Använder HPLC och kapillär. Studie av farmakokinetik och biotillgänglighet - journal of pharmacokinetics and pharmacodynamics Högpresterande vätskekromatografi

Som ett manuskript

MELNIKOV Igor Olegovich

UTVECKLING AV MIKROMETODER FÖR ANALYS AV AMINOSYROR,

KORTA PEPTIDER OCH OLIGONUKLEOTIDER

ANVÄNDA RP HPLC OCH KAPILLÄR

ELEKTROFORES

Specialitet: 02.00.02 – Analytisk kemi

Avhandlingar för kandidatexamen i kemiska vetenskaper

MOSKVA 2006 Avhandlingsarbetet avslutades vid Institutionen för analytisk kemi vid Moscow State Academy of Fine Chemical Technology uppkallad efter.

M.V. Lomonosov och i gruppen för analytisk proteinkemi vid Institutet för bioorganisk kemi uppkallad efter. Akademiker M.M. Shemyakin och Yu.A. Ovchinnikov RAS.

Vetenskaplig chef:

Kandidat för kemivetenskap, docent Glubokov Yuri Mikhailovich

Officiella motståndare:

Doktor i kemivetenskap, professor Makarov Nikolay Vasilievich Kandidat för kemiska vetenskaper Kirillova Yulia Gennadievna

Ledande organisation:

Institutet för biokemisk fysik uppkallad efter. N.M. Emanuel RAS

Disputationen kommer att äga rum den 20 december 2006 kl 12:00 vid ett möte i avhandlingsrådet D 212.120.05 vid Moscow State Academy of Fine Chemical Technology uppkallad efter. M.V. Lomonosov på adressen: 119571, Moskva, Vernadsky Avenue, 86, rum. M-119.

Avhandlingen finns i biblioteket vid Moscow State Academy of Fine Chemical Technology uppkallad efter. M.V. Lomonosov.

Vetenskaplig sekreterare i avhandlingsrådet, kandidat för kemiska vetenskaper Yu.A. Efimova Relevans arbete. För närvarande fokuseras den kliniska forskningen alltmer på användningen av instrumentella mikroanalytiska metoder för att diagnostisera de vanligaste och farligaste socialt signifikanta sjukdomarna. En betydande del av dessa metoder ger inte fullt ut och ger inte alltid snabb och högkvalitativ diagnos, som ofta inte uppfyller moderna krav för att övervaka en persons biokemiska status.

Fria aminosyror och korta peptider som ingår i fysiologiska vätskor har viktig funktionell betydelse. I vissa fall kan de fungera som molekylära markörer för vissa sjukdomar.

Förändringar i deras koncentration är ofta förknippade med metabola störningar, vilket indikerar utvecklingen av en viss sjukdom. De flesta befintliga metoder för aminosyraanalys är antingen inte känsliga och selektiva nog för deras identifiering, eller kräver derivatisering av aminosyror, vilket avsevärt komplicerar processen för deras bestämning. Problemet med enkel och kostnadseffektiv analys av fria genetiskt kodade aminosyror är ännu inte helt löst. Samtidigt kräver den kliniska analysen av aminosyror deras modifiering före eller efter kolumn för mycket känslig och selektiv bestämning. Förändringar i innehållet av molekylära markörer i fysiologiska vätskor kan också vara associerade med patientens genetiska predisposition för en viss sjukdom. Därav behovet av att utföra en jämförande analys av DNA-fragment för att öka tillförlitligheten för att fastställa orsaken till sjukdomen som studeras och effektivare dess terapi.

Samtidigt är den importerade utrustningen som krävs för aminosyra- och nukleotidanalys som regel dyr och otillgänglig för de flesta kliniska laboratorier. Situationen förvärras ytterligare av det faktum att många apparater är högt specialiserade för varje typ av sjukdom, som ett resultat av vilket det finns flera dubbletter av diagnostiska metoder, både i utrustning och i metodik.

Detta ökar kraftigt kostnaderna för kliniska studier och komplicerar jämförelsen.Författaren uttrycker tacksamhet till chefen för gruppen för analytisk proteinkemi vid Institutet för bioorganisk kemi vid den ryska vetenskapsakademin, senior forskare, kandidat för kemiska vetenskaper. I.V. Nazimov för konstant hjälp, uppmärksamhet och diskussion om resultaten.

tolkning av de erhållna analysresultaten. Således utvecklas nya metoder som utökar möjligheterna att använda allmänt tillgänglig analytisk utrustning för inhemsk produktion för mycket känslig, snabb och tillförlitlig bestämning av fria och modifierade aminosyror, korta peptider och oligonukleotider både för strukturell analys av biopolymerer och deras fragment, och för kliniska diagnostiska ändamål är en brådskande vetenskaplig uppgift.

