл Z i, мкл N P S V G M Q Y D I H L T F E W K GG C GGG A (C*+N*) төгсгөл - 25 R

13 Шугаман загвар "найрлагийн хадгалалт" Ажилд санал болгож буй шугаман загварын хүрээнд пептидийн хадгалалтын хэмжээг урьдчилан таамаглахын тулд бид 28 пептидийн хадгалалтын эзэлхүүнийг тооцоолж (Хүснэгт 4) олж авсан өгөгдлийг туршилтаар олсон өгөгдөлтэй харьцуулсан (Зураг 2). 1). Хүснэгт 4. Туршилтаар олдсон, тооцоолсон пептидийн хадгалалтын хэмжээ (шугаман загвар). Пептид V R (үзнэ үү), мкл V R (тооцоол.), мкл 1 GG GGG AS GRGDS TKPR WAGGDASGE GL MY KPVGKKRRPVKVYP W-D-YGGDASGE W-D-AGGDA NCMLDY SYSMEHFRWG W-DGEPFYSPFGRWG W-D-VGSPFGRGRP G RVYIHPF YGGFLRRIRP KLK YGGFM DRVYIHPF QATVGDINTERPGMLDFTGK ELYENKRPRRPYIL DRVYIHPFHL Y-D-AGFL RPKPQQFFGLM -NH PQQFFGLM-NH GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ-NH

14 V VR R(тооцоолол), μl VR(exp.), R μl Зураг. 1. Туршилтаар олдсон болон тооцоолсон пептидийн хадгалалтын хэмжээг харьцуулах. VR утгын тооцоог (1) тэгшитгэлийн дагуу гүйцэтгэсэн. Хүлээн авсан өгөгдлөөс харахад шугаман загвар нь зөвхөн харьцангуй гидрофил пептидийн хувьд хангалттай үр дүнг өгдөг; гидрофобик пептидийн хувьд тооцоолсон утга нь туршилтын хэмжээнээс мэдэгдэхүйц өндөр байна. Зурагт үзүүлсэн муруйг шугаман болгох Шугаман бус "найрлага хадгалах" загвар ажлын ижил төстэй үр дүнг олж авсан. 1 нь тэгшитгэлийг өгдөг: V R = 173 [(n Z i) + V 0 ] 1/3 785 (7) 28 пептидийн тооцоолсон утга ба туршилтаар олдсон хадгалалтын эзэлхүүний харьцуулалтыг Хүснэгт 5 ба Зураг дээр үзүүлэв.

15 V R (тооцоолон), μl VR VR (exp.), μl V R Зураг. 2. Туршилтаар олдсон болон тооцоолсон пептидийн хадгалалтын хэмжээг харьцуулах. VR утгын тооцоог (7) тэгшитгэлийн дагуу гүйцэтгэсэн. 15

16 Хүснэгт 5. Туршилтаар олдсон, тооцоолсон пептидийн хадгалалтын эзэлхүүн (шугаман бус загвар). Пептид V R (үзнэ үү), мкл V R (тооцоол.), мкл 1 GG GGG AS GRGDS TKPR WAGGDASGE GL MY KPVGKKRRPVKVYP W-D-YGGDASGE W-D-AGGDA NCMLDY SYSMEHFRWG W-DGEPFYSPFGRWG W-D-VGSPFGRGRP G RVYIHPF YGGFLRRIRP KLK YGGFM DRVYIHPF QATVGDINTERPGMLDFTGK ELYENKRPRRPYIL DRVYIHPFHL Y-D-AGFL RPKPQQFFGLM -NH PQQFFGLM-NH GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ-NH V R (тооцоолол)=f(v R (exp.)) хамаарлын корреляцийн коэффициент 0.96 байв. Хавсралтад 11 пептидийн холимог загварын туршилтын болон тооцоолсон хроматограммуудыг харуулав. 16

17 4.3. Пептидийн хэт ягаан туяаны спектрийн тооцоо Пептидийн бүтцийн элементүүдийн тусгай спектрийн коэффициентийг ажлаас авсан. Бидний ашигладаг хроматографийн системд спектрийн харьцааг зөв тооцоолоход системийн оргилууд, түүнчлэн гидрофил амин хүчил, богино пептидийн хадгалалт муу байдаг. Тодорхой спектрийн коэффициентүүдийн утгыг Хүснэгт 6-д үзүүлэв. Хүснэгт 6. Хэт ягаан туяаг шингээдэг пептидийн бүтцийн элементүүдийн спектрийн коэффициент C = 1 мм, дээжийн эзэлхүүн нь 4 мкл, ( e.o.p. мкл). λ, nm W F Y H C M R Q N E D N*+C* PS энд S C*+N* пептидийн бүлгүүдийн нийлбэр (-NH+ -) спектрийн коэффициентүүд, S PS пептидийн бондын шингээлт. Пептидийн спектрийн шинж чанарыг тэдгээрийн хроматографийн оргилуудын талбай, C = 1 мМ ба 4 мкл дээжийн эзэлхүүн нь тэгшитгэлийг ашиглан тооцоолсон: a λ пептид = a λ N*+C* + (m-1) a. λ λ PS + a i (9) энд m нь пептид дэх амин хүчлийн үлдэгдлийн нийт тоо, a λ N*+C* нь пептидийн төгсгөлийн бүлгийн нөхцөлт оргил хэсэг, λ PS нь өвөрмөц λ λ долгионы уртад пептидийн бондын шингээлт ба i нь λ долгионы уртын амин хүчлийн үлдэгдлийн спектрийн шинж чанар юм. Тэгшитгэл (9)-д орсон хэмжигдэхүүнүүдийг дараах байдлаар гаргав. λ=210 нм долгионы урттай пептидийн бүтцийн элементүүдийн өвөрмөц спектрийн шинж чанарыг 1 мМ концентрацитай уусмал, дээжийн хэмжээ 4 мкл-ийн хроматографийн оргилуудын талбайгаар тооцоолсон. тэгшитгэлд: a 210 i = a 210 AA a 210 N*+C *, (10) энд 210 AA нь амин хүчлийн оргил хэсэг юм; a 210 N*+C* нь пептидийн терминалын бүлгийн ердийн оргил хэсэг юм. NH 2 бүлгүүд нь nm долгионы урттай цорын ганц лей хромофорууд учраас 210 N*+C*-ийн утгыг 210 Leu-тай тэнцүү гэж авсан. 17

18 Пептидийн бондын тусгай шингээлтийг (a 210 PS) GGG ба GG пептидийн тусгай шингээлтийн зөрүүгээр тооцоолсон: a 210 PS = a GGG a GG (11) λ долгионы уртын спектрийн шинж чанарыг тэгшитгэлийг ашиглан тооцоолсон. : a λ i = a 210 i (S λ /S 210), (12) энд S λ /S 210 нь амин хүчлүүд ба пептидийн GG болон GGG-ийн спектрийн харьцаа бөгөөд эдгээр нь λ долгионы урт дахь оргил хэсгүүдийн харьцаа юм. λ = 210 нм-ийн оргил талбай. Хүснэгт 7-д 28 пептидийн тооцоолсон S λ /S 210 спектрийн харьцааг туршилтаар олж авсан харьцуулалтыг үзүүлэв. Туршилтаар олж авсан болон тооцоолсон пептидийн спектрийн харьцаа нь хоорондоо нэлээд сайн тохирч байна. Ихэнх тохиолдолд ялгаа нь 0.06-аас ихгүй байна. Зарим пептидийн хувьд (5, 9, 12, 16, 18, 22, 23, 26, 27) урьдчилан таамагласан болон туршилтын спектрийн харьцаанд илүү мэдэгдэхүйц ялгаа ажиглагдаж байна. Эдгээр ялгааны шалтгаан нь нэмэлт судалгаа шаарддаг. Хүснэгт 7. Пептидийн спектрийн харьцааны туршилтын болон тооцоолсон утгуудын харьцуулалт. Пептидийн утга Спектрийн харьцаа S λ /S 210 долгионы урт λ(нм): Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp.

19 Пептидийн утга спектрийн харьцаа S λ /S 210 долгионы урт λ(нм): Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Calc Exp Calc Exp.