Målet med arbetet. Syfte avhandlingsarbete är utvecklingen av ett komplex av instrumentella mycket känsliga mikrometoder för analys av fria och modifierade aminosyror, korta peptider och oligonukleotider med användning av inhemsk instrumentell bas.

Vetenskaplig nyhet.

1. Metoder har utvecklats för bestämning av omodifierade genetiskt kodade a-aminosyror med användning av kapillärzonelektrofores och micellär elektrokinetisk kromatografi med direkta UV-fotometriska och refraktometriska detektionsmetoder.

2. Metoder för gemensam bestämning av lågmolekylära aminotioler i blodplasma med omvänd fas högpresterande vätskekromatografi och kapillärzonelektrofores med fluorimetriska och direkta UV-fotometriska detektionsmetoder har utvecklats och tillämpats i klinisk praxis.

3. En metod har utvecklats för att bestämma fragment av mutantgenen för venös trombos baserat på analys av allelspecifika med användning av kapillärgelelektrofores med fluorimetrisk detektion.

Praktisk betydelse . Den utvecklade metoden för aminosyraanalys gör det möjligt att bestämma mikrokvantiteter av genetiskt kodade aminosyror utan deras preliminära derivatisering, vilket avsevärt förenklar det befintliga analysschemat. En uppsättning metoder för att analysera molekylära markörer för vaskulära olyckor (homocystein, cystein, glutation), såväl som fragment av mutantgenen för venös trombos, har utvecklats och föreslagits för praktisk användning. Som ett resultat av det utförda arbetet var det möjligt att demonstrera möjligheten av effektiv användning av hushållsutrustning för biokemisk analys av både protein- och nukleinkomponenter på samma enhet för kapillärelektrofores. Bestämning av svavelhaltiga aminosyror och peptider i blodplasma med den metod som utvecklats i detta arbete användes för att bedöma riskfaktorn hos dussintals patienter med tillförlitligt etablerade infarkt- och pre-infarkttillstånd. Resultaten av det utförda arbetet användes för att skapa och i praktiken testa biomedicinsk analys av ett universellt, ekonomiskt automatiserat komplex av instrument och metoder för molekylär diagnostik av vissa socialt betydelsefulla sjukdomar (hjärtattacker, stroke, tromboser), utvecklade vid Institutet för analytisk instrumentering vid den ryska vetenskapsakademin.

Inlämnad till försvar:

metoder för bestämning av genetiskt kodade aminosyror i en vattenlösning utan deras preliminära derivatisering med användning av kapillärzonelektrofores och micellär elektrokinetisk kromatografi;

optimerade betingelser för derivatisering av plasmaaminotioler med låg molekylvikt med användning av fluorogena reagens (monobrombiman och 5-jodacetamidofluorescein);

metod för att analysera lågmolekylära aminotioler i blodplasma med användning av RP HPLC och kapillärelektrofores;

resultat av bestämning av homocysteininnehåll i blodplasma med RP HPLC och kapillärzonelektroforesmetoder;

en metod för att bestämma den muterade genen för venös trombos med användning av kapillärgelelektrofores i linjär poly-N,N'dimetylakrylamid.

Godkännande av arbete. Huvudresultat verk presenterades vid det 8:e allryska symposiet om molekylär vätskekromatografi och kapillärelektrofores (15-19 oktober 2001, Moskva, Ryssland), det 3:e internationella symposiet om separationsmetoder i biovetenskap (13-18 maj 2003, Moskva, Ryssland). , ), Internationell konferens för grund- och forskarstuderande i grundläggande vetenskaper "Lomonosov-2005" (Sektionen för kemi. 12-15 april 2005, Moskva, Ryssland), 2:a vetenskapliga och praktiska konferensen "Aktuella problem med medicinsk bioteknologi" (12 september -14 2005, Anapa, Ryssland), 3:e kongressen för Society of Biotechnologists of Russia uppkallad efter. Yu.A. Ovchinnikov (25-27 oktober 2005, Moskva, Ryssland), 1:a konferensen för unga forskare vid MITHT. M.V. Lomonosov (13-14 oktober 2005, Moskva, Ryssland), International Congress on Analytical Sciences ICAS-2006 (25-30 juni 2006, Moskva, Ryssland), 31:a internationella kongressen för Federation of European Biochemical Societies (24-29 juni) , Istanbul, Turkiet), 26:e internationella symposiet om separering av proteiner, peptider och polynukleotider (16-20 oktober 2006, Innsbruck, Österrike).