20 Пептидийн утга Спектрийн харьцаа S λ /S 210 долгионы урт λ(nm): Vt Exp V V Exp Олж авсан өгөгдлөөс харахад градиентийн нөхцөлд мэдэгдэж буй найрлагатай пептидийн хадгалалтын хэмжээ ба тэдгээрийн хэт ягаан туяаны спектрийг тооцоолох аргачлал нь тодорхой байна. RP HPLC нь хангалттай таамаглах чадвартай бөгөөд пептидийн хольцыг салгах судалгаанд хэрэгтэй байж болно. 20

21 5. ДҮГНЭЛТ 1. Тусгаарлагдсан фракцуудыг шууд нэвтрүүлэхэд тохиромжтой дэгдэмхий хөдөлгөөнт фазыг ашиглан Milichrome A-02 хроматограф дээр градиент RP HPLC горимд мэдэгдэж буй найрлагатай пептидийн хадгалалтын хэмжээг урьдчилан таамаглах аргыг боловсруулсан. масс спектрометр. 2. Пептидүүдийг салгахад ашигладаг хөдөлгөөнт фазын 210, 220, 230, 240, 250, 260, 280, 300 нм долгионы урттай пептидийн оптик шингээлтийг шууд тооцоолох аргыг боловсруулсан. 3. Боловсруулсан аргуудыг 28 загварын пептидэд туршсан. Туршилтын харгалзах утгатай тооцоолсон хадгалах эзэлхүүний корреляцийн коэффициент нь 0.96 байв. Тооцоолсон болон туршилтаар олж авсан спектрийн харьцааны зөрүү S λ / S 210 нь 0-ээс ихгүй байсан, Ашигласан материал 1. Резников В.А., Штейнгарц В.Д. Амин хүчлүүд. Новосибирск: NSU, S. Dawson R., Elliott D., Elliott W., Jones K. гарын авлага биохимич. Москва: Мир, х. 3. Овчинников Ю.А. Биорганик хими. Москва: Гэгээрэл, х. 4. Биохими дахь өндөр үзүүлэлттэй шингэн хроматограф (Хеншен А. засварласан). Москва: Мир, х. 5. Дөлгөөн Ж.Л. //Proc. Натл. Акад. Шинжлэх ухаан. АНУ. 1980, V. 77. No3. П Сакамото Ю., Каваками Н., Сасагава Т. // Ж. Хроматогр В. П. Сасагава Т., Окуяама Т., Теллер Д.С. // J. Chromatogr V P Browne C.A., Bennet H.P.J., Solomon S. // Анал. Биохим V.124. P Meek J.L., Rossetti Z.L. // J. Chromatogr V P Azarova I.N., Baram G.I., Goldberg E.L. // Биорганик хими. Хэвлэлд. 11. Хэт ягаан туяа шингээх бодисын массын концентраци. Өндөр хүчин чадалтай шингэн хроматографи ашиглан хэмжилт хийх арга зүй. Эрхүү хот

22 7. Хавсралт 11 пептидийн хольцын туршилтын (А) ба тооцоолсон (Б) хроматограмм. А хүснэгтийн дагуу пептидийн тоо 0.5 e.o.p nm B nm Эзлэхүүн, мкл

ОХУ-ын БОЛОВСРОЛ, ШИНЖЛЭХ УХААНЫ ЯАМ НОВОСИБИРСК УЛСЫН ИХ СУРГУУЛИЙН ХОЛБООНЫ БОЛОВСРОЛЫН АГЕНТЛАГА Байгалийн ухааны факультет тэнхим: Аналитик химийн дипломын ажил

Лекц 1: Уургийн анхдагч бүтэц-амин хүчлүүд 1 Уургийн олон янз байдал Биеийн олон биологийн үйл ажиллагааг уураг гүйцэтгэдэг. Эдгээр функцууд нь хүчилтөрөгчийг тээвэрлэх, хадгалах (гемоглобин

273 УДК 543. 544 ӨНДӨР ГҮЙЦЭТГЭЛТЭЙ ШИНГЭН ХРОМАТОГРАФИЙН АРГААР АМИНЖИЛТГҮЙ β-циклодекстрин дээрх АМИН ХҮЧЛИЙН ҮҮСГЭЛ ЭНАНТИОМЕРИЙГ САЛГАХ НЬ И. А. Ананьева, Е. Н., Шаповал.

1. Уураг ба ферментийн ковалент холбоо. Жишээ хэлнэ үү. ТАСАЛБАР 1 2. Давсны янз бүрийн концентрацитай үед уурагуудыг фракцаар ялгах үндэс нь юу вэ. Энэ арга нь ямар бохирдлыг арилгах вэ?

Сэдэв 23. Аминууд. Амин хүчил ба пептидүүд Сэдвийн агуулга: Аминууд, тэдгээрийн ангилал, нэршил. Бэлтгэх арга, амины химийн шинж чанар. Анилин, түүний электрон бүтэц. Үндсэн шинж чанаруудын хамаарал

Т.П. Вавилова А.Е. Медведев Биологийн хими Амны хөндийн биохими сурах бичиг ОХУ-ын Боловсрол, шинжлэх ухааны яам, Улсын төсвийн боловсролын дээд мэргэжлийн боловсролын байгууллагаас санал болгосон "Москвагийн анхны анагаах ухааны их сургууль"

Москвагийн Физик Технологийн Дээд Сургууль (Улсын Их Сургууль) Молекул биологийн физикийн тэнхим Физик судалгааны аргууд Лекц 9 Шингэн хроматографийн арга, технологи

ОХУ-ын ЭРҮҮЛ МЭНДИЙН ЯАМНЫ ЭМИЙН ЗҮЙН ӨГҮҮЛЭЛ Индапамид FS.2.1.0017.15 Индапамид Индапамид нь FS 42-0303-08 N-[(2RS)-2-Methyldihydro-2-1-1-H-ийг орлоно. 3-сульфамоил-4-хлорбензамид

АМИН ХҮЧЛҮҮД. ПЕПТИД. УУРАГ Амин хүчил нь нүүрсустөрөгчийн радикал дахь нэг буюу хэд хэдэн устөрөгчийн атомыг амин бүлгээр сольсон карбоксилын хүчил юм. Харьцангуй байрлалаас хамаарна

БИОХИМИ Оросын ШУА-ийн корреспондент гишүүн, профессор Е.С. SEVERINA 5-р хэвлэл, шинэчлэгдсэн, өргөтгөсөн сурах бичиг Анагаах ухаан, эм зүйн боловсрол, арга зүйн нийгэмлэгээс санал болгосон.

1 Амин хүчил ба уураг Бүтэц, шинж чанар Спираль нь архитектур, уургийн макромолекулууд, нуклейн хүчлүүд, тэр ч байтугай полисахаридуудад (Loretto hapel, Santa Fe, NM/ Sarbo) олон салбарт байдаг.

ОХУ-ЫН БОЛОВСРОЛ, ШИНЖЛЭХ УХААНЫ ЯАМ "НОВОСИБИРСК ҮНДЭСНИЙ СУДАЛГААНЫ УЛСЫН ИХ СУРГУУЛЬ" ДЭЭД Боловсролын Холбооны Улсын Автономит Боловсролын Байгууллагын Байгалийн ухааны факультет

APP NOTE-16/2016LC Гидролизат дахь амин хүчлийг тодорхойлох жишээг ашиглан бага температурт ууршдаг гэрэл цацах детектор MAESTRO ELSD бүхий MaestroHPLC шингэн хроматографын аналитик чадварууд

8. Асуулт 1. Хроматографийг тодорхойлно уу. 2. Хроматографийн ямар шинж чанарууд нь бусад ялгах аргуудтай харьцуулахад ижил төстэй шинж чанартай бодисыг илүү сайн ялгах боломжийг олгодог. 3. Жагсаалт

ОХУ-ын БОЛОВСРОЛ, ШИНЖЛЭХ УХААНЫ ЯАМ "Р.Е. НОВГОРОД УЛСЫН ТЕХНИКИЙН ИХ СУРГУУЛЬ" ДЭЭД МЭРГЭЖЛИЙН БОЛОВСРОЛЫН СУРГАЛТЫН БАЙГУУЛЛАГА.

1 Амин хүчлүүдийн бүтэц, урвал, нийлэгжилтийн аргуудын онцлог. Уураг Хүчиллэг функциональ бүлэг болон амин бүлгийг хоёуланг нь агуулсан нэгдэл нь амин хүчил юм. Хүчил-суурь

Био эмийн шинжилгээнд зориулсан Agilent AdvanceBio SEC Хэмжээ хассан хроматографийн баганаас ашиг хүртээрэй Өгөгдлийн чанарыг сайжруулахын тулд олон үйлдвэрлэгчдийн баганыг харьцуулж үзээрэй.

"Үйлдвэрийн лаборатори. Материалын оношлогоо" 4. 2007. 73-р боть 23 УДК 543.544 АМПЕРОМЕТРИЙН ИЛРҮҮЛЭГЧТЭЙ ХЭРЭГЛЭГЧИЙН УРВУУ ФАЗЫН HPLC-ээр эмэнд агуулагдах АМИН ХҮЧЛИЙГ ТОДОРХОЙЛОХ М. Г.

UDC 615.22.074: 543.544.5.068.7.062 0.02 г шахмал дахь триметазидин дигидрохлоридын тоон тодорхойлох АРГА ХЭМЖЭЭНИЙ БАТАЛГАА.

ОРЧИН ҮЕИЙН БЭЛТГЭЛИЙН ФЛАШ ХРОМАТОГРАФИ 2-р хэсэг* А.Аболин, Ph.D, "Галахим" [имэйлээр хамгаалагдсан]П.-Ф. Icarus, Interchim (Франц) Бид бэлтгэлийн орчин үеийн аргуудын талаархи материалыг үргэлжлүүлэн хэвлүүлсээр байна

Хэмжих хэрэгслийн төрлийг батлах тухай гэрчилгээний 44071 хуудас 1-ийн хавсралт ХЭМЖЭЭНИЙ ТӨРӨЛИЙН ТОДОРХОЙЛОЛТ “Миликром А-02”, “Альфахром А-02” (“Альфахром А-02”) өндөр хүчин чадалтай шингэн хроматограф.