Publikationer. Baserat på avhandlingsmaterialet publicerades 12 verk i form av artiklar och abstracts.

Avhandlingens struktur. Avhandlingen består av en introduktion, litteraturgenomgång, experimentell del, diskussion av resultat, slutsatser och en lista över citerad litteratur.

Avhandlingsmaterialet presenteras på 147 sidor, innehåller 19 tabeller och 42 figurer. Listan över litterära källor består av 187 titlar.

I inledningen motiveringen för ämnet anges, forskningens mål och de bestämmelser som lämnats till försvar formuleras, dess vetenskapliga nyhet och praktiska betydelse noteras. Data lämnas om testning och publicering av forskningsresultaten samt om avhandlingens struktur och omfattning.

1:a kapitlet. Allmän information om befintliga metoder för att analysera föreningarna som studeras tillhandahålls. Kromatografiska metoder och ett antal allmänt accepterade identifieringsmetoder beskrivs mer i detalj. Metoder för att bestämma lågmolekylära aminotioler i blodplasma, såväl som DNA-fragment, övervägs. En jämförelse av befintliga metoder för analys av aminosyror, korta peptider och oligonukleotider genomförs och relevansen av ytterligare forskning inom detta område underbyggs.

Kapitel 2. Data tillhandahålls om material, reagens, metoder för att bereda de lösningar som används och utföra arbetet.

Kapitel 3. Resultat och diskussion.

Innehållet av fria aminosyror (AA) i fysiologiska vätskor är en diagnostisk parameter för ett antal sjukdomar. Den utförda forskningen syftar till att utveckla en teknik som gör att de snabbt och tillförlitligt kan separera och identifiera dem. Analysen av blandningar av sådan AA utfördes med användning av kapillärzonelektrofores (CZE) och micellär elektrokinetisk kromatografi Brytningsindex för AA med CZE-metoden med användning av blandningar av AA enligt CZE-metoden med refraktometrisk detektionslängd 90 cm, effektiv längd 75 cm .

A) Buffert: 60 mM natriumborat, pH 11,0. Spänning: 20 kV. Ström: 93 µA. Temperatur: 21,0 °C av den optimala sammansättningen av det elektriska bakgrundsprovet. Injektionstid: 7,0 s (elektrokinetisk, spänning under provinjektion - 5 kV). Infört troll. För detta ändamål testades mängden AA - 0,1 ng; alanin, tyrosin – 0,2 ng.

4 – Prolin; 5 – Alanin; 6 – Tyrosin; 7 – Serin; - Asparaginsyra; 9 – Metionin.

CAPS-buffertsystem, såväl som deras olika kombinationer med exemplet med en modellblandning av 8 AA med radikaler av olika natur och egenskaper och de mest olika pKa-värdena för aminogruppen. Ett exempel på separation av en sådan blandning med användning av en boratstödjande elektrolyt visas i fig. 1.

Den optimala bakgrundselektrolyten för separation av fritt AA med denna metod är en lösning innehållande 60 mM boratbuffert (pH 11,0).

Med hjälp av den studerades inverkan av olika faktorer (spänning, ström, inre diameter och effektiv längd av kapillären, metod för provinförande) på separationseffektiviteten och det visades att det under experimentella förhållanden inte är möjligt att helt separera en blandning av alla kodade AA. Det följer av experimentet att ACs för vilka skillnaden i migrationstid överstiger 1 min är acceptabelt separerade. Av denna anledning kan den klassiska CZE-metoden inte separera och identifiera samtidig förekomst av glycin, alanin, valin, leucin, isoleucin, histidin, fenylalanin och tyrosin, såväl som asparaginsyra, glutaminsyror och cystein. Selektivitetskoefficienten för dem är mycket låg och nära 1. Arginin, lysin, prolin, serin, asparaginsyra och metionin är lätt att isolera och identifiera, d.v.s. AK med en migreringstid på 5,5-10,0, 15 och 19,5-20,8 minuter. Selektivitetskoefficienten för denna grupp av AK är i intervallet 1,1 – 1,3. Vid användning av en fosfatstödjande elektrolyt (pH 11,4) observerades ett liknande övergripande separationsmönster, men med sämre toppupplösning. De genomförda studierna visar att klassisk CZE med refraktometrisk avslutning i bästa fall tillåter fullständig separation och identifiering av högst 8 AA i en vattenlösning. I detta fall bör innehållet av individuella AA från de angivna icke-separerbara i en sådan blandning inte överstiga två.