ОРОСЫН УЛСЫН СТАНДАРТ ЗҮҮН СИБИРИЙН ФИЗИК-ТЕХНИК, РАДИО-ТЕХНИКИЙН ХЭМЖЭЭНИЙ ЭРДЭМ ШИНЖИЛГЭЭНИЙ ХҮРЭЭЛЭН ГЭРЧИЛГЭЭ МВИ 02-2002 Массын концентрацийн хэмжилт хийх аргачлал

1-Р БҮЛЭГ АМИНО ХҮЧЛИЙН ДАГАЛАЛЫН ХУВЬСЛЫН ЗАЙ, ХУВЬСЛЫН ХУВЫГ ТОДОРХОЙЛОХ 1.1. ОНОЛЫН ҮНДЭСЛЭЛ Амин хүчлийн дарааллын хоорондох хувьслын зай (p, d) дундаж

01/2016:20255 2.2.55. ПЕПТИДИЙН ЗУРАГЛАЛ Пептидийн зураглал нь уураг, ялангуяа рекомбинант ДНХ-ээр үүсгэгдсэн уураг тодорхойлох арга юм. Арга нь химийн эсвэл ферментийн аргыг агуулдаг

ОХУ-ын Боловсрол, шинжлэх ухааны яам ХОЛБООНЫ УЛСЫН ТӨСВИЙН ТӨСВИЙН ДЭЭД БОЛОВСРОЛЫН СУРГАЛТЫН БАЙГУУЛЛАГА “САРАТОВЫН ҮНДЭСНИЙ СУДАЛГААНЫ УЛСЫН ИХ СУРГУУЛЬ”

Уургийн конформаци: үүсэх зарчим 1. Уургийн молекулын конформацийг тодорхойлох холбоо ковалент холбоо: пептидийн дисульфид ковалент бус харилцан үйлчлэл: ионы харилцан үйлчлэл устөрөгчийн холбоо.

ХОЛБООНЫ БОЛОВСРОЛЫН ГАЗАР Улсын дээд мэргэжлийн боловсролын сургалтын байгууллага “Уралын улсын их сургууль. А.М. Горький" IONC "Экологи ба байгаль менежмент"

ОРОСЫН ХОЛБООНЫ ЭРҮҮЛ МЭНДИЙН ЯАМ ЭМИЙН ЗҮЙН ӨГҮҮЛЭЛ Кеторолак трометамол FS.2.1.0022.15 Кеторолак трометамол Кеторолакум трометамол GF XII, 1-р хэсэг, FS 42-2RS-1-г орлоно (FS 42-2520) -1Ц- пирролизин-1 - карбоксилат

Москвагийн Физик технологийн дээд сургууль (Улсын их сургууль) Молекул биологийн физикийн тэнхим Физик судалгааны аргууд Лекц 8 Хроматографийн илрүүлэгч Шингэн хроматограф

ОРОСЫН ХОЛБООНЫ ЭРҮҮЛ МЭНДИЙН ЯАМ ЭМИЙН ЗҮЙН ЗҮЙЛ Мелоксикам FS.2.1.0025.15 Мелоксикам Мелоксикам GF XII, 1-р хэсэг, FS 42-0254-07-ийн оронд 4-Гидрокситил-1-метил-2( -2-ил)-1,1-диоксо-1λ

БЕЛОРУС УЛСЫН ҮНДЭСНИЙ ШИНЖЛЭХ УХААНЫН АКАДЕМИ "БЭЛОРУС УЛСЫН ҮНДЭСНИЙ ШИНЖЛЭХ УХААНЫ АКАДЕМИЙН ХҮНСНИЙ ЭРДЭМ ШИНЖИЛГЭЭНИЙ ПРАКТИКИЙН ТӨВ" ХҮНСНИЙ ҮЙЛДВЭР ДАХЬ ШИНЭЧИЛГЭЭНИЙ ТЕХНОЛОГИЙН XI Олон улсын практикийн материалууд

АЖЛЫН ЕРӨНХИЙ ОНЦЛОГ Ажлын хамаарал Өнөө үед нийлмэл органик бодисын агуулгыг тодорхойлох, тодорхойлоход өндөр үзүүлэлттэй шингэн хроматографийн (HPLC) аргыг өргөн ашиглаж байна.

Аналитик аргуудын баталгаажуулалт: практик хэрэглээ. Писарев В.В., доктор, MBA, Холбооны улсын нэгдсэн аж ахуйн нэгжийн "Антибиотикийн улсын шинжлэх ухааны төв"-ийн ерөнхий захирал, Москва (www.pisarev.ru) Танилцуулга

2.2.29. ӨНДӨР ГҮЙЦЭТГЭЛТЭЙ ШИНГЭН ХРОМАТОГРАФИ Өндөр хүчин чадалтай шингэн хроматографи (HPLC) нь хоорондоо холилдохгүй хоёр бодисын хоорондох бодисыг ялгах хуваарилалтад суурилсан ялгах арга юм.

ОРОС УЛСЫН СУДАЛГААНЫ БОЛОВСРОЛ, ШИНЖЛЭХ УХААНЫ ЯАМ ТОМСК УЛСЫН ИХ СУРГУУЛИЙН ХИМИЙН ФАКУЛЬТ Тус хичээлийн тэмдэглэлтэй ажлын хөтөлбөр Шинжилгээний хроматографийн арга Сургалтын чиглэл

Agilent Bond Elut Plexa бүтээгдэхүүнийг ионы дарангуйллыг бууруулж, шингэний хроматографи-масс спектрометрийн (LC-MS) мэдрэмжийн удирдамжийг сайжруулахын тулд ашиглах нь Эмийн бүтээгдэхүүн

ОХУ-ын ЭРҮҮЛ МЭНДИЙН ЯАМ ЭМИЙН ХЭРЭГЛЭЛИЙН ӨГҮҮЛЭЛ Карбамазепин FS.2.1.0020.15 Карбамазепин нь FS 42-2803-96-г орлоно; GF XII, 1-р хэсэг, FS 42-0240-07 5H-Dibenzazepine-5-carboxamide-ийн оронд карбамазепин

Лекц 22 Амин хүчлүүд. Хэрэм Ажил бол амьдралаас таашаал авах хамгийн сайн арга юм. I. Кант Амин хүчлийн нэршил. Байгалийн амин хүчил. Уураг үүсгэдэг амин хүчлүүдийн чираль байдал. Хүчил шүлтийн шинж чанар,

APP NOTE-10/2016LC Тодорхойлох жишээг ашиглан диодын массив илрүүлэгч ба тогтмол долгионы урттай фотометрийн детектор (LED) бүхий MaestroHPLC шингэн хроматографын аналитик боломжууд

Химийн лекц 3 α-амин хүчил, пептид, уураг. Лекцийг проф. Белавин Иван Юрьевич 2. α-амин хүчил, пептид, уураг α-амин хүчил уураг био зохицуулагч энергийн эх үүсвэр α-амин хүчлүүд гетерофункциональ.

Лабораторийн ажил 11. ҮНДСЭН МОЛЕКУЛ ГЕНЕТИК ПРОЦЕССИЙН МЕХАНИЗМ Хичээлийн зорилго: ДНХ ба РНХ-ийн найрлага, репликаци, транскрипц, орчуулгын үйл явцтай танилцах.

APP NOTE-34/2018LC Коньяк дахь фенол ба фураны нэгдлүүдийн агуулгыг тодорхойлох жишээн дээр диодын массив илрүүлэгч бүхий Maestro HPLC шингэн хроматографын аналитик чадвар.

Agilent 129 Infinity II HDR-DAD хольцын анализаторын уусмалыг ашиглан тогтмол тунтай хосолсон эмийг хольцын эсэхийг шалгана.

APP NOTE-18/2017LC Цусны сийвэн дэх катехоламиныг тодорхойлох жишээг ашиглан амперометрийн детектор бүхий MaestroHPLC шингэн хроматографын аналитик чадвар Яшин А.Я. Sc., тэргүүлэх инженер

ГОСТ R 51435-99 Алимны шүүс, өтгөрүүлсэн алимны шүүс, алимны шүүс агуулсан ундаа. Өндөр хүчин чадалтай шингэн хроматографи ашиглан патулины агууламжийг тодорхойлох арга. OKS 67.160.20

Уралдаанд Михаил Вадимович Шашковын “Хялгасан судасны хийн хроматографийн ионы шингэнд суурилсан өндөр туйлт хөдөлгөөнгүй шингэний фазын судалгаа” диссертацийн талаарх АЛБАН ЁСНЫ ЭСРЭГЧИЙН ТОЙМ.

ПЕПТИД, байгалийн эсвэл синтетик. Нэгдлүүд, тэдгээрийн молекулууд нь C(O) NH пептид (амид) бондоор холбогдсон а-амин хүчлийн үлдэгдэлээс бүрддэг. Мөн молекул нь амин хүчлийн бус бүрэлдэхүүн хэсэг (жишээлбэл, нүүрс усны үлдэгдэл) агуулж болно. Пептидийн молекулд агуулагдах амин хүчлийн үлдэгдлийн тоонд үндэслэн ди-пептид, трипептид, тетрапептид гэх мэтийг ялгадаг. 10 хүртэлх амин хүчлийн үлдэгдэл агуулсан пептидүүдийг нэрлэдэг. 10-аас дээш амин хүчлийн үлдэгдэл агуулсан олигопептидүүд полипептидүүд При полипептидүүд нь моль. м.6 мянга гаруй нэр. уураг

Түүхийн лавлагаа.Пептидийг анх удаа ферментийн уургийн гидролизатаас тусгаарласан. "Пептид" гэсэн нэр томъёог Э.Фишер санал болгосон. Анхны нийлэг пептидийг 1881 онд Т.Куртиус гаргаж авсан ба Э.Фишер 1905 он гэхэд пептидийн нийлэгжилтийн анхны ерөнхий аргыг боловсруулж, олон тооны олигопептидүүдийг нэгтгэсэн. барилгууд. Амьтад Э.Фишерийн шавь Э.Абдергалден, Г.Лейке, М.Бергман нар пептидийн химийн хөгжилд хувь нэмрээ оруулсан. 1932 онд М.Бергман, Л.Зервас нар амин хүчлүүдийн а-амин бүлгүүдийг хамгаалахын тулд пептидийн нийлэгжилтэнд бензилоксикарбонилийн бүлэг (карбобензокси бүлэг) ашигласан нь пептидийн нийлэгжилтийн хөгжлийн шинэ үе шатыг харуулсан. Үүссэн N-хамгаалагдсан амин хүчлүүд (N-карбобензоксиамино хүчил) нь янз бүрийн пептидүүдийг олж авахад өргөн хэрэглэгддэг бөгөөд эдгээр B-B-ийн хими, биохимийн хэд хэдэн гол асуудлуудыг судлахад амжилттай ашигласан, жишээлбэл, субстратын өвөрмөц байдлыг судлахад ашигласан. протеолитик. ферментүүд. Байгалийн пептидүүдийг (глутатион, карнозин гэх мэт) анх N-карбобензоксиамино хүчлийг ашиглан нийлэгжүүлсэн. Энэ чиглэлээр нэгэн чухал ололт эхнээсээ бий болсон. 50-аад он П.Воган нар холимог ангидридын аргыг ашиглан пептидийн нийлэгжилт (пептидийн нийлэгжилтийн аргуудыг доор дэлгэрэнгүй авч үзнэ). 1953 онд V. Du Vigneult анхны пептидийн даавар болох окситоциныг нэгтгэсэн. 1963 онд П.Меррифилдийн боловсруулсан хатуу фазын пептидийн синтезийн үзэл баримтлалд үндэслэн автоматыг бий болгосон. пептидийн синтезаторууд. Пептидийн хяналттай ферментийн синтезийн аргууд эрчимтэй хөгжиж байна. Шинэ аргыг хэрэглэснээр инсулин гэх мэт гормоныг нэгтгэх боломжтой болсон.

Синтетикийн амжилт Пептидийн химийг ион солилцооны хроматографи, задралын электрофорез гэх мэт пептидийг ялгах, цэвэршүүлэх, шинжлэх аргуудыг хөгжүүлэх дэвшлийн үр дүнд бэлтгэсэн. хэвлэл мэдээллийн хэрэгсэл, гель шүүлтүүр, өндөр үзүүлэлттэй шингэн хроматографи (HPLC), иммунохимийн . шинжилгээ гэх мэт. Төгсгөлийн бүлгүүдийг шинжлэх арга, пептидийг үе шаттайгаар задлах аргууд ч маш их хөгжсөн. Ялангуяа автомат системийг бий болгосон. амин хүчлийн анализатор ба автомат пептидийн анхдагч бүтцийг тодорхойлох төхөөрөмж - гэж нэрлэгддэг. дараалалчид.

Пептидийн нэршил.Чөлөөт зөөгч пептидийн амин хүчлийн үлдэгдэл. a-амин бүлэг, гэж нэрлэдэг N-терминал бөгөөд тээвэрлэгч үнэгүй. a-карбоксил бүлэг - С-терминал. Пептидийн нэрний зурагнэрнээс гаралтай. түүний найрлагад орсон амин хүчлийн үлдэгдлийг N-терминалаас эхлэн дарааллаар жагсаав. Энэ тохиолдолд өчүүхэн нэрсийг ашигладаг. "in" төгсгөлийг "sil" -ээр сольсон амин хүчлүүд; С-терминалын үлдэгдлийг хасах, гэж нэрлэдэг Энэ нь нэртэй давхцаж байна. холбогдох амин хүчил. Пептидэд орсон бүх амин хүчлийн үлдэгдлийг N төгсгөлөөс эхлэн дугаарлана. Пептидийн анхдагч бүтцийг (амин хүчлийн дараалал) бүртгэхийн тулд амин хүчлийн үлдэгдлийн гурван үсэг, нэг үсэг бүхий тэмдэглэгээг өргөн ашигладаг (жишээлбэл, Ala Ser -Asp Phe -GIy аланил-серил-аспарагил-фенилаланил-глицин).

Бүтэц.Пептидийн холбоо нь хэсэгчилсэн давхар бондын шинж чанартай байдаг. Энэ нь энгийн C N бондын урттай (0.147 нм) харьцуулахад энэ холболтын урт (0.132 нм) багассанаар илэрдэг. Пептидийн бондын хэсэгчлэн давхар холбогдсон шинж чанар нь үүнийг чөлөөтэй хийх боломжгүй болгодог түүний эргэн тойронд орлуулагчдын эргэлт. тиймээс пептидийн бүлэг нь хавтгай бөгөөд ихэвчлэн транс тохиргоотой байдаг (f-la I). Тиймээс, пептидийн гинжин хэлхээний нуруу нь тэгш бус хэсгүүд байрладаг газарт хөдлөх ("нугас") холбоос бүхий хэд хэдэн хатуу хавтгай юм. С атомууд (I үе шатанд одоор тэмдэглэгдсэн).

Пептидийн уусмалд тодорхой конформеруудын давуу тал ажиглагдаж байна. Гинжийг уртасгах тусам хоёрдогч бүтцийн эмх цэгцтэй элементүүд (а-геликс ба b-бүтэц) илүү тод тогтвортой байдлыг (уурагтай төстэй) олж авдаг. Хоёрдогч бүтэц үүсэх нь ердийн пептид, ялангуяа полиамин хүчлүүдийн онцлог шинж юм.

Үл хөдлөх хөрөнгө. Олигопептидүүд нь амин хүчлүүдтэй төстэй шинж чанартай байдаг бол полипептидүүд нь уурагтай төстэй байдаг. Олигопептид нь ихэвчлэн талст хэлбэртэй байдаг. халах үед задрах бодисууд. 200 300 0 С хүртэл Тэд сайн уусдаг. усанд, дил. то-тах ба шүлтүүд бараг байхгүй. org-д. r-жижиглэн худалдаачид. Үл хамаарах зүйл: гидрофобик амин хүчлийн үлдэгдэлээс үүссэн олигопептидүүд.

Олигопептид нь амфотер шинж чанартай бөгөөд хүрээлэн буй орчны хүчиллэг байдлаас хамааран катион, анион, цвиттерион хэлбэрээр оршдог. Үндсэн NH бүлгийн IR спектр дэх шингээлтийн зурвас нь 3300 ба 3080 см -1, C=O бүлгийн хувьд 1660 см -1 байна. Хэт ягаан туяаны спектрт пептидийн бүлгийн шингээлтийн зурвас нь 180-230 нм-ийн бүсэд байдаг. Изоэлектрик Пептидийн цэг (pI) нь маш олон янз байдаг бөгөөд молекул дахь амин хүчлийн үлдэгдлийн найрлагаас хамаардаг. Пептидийн pK a утгууд ойролцоогоор байна. 3, -N H 2 хувьд ойролцоогоор. 8.

Хими. Олигопептидуудын шинж чанарыг тэдгээрийн агуулагдах функцээр тодорхойлдог. бүлгүүд, түүнчлэн пептидийн бондын онцлог. Тэдний хими. хэрэгсэл болгон хувиргах. наад зах нь холбогдох амин хүчлийн харьцаатай төстэй байна. Тэд надад өгдөг. биуретийн урвал ба нинидриний урвал. Дипептидүүд ба тэдгээрийн деривативууд (ялангуяа эфир) нь дикетопиперазин үүсгэхийн тулд амархан циклд ордог. 5.7 н нөлөөгөөр.

давсны хүчлийн пептидүүд нь 105 0 С-т 24 цагийн дотор амин хүчлүүд болж гидролиз болдог.

Синтез.Хими. Пептидийн нийлэгжилт нь нэг амин хүчлийн COOH бүлэг ба өөр нэг амин хүчил эсвэл пептидийн NH 2-ийн хооронд пептидийн холбоо үүсгэх явдал юм. Үүний дагуу пептидийн синтезийн үйл явцын карбоксил ба амины бүрэлдэхүүн хэсгүүдийг ялгадаг. Зорилтот, хяналттай пептидийн нийлэгжилтийг хийхийн тулд урьдчилан хийх шаардлагатай. бүх (эсвэл зарим) функцийг түр хугацаагаар хамгаалах. пептидийн холбоо үүсэхэд оролцдоггүй бүлгүүд, мөн түүнчлэн урьдчилсан байдлаар. пептидийн синтезийн бүрэлдэхүүн хэсгүүдийн аль нэгийг идэвхжүүлэх. Синтез дууссаны дараа хамгаалалтын бүлгүүдийг арилгана. Биологийн идэвхит пептидүүдийг олж авахдаа пептидийн нийлэгжилтийн бүх үе шатанд амин хүчлүүдийн рацемизациас урьдчилан сэргийлэх зайлшгүй нөхцөл юм.

Наиб. Идэвхжүүлэх r-дахин аргуудаар r-ионыг явуулахдаа пептидийн холбоо үүсгэх чухал аргууд. эфир, карбодиимид, холимог ангидрид ба азидын арга.

Идэвхжүүлсэн эфирийн арга нь урьдчилан Хүчтэй электрон татагч орлуулагч агуулсан спиртийн үлдэгдлийг түүнд оруулах замаар карбоксилын бүрэлдэхүүн хэсгийн эфир дериватив үүсэх. Үүний үр дүнд пептидийн нийлэгжилтийн амин бүрэлдэхүүн хэсгийн нөлөөн дор аминолизэд амархан өртдөг өндөр идэвхтэй эфир үүсдэг. Идэвхжүүлэгчийн хувьд пептид, пента-фтор-, пентахлор-, трихлоро- ба n-нитрофенил болон хамгаалагдсан амин хүчил, пептидийн бусад олон эфирийн нийлэгжилтэнд эфирийг өргөн ашигладаг.

Пептидийн холбоо үүсгэх карбодиимидын арга нь задралыг ашиглах явдал юм. орлуулсан карбодиимидүүд. Дициклогексил-карбодиимид нь пептидийн нийлэгжилтэнд ялангуяа өргөн хэрэглэгддэг.

X ба Y-хариу. N- ба С-хамгаалалтын бүлгүүд Энэхүү конденсатор урвалжийн тусламжтайгаар завсрын үүссэн O-ацил изоуреа (II)-ийн гидролиз ба аминолизийн хурд ихээхэн ялгаатай тул усан орчинд пептидүүдийг нэгтгэх боломжтой. Пептидийн нийлэгжилтэнд янз бүрийн нэгдлүүдийг бас ашигладаг. усанд уусдаг карбодиимидүүд (жишээлбэл, N-диметиламинопропил-N"-этилкарбодиимид).

Холимог ангидридын арга нь урьдчилсан боловсруулалтанд суурилдаг. карбоксил эсвэл иноргтой холимог ангидрид үүсгэх замаар пептидийн нийлэгжилтийн карбоксилын бүрэлдэхүүн хэсгийг идэвхжүүлэх. ДЭМБ. Наиб. хлороформик (нүүрстөрөгчийн хлорид) нэгдлүүдийн алкил эфирийг ихэвчлэн ашигладаг, ялангуяа этил ба изобутил эфир, жишээлбэл:

B - гуравдагч амин

Энэ аргыг ашиглан пептидүүдийг нийлэгжүүлэхэд N-ацил амин хүчлүүд ба пивалик (триметил цууны) хүчлүүдийн холимог ангидридууд маш үр дүнтэй байдаг. Хүчтэй тавьсанд баярлалаа. Терт-бутил бүлгийн индуктив нөлөөгөөр пивалины хүчлийн үлдэгдэл дэх карбоксил атом С-ийн электрофилик чанар мэдэгдэхүйц буурч, энэ нь стерикийн хамт. саад тотгорыг арилгах, хүсээгүй зүйлийг дарах uretan болон чөлөөт барьцаа үүсэх. N-ациламин хүчил, ирмэгийг дараахь схемийн дагуу гүйцэтгэнэ.

Холимог ангидридын аргын нэг хувилбарт 1-этоксикарбонил-2-этокси-1,2-дигидрохинолиныг конденсатор болгон ашигладаг. Энэ бол холболт юм. пептидийн нийлэгжилтийн карбоксил бүрэлдэхүүнтэй завсрын бүтээгдэхүүнийг амархан үүсгэдэг. холимог ангидрид нь конденсацийн уусмал руу хурдан ордог бөгөөд шаардлагагүй бодисууд бүрэн арилдаг. хажуугийн хуваарилалт.

Холимог ангидридын аргын онцгой тохиолдол бол тэгш хэмийн арга юм. ангидридууд, үүнд амин хүчлийн ангидрид 2 O ашиглагддаг.Тэдгээрийг ашиглах нь пропорциональ бус байдал эсвэл зохисгүй аминолиз үүсэх боломжийг арилгадаг.

Азидын синтезийн арга нь карбоксилын бүрэлдэхүүн хэсгийг N-орлуулсан амин хүчил эсвэл пептидийн азид болгон хувиргах замаар идэвхжүүлдэг.

Азидын тогтворгүй байдлаас шалтгаалан тэдгээр нь чөлөөтэй байдаг. уусмалаас хэлбэр нь дүрмээр бол тусгаарлагддаггүй. Хэрэв шүлтлэг металлын нитритүүдийн оронд азотын нэгдлүүдийн алкил эфирийг (жишээлбэл, терт-бутил нитрит) гидразидтай уусмалд ашигладаг бол азидын конденсацийг org-д хийж болно. r-ritele; үүссэн HN 3 нь гуравдагч аминуудтай холбогддог. Азидын конденсаци нь ихэвчлэн хүсээгүй хүндрэлээс болж хүндрэлтэй байдаг. гаж урвал (гидразидыг азид биш, харин амид болгон хувиргах; уусмал1,2-диацил-гидразин үүсэхэд хүргэдэг азидтай гидразид; завсарлагатай Куртиусын дахин зохион байгуулалтын үр дүнд мочевины дериватив эсвэл харгалзах уретан үүсэх гэх мэт изоцианат үүсэх). Азидын аргын давуу тал нь рацемизаци багатай, гидроксил бүлгийг хамгаалахгүйгээр серин ба треониныг ашиглах боломж юм.

Хувиргах хамгаалагдсан пептидүүдийг тусгай ашиглан чөлөөт пептид болгон хувиргадаг задралаас салахыг баталгаажуулах шийдэлд үндэслэсэн түгжээг арилгах аргууд. молекул дахь бүх пептидийн холбоог хадгалах баталгаатай хамгаалалтын бүлгүүд. Блоклох жишээ: катализаторын бензил оксикарбонил бүлгийг зайлуулах. атм дахь гидрогенолиз. даралт ба өрөөний температур, терт-бутилоксикарбонил бүлгийг бага зэргийн ацидолизоор арилгах, түүнчлэн гидролиз. шингэрүүлсэн бодисын нөлөөн дор trifloroacetyl бүлгийн задрал. суурийн шийдлүүд.

Биологийн идэвхит пептидүүдийг нийлэгжүүлэхдээ рацемизаци үүсэхгүй байх нь чухал бөгөөд N-ацилийн амин хүчил эсвэл пептидийн a-атом С-аас H + -ийг урвуу арилгасны үр дүнд ирмэгүүд үүсч болно. Racemization нь суурь ба нэгдлүүд, өндөр температур, туйлын нэгдлүүдээр дэмжигддэг. шийдвэрлэх үүрэг гэж нэрлэгддэг дамжуулан тохиолдож болно суурь нь катализатор, racemization тоглож байна. азлактон механизм эсвэл энолизаци хийх замаар дараах схемийн дагуу:

Наиб. Рационализмаас зайлсхийх чухал арга замууд: 1) пептидийн гинжийг C төгсгөлөөс N төгсгөл хүртэл сунгах.ROC(O) зэрэг N-хамгаалалтын бүлгүүдийг ашиглан. 2) C-терминал пролин эсвэл гликиний үлдэгдэл бүхий N-хамгаалагдсан пептидийн хэсгүүдийг идэвхжүүлэх. 3) Азидын аргыг ашиглах (илүүдэл гуравдагч суурь байхгүй, урвалын орчинд бага температурыг хадгалах). 4) Аппликешн идэвхжсэн. амин хүчлийн эфир, аминолиз нь шилжилтийн төлөвөөр явагддаг, тогтворжуулагч. устөрөгчийн гүүр (жишээлбэл, N-гидроксипиперидин ба 8-гидроксихинолиноор үүссэн эфир). 5) N-гидрокси нийлмэл нэмэлтүүдтэй карбодиимидын аргыг ашиглах. эсвэл Льюисийн оффис.

Уусмал дахь пептидийн нийлэгжилтийн зэрэгцээ уусдаггүй тээвэрлэгчийг ашиглан пептидийн нийлэгжилт нь чухал юм. Үүнд хатуу фазын пептидийн синтез (Мэрифилд арга буюу арга) болон полимер урвалж ашиглан пептидийн синтез орно.

Хатуу фазын пептидийн синтезийн стратеги нь уусдаггүй полимер зөөгч дээр нийлэгжсэн пептидийн гинжийг түр зуур бэхлэхийг хамардаг бөгөөд дараахь схемийн дагуу явагдана.

Энэ аргын ачаар завсрын бүтээгдэхүүнийг салгах, цэвэршүүлэх маш нарийн төвөгтэй, хөдөлмөр их шаарддаг процедурыг солих боломжтой болсон. энгийн угаах, шүүх үйлдлээр пептидийг, түүнчлэн пептидийн нийлэгжилтийн процессыг хялбархан автоматжуулж болох үе үе давтагдах процедурын стандарт дараалал болгон бууруулна. Меррифилийн арга нь пептидийн синтезийн процессыг ихээхэн хурдасгах боломжийг олгосон. Энэхүү арга зүйд үндэслэн төрөл бүрийн төрөл автомат пептидийн синтезаторууд.

Холболт нь өндөр бүтээмжтэй байдаг. Бэлтгэл HPLC-ийн ялгах чадвартай пептидийн хатуу фазын синтез нь химийн чанарын шинэ түвшинд хүрэх боломжийг олгодог. пептидийн синтез, энэ нь эргээд төрөл бүрийн хөгжилд сайнаар нөлөөлдөг. биохимийн салбарууд гэж тэд хэлэв. биологи, генийн инженерчлэл, биотехнологи, фармакологи, анагаах ухаан.

Полимер урвалж ашиглан пептидийн синтезийн стратеги нь өндөр молекул жинтэй түр зуурын холболтыг агуулдаг. тээвэрлэгчийг идэвхжүүлсэн карбоксилын бүрэлдэхүүн хэсэг буюу пептидийн синтезийн конденсатор. Энэ аргын давуу тал нь полимерт хавсаргасан урвалжуудыг илүүдэл хэмжээгээр нэвтрүүлэх боломжтой бөгөөд уусдаггүй полимерээс нийлэгжсэн пептидүүдийг салгахад хэцүү биш юм.

Ийм нийлэгжилтийн жишээ нь амин бүрэлдэхүүн хэсгийг өгөгдсөн дарааллаар хэд хэдэн дундуур дамжуулдаг. багана, тус бүр нь полимерээр холбогддог

Дүгнэлт

Энэхүү тойм нь пептидийн бүтэцтэй шинэ анхны эм үүсгэх үед фармакокинетик ба био хүртээмжийг судлахад чиглэгддэг. Биоматериал дахь пептидийн нэгдлүүдийг тоон тодорхойлох арга, тэдгээрийн фармакокинетик шинж чанарыг судлах, эдгээр бодисын биологийн хүртээмжид нөлөөлж буй хүчин зүйлсийг судлах, эмнэлгийн практикт нэвтрүүлсэн пептидийн бүтэцтэй эмийн зарим фармакокинетик мэдээллийг өгөхөд ихээхэн анхаарал хандуулдаг.

Түлхүүр үгс: фармакокинетик, богино пептид, био хүртээмж, туслах бодис

Оршил

Түгшүүрийн эмгэг нь ерөнхий байнгын түгшүүр, эмгэг айдас, хурцадмал байдал, мэдрэлийн мэдрэмжээр тодорхойлогддог сэтгэцийн эмгэг юм. Одоогийн байдлаар түгшүүрийн эмгэгтэй холбоотой өвчний тархалт барууны орнуудад 13.6-28.8% хооронд хэлбэлзэж байгаа бөгөөд амьдралын өндөр хэмнэл, хүрээлэн буй орчин, нийгмийн хурцадмал байдлаас шалтгаалан байнга нэмэгдэж байна.

Сэтгэлийн түгшүүр, сэтгэл гутралын эмгэгтэй холбоотой өвчлөл ихээхэн нэмэгдэж байгаа тул шинэ анксиолитик эм боловсруулж, хэрэгжүүлэх нь чухал юм. Өнөөдөр ийм фармакологийн нөлөө бүхий эмүүдийг ихэвчлэн ядаргаа, нойрмоглох, санах ойн сулрал, сэтгэцийн болон бие махбодийн мансууруулах бодисын хамаарал, өвчтөний амьдралын чанарыг бууруулдаг татан буулгах синдром зэргээр тодорхойлогддог бензодиазепины нэгдлүүдийн бүлэгт багтдаг. Эдгээр гаж нөлөөгүй ийм нэг анксиолитик нь афобазол эм юм. Дээр дурдсан зүйлс нь бензодиазепиний сөрөг нөлөөгүй бусад өндөр үр дүнтэй эмийг хайх хэрэгцээг баталж байна. Шинжлэх ухаан нь эндоген пептидүүдэд ихээхэн анхаарал хандуулдаг. Өнөөдрийг хүртэл түгшүүрийн эмгэгийн эмгэг жам дахь холецистокинин нь эндоген нейропептид чухал үүрэг гүйцэтгэдэг болохыг тогтоожээ. Төв мэдрэлийн системд байрлах CCK-B рецепторуудад үйлчилдэг холецистокинин нь түгшүүр төрүүлэх үйл ажиллагаа явуулдаг - сандрах довтолгоог өдөөдөг, опиатын системтэй харьцдаг тул өвдөлт намдаах нөлөөтэй байдаг. Түүнчлэн холецистокинин нь сэтгэлийн хямрал, шизофрени өвчний эмгэг жамын үүрэг гүйцэтгэдэг байж магадгүй юм.

Эндоген нейропептидүүд нь ферментийн тогтвортой байдал багатай, ходоод гэдэсний замд гидролизд ордог, BBB-ээр нэвтэрсний дараа л идэвхтэй байдаг тул илүү авсаархан, хамгаалагдсан бүтэцтэй болзошгүй анксиолитикийг (холецистокинин рецепторын антагонистууд) хайх шаардлагатай болсон. системчилсэн байдлаар хэрэглэвэл үр дүнтэй.

Gudasheva T.A-ийн боловсруулсан таамаглал дээр үндэслэн. 1985 онд тодорхой нейротроп идэвхжилтэй пептидийн бус прототипийн бүтцийг загварчлах боломжийн талаар, мөн ижил төстэй үйл ажиллагаатай анхны пептидийн идэвхтэй хэсэг болох шинэ дипептидийн анксиолитик GB-115 (N-фенил-N) -hexanoyl-L-glycyl-L amide) нь нийлэгжсэн -триптофан) нь холецистокинин-4-ийн ретроаналог юм. Нэгдлийн фармакологийн идэвхжил тогтоогдсон: GB-115 нь анксиолитик, архины эсрэг, антидепрессант, өвдөлт намдаах шинж чанартай болохыг туршилтаар нотолсон. ГБ-115-ийг амаар хэрэглэхэд 0.1 мг/кг тунгаар хамгийн их анксиолитик үйл ажиллагааг харуулсан. Уг эм нь этилийн спиртийг 0.2 мг/кг тунгаар татан буулгаснаар үүссэн түгшүүр төрүүлэх урвалыг зогсооно, p.o. Өвдөлт намдаах хамгийн их үйл ажиллагаа нь 10 мг / кг тунгаар илэрдэг ба антидепрессант нөлөө нь 0.025-0.05 мг / кг, i.p.

Эмийн фармакокинетикийн туршилтын судалгаа хийх нь түүнийг цаашид эмнэлгийн практикт нэвтрүүлэхэд зайлшгүй шаардлагатай алхам юм. Фармакокинетик үзүүлэлтүүдийг сайжруулах нь шимэгдэлтийн зохих түвшин, хурд, тархалтын шинж чанар, бодисын солилцоо, ялгарах замаар ялгагдах оновчтой тунгийн хэлбэрийг бий болгох боломжийг олгодог. Харьцангуй биологийн хүртээмжийн үнэлгээ нь судалж буй нэгдлийн хамгийн сайн фармакокинетик үзүүлэлт бүхий тунгийн хэлбэрийг сонгох боломжийг олгодог.

Фармакокинетик нь эмийн биед нэвтрэн орох, тархалт, биотрансформаци, ялгаралтын шинж чанарыг судалдаг орчин үеийн, хурдацтай хөгжиж буй шинжлэх ухаан юм. Эдгээр үйл явцыг судлах, түүний дотор тэдгээрийн тоон үнэлгээ нь фармакокинетикийн гол зорилго юм.

Туршилтын шинэ фармакологийн идэвхт бодисуудын фармакокинетик судалгаа нь тэдгээрийг судлах, боловсруулах, эмнэлгийн практикт нэвтрүүлэх зайлшгүй үе шат юм. Эмийн үр нөлөө нь эмийг биеэс шингээх, түгээх, ялгаруулах үйл явцаас шууд хамаардаг.

Фармакокинетик өгөгдөл нь хэрэглэх зам, арга, эмийг нэвтрүүлэх газар, тунгийн ойролцоо горим, түүнчлэн эмийг устгах үндсэн замыг тодорхойлох боломжийг олгодог.

Эмийн нэгдлүүдийн шингээлт, тархалт, бодисын солилцоо, ялгаралт нь харилцан уялдаатай үйл явц юм. Эдгээр нь бүгдэд нь олон хүчин зүйл нөлөөлдөг: шингээлтийн хурд нь эмийн тунгийн хэлбэр, идэвхтэй бодисын концентраци, бодис ууссан орчны рН, гэдэсний хөдөлгөөн, шингээлтийн гадаргуугийн төлөв байдлаас хамаарна. талбай. Мансууруулах бодисын тархалт, биотрансформацийн үзүүлэлтүүд нь хүйс, нас, өвчтөний биеийн соматик байдал, түүнчлэн бие махбодийн ферментийн системийн төлөв байдлаас хамаардаг бөгөөд энэ нь ихэвчлэн хувь хүний ​​ялгаатай байдлаас шалтгаалдаг. Тиймээс зарим сэтгэцэд нөлөөт эмийн бодисын солилцооны хурд өөр өөр өвчтөнүүдэд 6-30 цагийн хооронд хэлбэлздэг. Бие махбодоос метаболитыг зайлуулах нь хавсарсан өвчин, түүнчлэн бусад эмийн нөлөөгөөр нөлөөлж болно.

Амьтан, хүний ​​​​бие дэх эмийн янз бүрийн фармакокинетик үйл явцыг үнэлэхийн тулд харгалзах фармакокинетик үзүүлэлтүүдийг тооцоолдог, үүнд био хүртээмж (F,%) - эмийн тунг судаснуудаас гадуур хэрэглэсний дараа системийн цусны урсгалд хүрдэг хэсэг.

Шинэ фармакологийн идэвхт нэгдлүүдийн эмнэлзүйн өмнөх туршилтанд фармакокинетик туршилт хийх нөхцөлийг анхаарч үзэх нь чухал юм.

Судалгаанд хамрагдсан фармакологийн бодисууд нь эрүүл амьтад: харх, хулгана, туулай, нохой, сармагчин болон бусад амьтдад клиникийн өмнөх практикт хийгддэг судалгааны объект гэж тооцогддог бөгөөд жин нь төрөл бүрийн стандартаас ялгаатай байх ёсгүй. 10% -иас дээш.

Биологийн материалын үндсэн төрлүүд нь цусны ийлдэс, бүхэл цус, янз бүрийн эрхтэн, эд, шээс, ялгадас юм.

Хэрэглэх замыг эмийн хэлбэрээр тодорхойлж, цаашдын фармакологийн судалгаанд зориулж фармакокинетикийн судалгаанд үндэслэн санал болгосон. Хэрэглэх арга нь өөр байж болно: судсаар, хэвлийн хөндийн, булчинд, арьсан доорх, амаар, гэх мэт эм нь хоол хүнстэй харьцахаас зайлсхийхийн тулд ходоодонд залгиур эсвэл арван хоёр нугасны хоолойг ашиглан амьтдад амаар тарина.

Захиргаа нь давтан эсвэл дан байж болно. Нэг удаагийн хэрэглээтэй бол дор хаяж гурван тунг ашиглан идэвхтэй бодисын фармакокинетикийг судлах шаардлагатай. Энэ нь фармакокинетикийн шугаман байдлыг шалгахад зайлшгүй шаардлагатай.

Туршилтын үргэлжлэх хугацаа нь хагас задралын хугацаанаас 5 дахин урт хугацаатай тохирч байх ёстой.

Дээжнээс амьтан тус бүрээс зөвхөн нэг дээж авсан тохиолдолд нэг цэгт ногдох амьтны тоо (харгалзах концентрацийн утга) дор хаяж 5 байх ёстой (харх дээр хийсэн туршилтанд толгойг нь таслах тохиолдолд: нэг амьтан - нэг оноо).

Шинэ фармакологийн идэвхт нэгдлийн фармакокинетик ба биофармацевтикийн судалгааны чухал үе шатуудын нэг бол түүний үнэмлэхүй ба харьцангуй биологийн хүртээмжийг судлах явдал юм ("Эмийн био хүртээмж" хэсгийг үзнэ үү).

• Пептид ба тэдгээрийн деривативыг тодорхойлох аналитик аргууд

Амин хүчил, пептид ба тэдгээрийн деривативыг чанарын болон тоон байдлаар тодорхойлох янз бүрийн аргууд байдаг. Мөн пептидийн бүтэцтэй боломжит эмийг шинжлэх оновчтой аргыг үндэслэлтэй сонгох шаардлагатай. Энэ нь бидэнд нарийн шинжилгээ хийж, тодорхой нэгдлийн фармакокинетикийг харуулах үнэн зөв, давтагдах боломжтой үр дүнг авах боломжийг олгоно.

Ангилал:

• Шингэн хроматографийн аргууд:

Нимгэн давхаргын шингэн хроматографи

Өндөр үзүүлэлттэй шингэн хроматограф

• Хийн хроматографи
• Шинжилгээний иммунохимийн аргууд
• Капилляр электрофорез

1.2 Амин хүчил ба пептидийн хроматографи

Хроматографи нь суурин ба хөдөлгөөнт гэсэн хоёр фазын хоорондох тархалтын коэффициентүүдийн ялгаан дээр үндэслэн шинжлэгдсэн хольцын бүрэлдэхүүн хэсгүүдийг ялгах физик-химийн арга юм. Хамгийн ирээдүйтэй хроматографийн аргууд нь: хийн хроматографи (GC) ба өндөр үзүүлэлттэй шингэн хроматографи (HPLC) нь масс спектрометрийн детектор - GC-MS ба HPLC-MS-тэй хослуулсан. Эдгээр аргууд нь маш хурдацтай хөгжиж байгаа бөгөөд энэ нь сүүлийн жилүүдэд гарч ирсэн протеомик, метаболомик, био түлшний шинжилгээ, өвчний биомаркерыг тодорхойлох, эм бэлдмэлийг бий болгох, чанарын хяналт, чанар, хүнсний аюулгүй байдал гэх мэт зорилтуудын өсөлттэй холбоотой юм. , түүнчлэн терроризм (хорт бодис, хортой бодис, байлдагчийг тодорхойлох), онцгой байдлын үр дагаврыг хурдан тодорхойлох.

1.2.1 Шингэн хроматографийн аргууд

1.2.1.1. Өндөр үзүүлэлттэй шингэн хроматограф

HPLC нь нэг нь хөдөлгөөнт, нөгөө нь хөдөлгөөнгүй хоёр холилдохгүй фазын хооронд өөр өөр тархалтад тулгуурлан хольцын бүрэлдэхүүн хэсгүүдийг ялгах физик-химийн арга юм. Хөдөлгөөнт болон суурин фазын туйлшралаас хамааран HPLC нь ихэвчлэн ердийн фаз (хөдөлгөөнгүй фаз нь хөдөлгөөнт фазаас илүү туйлтай) ба урвуу фаз (хөдөлгөөнгүй фаз нь хөдөлгөөнт фазаас бага туйлтай) гэж хуваагддаг.

Урвуу фазын HPLC-ийг ихэвчлэн амин хүчлүүд ба пептидүүдийг салгахад ашигладаг тул ихэнх аналитууд нь усан хөдөлгөөнт фазуудад маш сайн уусдаг ба ихэнх туйлт бус уусгагчид хязгаарлагдмал уусах чадвартай байдаг. Гэсэн хэдий ч, хэвийн фазын HPLC нь урвуу фазын HPLC-д суурин фазад хадгалагдаагүй богино гинжин амин хүчлийн дериватив ба гидрофобик чанар багатай пептидийн хроматографид ашиглагддаг. Урвуу фазын HPLC нь энэ салбарт масс спектрометрийг хэрэглэхээс өмнө пептидийг ялгах, цэвэршүүлэх алтан стандарт байсан. RP-HPLC нь хроматографийн шинжилгээний бусад аргуудаас дараах давуу талуудтай: үр дүнгийн давтагдах чадвар, өндөр ялгах чадвар, сонгомол (нэг амин хүчлийн зөрүүгээр пептидийг ялгах чадвар), мэдрэмж, гүйцэтгэлийн өндөр хурд, бага хэмжээний дэгдэмхий уусгагч.

Урвуу фазын HPLC-ийн пептидийн шинжилгээний сонголт, чанар нь хөдөлгөөнт ба суурин гэсэн фазын зөв сонголтоос хамаарна.

Хөдөлгөөнгүй фазын хувьд янз бүрийн хлоросилан деривативаар өөрчлөгдсөн цахиурлаг гель бүхий шингээгчийг ашигладаг. Энэ үе шат нь өндөр хүч чадал, органик уусгагчийг үл тоомсорлодог. Урвуу үе шат нь матрицын шинж чанараар ялгагдана - цахиурын гель болон нүүрстөрөгчийн фрагментийн найрлага, бүтцээр ялгаатай залгагдах радикалын бүтцэд. Пептидийн хроматографи хийхдээ урвуу фазын сонголтыг пептидийн хэмжээ, гидрофоб чанараар тодорхойлно: богино гинж бүхий пептидүүдийн хувьд гидрофиль пептид, С8 (n-октил) ба С18 (n-октадецил) фазуудыг ашигладаг. ба гидрофобик - фаз C3 (триметил- эсвэл диметилпропил), C4 (n-бутил), С6 (фенил).

Хөдөлгөөнт фазыг зөв сонгохын тулд органик уусгагчийн рН, найрлага, концентрацийг харгалзан үзэх шаардлагатай.

Пептидийн туйлшралыг бууруулж, шингээгчээр илүү сайн хадгалахын тулд шингээгчийн рН нь 2-3 хооронд байх ёстой. Мөн пептидийг хадгалах хугацааг нэмэгдүүлэхийн тулд эерэг цэнэглэгдсэн пептидийн бүлгүүдтэй ион-хос үүсгэх чадвартай модификаторууд буюу ион хос урвалжуудыг (эсрэгүүд) хөдөлгөөнт үе шатанд нэвтрүүлдэг. RP HPLC-ийн гол ионы хувиргагч нь трифтор цууны хүчил юм. Энэ нь элюатаас ууршилтаар амархан арилдаг, пептидийг сайн уусгадаг, богино долгионы бүсэд хэт ягаан туяаны тунгалаг байдаг тул илрүүлэх явцад нэмэлт оргил үүсгэдэггүй. Шоргоолжны хүчлийг мөн хувиргагч болгон ашигладаг бөгөөд сайн ялгах боломжийг олгодог боловч хэт ягаан туяаны бүсэд хүчтэй шингээх чадвараар түүний хэрэглээ хязгаарлагддаг.

Хөдөлгөөнт фазын ялгаруулах чадварт органик уусгагчийн нөлөө маш их байдаг. Тиймээс уусгагчийн ялгаралтын хүч нь дараах дарааллаар нэмэгддэг: ус - метанол - ацетонитрил - этанол - диоксан - тетрагидрофуран - 2-пропанол - 1-пропанол. Энэ дараалал нь энэ цувралын органик бодисын туйлшрал буурсантай холбоотой юм. Ацетонитрилийг хөдөлгөөнт фазын органик бүрэлдэхүүн хэсэг болгон ихэвчлэн ашигладаг, учир нь энэ нь хэт ягаан туяаны бүсэд 200 нм хүртэл тунгалаг, бага зуурамтгай чанар, дэгдэмхий шинж чанартай байдаг тул шаардлагатай бол цуглуулсан элюатаас амархан арилгах боломжийг олгодог. бутархай, сайн сонгомол шинж чанартай байдаг.

Пептидийн нэгдлүүдийг салгах нь органик уусгагчийн концентраци тогтмол байх изократик нөхцөлд эсвэл градиент уусмалаар явагдах бөгөөд энэ тохиолдолд органик уусгагчийн концентраци нь цаг хугацааны явцад нэмэгддэг. Туршилтын бодисууд нь гидрофобик чанарыг нэмэгдүүлэх дарааллаар ялгардаг.

1.2.1.2. Өндөр хүчин чадалтай шингэн хроматографийн пептидийг илрүүлэх аргууд: Хэт ягаан туяаны илрүүлэлт, масс спектрометр.

Эмийн бодисыг HPLC-ээр ялгасны дараа чанарын болон тоон шинжилгээг үнэн зөв хийхийн тулд тэдгээрийг илрүүлэх төхөөрөмж ашиглах шаардлагатай бөгөөд энэ нь эргээд дараахь шаардлагыг хангасан байх ёстой: детекторууд өндөр мэдрэмжтэй байх ёстой (сайн дохио, дуу чимээ байхгүй), хурд, өргөн шугаман динамик хүрээ, тогтвортой байдал, хөдөлгөөнт фазтай харилцан үйлчлэлийн дутагдал.

Өндөр хүчин чадалтай шингэний хроматографийн хамгийн түгээмэл илрүүлэх аргуудын нэг бол хэт ягаан туяа бөгөөд энэ нь шинжилгээний өндөр мэдрэмжтэй, энгийн бөгөөд эдийн засгийн үүднээс авч үзэх боломжоор тайлбарлагддаг. Гэсэн хэдий ч хэт ягаан туяаг илрүүлэх нь масс спектрометрээс бага мэдрэмжтэй арга юм. Хэт ягаан туяаны мэдрэгчийг өнөөдөр дөрвөн үндсэн төрлөөр төлөөлдөг.

• тогтмол долгионы урттай;
• долгионы уртыг өөрийн мужид өөрчлөх боломжийг олгодог монохромататортой;
• олон долгионы урттай, олон сувгийг илрүүлэх боломжийг олгодог автоматаар тааруулах монохромататортой;
• өгөгдсөн мужид спектрийн бүрэн мэдээллийг авах боломжийг олгодог диод-матрицын детекторууд.

Амин хүчлүүдийн найрлагад зарим хромофорууд, түүнчлэн пептидийн холбоо байдаг тул дээр дурдсан дөрвөн төрлийн төхөөрөмжийн аль нэгийг ашиглан хэт ягаан туяаны цацраг ашиглан пептидийн нэгдлүүдийг илрүүлэх боломжтой болсон.

Пептидийн нэгдлүүд нь хэт ягаан туяаны цацрагийг гурван хэсэгт шингээх чадвартай.

250 нм-ээс дээш (λ=280 нм), энэ нь шинжлэгдсэн нэгдэлд үнэрт амин хүчлүүд - триптофан (λ=278 нм), тирозин (λ=275 нм) болон фенилаланин агуулагдаж байгаатай холбоотой.

210-250 нм-т ийм дохиог уургийн молекул доторх болон молекул хоорондын устөрөгчийн холбоо бүхий бусад амин хүчлүүд өгч болно.

190 нм-т, энэ нь пептидийн холбоо байгаагаар тайлбарлагддаг.

Гэсэн хэдий ч судалж буй нэгдлүүдийг илрүүлэх нь 210 нм-ээс бага долгионы урттай, 210 нм-ээс бага долгионы уртад өөрийн шингээлттэй HPLC-д ашигласан уусгагчийн нөлөөлөл, түүнчлэн хольц байгаа зэргээс шалтгаалан хийгддэггүй. Тиймээс пептидийн бодисыг илрүүлэхдээ 250 нм-ээс дээш долгионы уртыг ихэвчлэн ашигладаг. Хэрэв нэгдлүүд нь энэ бүсэд хэт ягаан туяаны цацрагийг шингээх хромофор агуулаагүй бол деривацийн аргыг хэрэглэдэг.

Дериватизаци гэдэг нь аналитик шинж чанарыг сайжруулсан дериватив нэгдлийг гаргаж авахын тулд задлан шинжилж буй бодисыг химийн аргаар өөрчлөх явдал юм. Дерватизаци хийх замаар HPLC-UV-тэй ажиллахдаа биологийн материалыг шинжлэхэд тохиромжтой бүсэд хэт ягаан туяаны спектрт бүртгэгдсэн нэгдлийг авах шаардлагатай. Тиймээс Руденкогийн ажилд A.O. Нарийн төвөгтэй биологийн матриц дахь хамгийн чухал амин хүчлийг тодорхойлохдоо 16 амин хүчлийг деривацын аргыг ашигласан. О-фталалдегидийг дериватив бодис болгон ашигласан.

Масс спектрометрийн илрүүлэх арга нь ионжуулалт, массаас цэнэг ялгах, дараа нь масс анализатор ашиглан илрүүлэх гэсэн гурван үе шатаас бүрдэнэ. Эмийн нэгдлүүдийн шинжилгээнд "зөөлөн" ионжуулалтын аргыг ашигладаг: цахилгаан шүрших ионжуулалт, түүнчлэн матрицын тусламжтайгаар лазерын десорбци (MALDI). Эдгээр аргууд нь зөөлөн ионжуулалтын горимыг илэрхийлдэг бөгөөд энэ нь дулааны тогтворгүй биомолекулуудад онцгой ач холбогдолтой юм. Гэсэн хэдий ч эдгээр төрлийн иончлолууд нь хангалттай мэдээлэлгүй байдаг тул тэдгээр нь ихэвчлэн анализаторын фрагментуудыг бүртгэх арга болох тандем масс спектрометрийг (MS/MS) ашигладаг. Илүү нарийвчлалтай хэлэхэд энэ арга нь хэд хэдэн үе шатаас бүрдэнэ: эхлээд шинжлэгдсэн нэгдлүүдийг зөөлөн ионжуулж, эхний анализатороор дамжуулж, дараа нь тэдгээрийн энерги нэмэгдэж, үүний үр дүнд судалж буй молекулууд хуваагдаж, хоёр дахь анализатор нь үүссэн массыг бүртгэдэг. спектр.

Эмийн шинэ нэгдлүүдийн тоон хэмжээг тодорхойлохын тулд дараахь төрлийн масс анализаторуудыг ашигладаг.

Эмийн шинэ нэгдлүүдийг судлахад "алтан стандарт" болох Quadrupole (гурван дөрвөлжин дээр суурилсан масс анализатор);

Нислэгийн цаг (TOF)-ийг ашиглах үед гурвалсан квадруполь анализаторыг ашиглахаас бага мэдрэмжтэй байдаг.

Өндөр нарийвчлалтай массын анализатор болох ион циклотроны резонансын болон тойрог замын ионы урхи нь ийм төхөөрөмжүүдийн өндөр өртөг, нарийн төвөгтэй байдлаас шалтгаалан өнөөг хүртэл ховор хэрэглэгддэг.

Масс спектрометрийн илрүүлэлтийг HPLC-тэй хослуулан хэрэглэснээр өндөр дүн шинжилгээ хийх, эмийн нэгдлүүдийг илрүүлэх хязгаарыг нэмэгдүүлэх, судалгааны тогтвортой байдал, нарийвчлалыг мэдэгдэхүйц сайжруулах боломжтой болсон.

• Нимгэн давхаргын хроматографи

Өнөөдөр HPLC, шингэний баганын хроматографи, ион солилцооны хроматографи, уургийн полиакриламидын гель электрофорез, хялгасан судасны электрофорез зэрэг пептидийг ялгах илүү өндөр технологийн аргууд гарч ирснээр TLC-ийг бага хэмжээгээр ашиглаж байна. Гэсэн хэдий ч TLC нь тоон үзүүлэлттэй, өндөр технологид суурилсан, харьцангуй хямд, үржихэд хялбар арга болох нь тухайн үедээ батлагдсан. Нимгэн давхаргын хроматографи нь 80-аад онд алдартай байсан - амин хүчлийг ургамал, амьтан, янз бүрийн биологийн шингэнээс тусгаарлаж байв.