Effektiviteten av AA-separationen förbättras märkbart genom att tillsätta metanol till bakgrundselektrolyter med pH 7. Vid användning av 150 mM fosfatbuffert (pH 2,0) med tillsats av 30 volymprocent. metanol, var det möjligt att separera 16 av 20 genetiskt kodade AA (Fig. 2). Tyvärr tar det lång tid att separera denna blandning helt.

Kapillär: innerdiameter 75 µm, total längd – 65 cm, effektiv längd – 50 cm.

Temperatur: 28,0 oC. Provinsprutningstid: 1,5 s (vakuum).

Identifiering: 1 - lysin, 2 - arginin, 3 - histidin, 4 - glycin, 5 - alanin, 6 - valin, 7 - isoleucin, 8 - leucin, 9 - serin, 10 - treonin, 11 - metionin, 12 - fenylalanin, 13 – glutaminsyra, 14 – prolin, 15 – asparaginsyra, 16 – tyrosin.

Eftersom den tillämpade klassiska CZE vid pH 7 inte gav den erforderliga separationskvaliteten, beslutades det att tillämpa MEKC-metoden med direkt UV-detektion för analys av fria AA. Natriumdodecylsulfat (SDS) sattes till buffertlösningarna som en detergent. Under arbetet användes olika koncentrationer av komponenterna i bakgrundselektrolyten. De bästa resultaten erhölls med användning av en bakgrundselektrolyt innehållande 133 mM borsyra, 33 mM natriumborat och 100 mM SDS, pH 9,5. Användningen av en elektrolyt med den specificerade sammansättningen ökade avsevärt antalet analyserade AA samtidigt som de bestämdes vid pH-värdena för bakgrundselektrolyten som ligger i huvudområdet. I fig. Figur 3 visar ett elektroferogram av en blandning av 14 AA.

Ris. 3. Separation av en blandning av 14 fria AA genom micellär elektrokinetisk kromatografi med direkt UV-detektion Kapillär: inre diameter 50 μm, total längd 122 cm, effektiv längd 35 cm. Buffert:

133 mM borsyra, 33 mM natriumtetraborat (pH 9,5) 100 mM natriumdodecylsulfat. Spänning: 20 kV. Ström: 48 µA. Temperatur: 27,5 oC. Provinsprutningstid: 3,0 s (vakuum).

De administrerade mängderna av AA var 5,0 ng. Alanin, valin, isoleucin och glycin – 7,0 ng.

Identifiering: 1 – Valin, 2 – Alanin, 3 – Isoleucin, 4 – Glycin, 5 – Serin, 6 – Treonin, 7 – Tyrosin, 8 – Histidin, 9 – Fenylalanin, 10 – Arginin, 11 – Lysin, 12 – Cystein, 13 – Metionin, 14 – Glutaminsyra. * - Systemtoppar.

De erhållna värdena för migreringstider är anmärkningsvärda.

Trots den mindre effektiva kapillärlängden är de som regel högre än i fallet med klassisk CZE, vilket stämmer ganska bra överens med MEKC:s natur. Detta kan också vara relaterat till storleken på den applicerade spänningen per längdenhet av kapillären. Skillnaden i migrationstid som krävs för separationen av AC är betydligt mindre än i fallet med CZE. Det räcker för att det ska vara 0,5 minuter.

En mer detaljerad studie genomfördes av villkoren för separation av 14 genetiskt kodade AA, vanligtvis närvarande i blodplasma från friska donatorer i ett fritt tillstånd. Effekten av pH och tillsatser av olika organiska lösningsmedel till bakgrundselektrolyten på graden av toppupplösning studerades. Av experimentet följer att för att uppnå fullständig separation av blandningen av 14 AA måste pH-värdet ligga i intervallet 9,0-10,0. Vid pH-värden utanför det specificerade intervallet tillhandahålls inte den nödvändiga upplösningen av AK. Uppenbarligen, vid pH 9 beror detta på skillnaden mellan pKa (AA)-värden, och vid pH 10 beror det på den partiella nedbrytningen av DDSNAC-konjugat. Effekten av tillsatser av organiska lösningsmedel studerades med användning av metanol, 2-propanol och acetonitril. Erhållna data visar att tillsatsen av något av de organiska lösningsmedlen leder till en signifikant förändring av migrationstider och selektivitetskoefficienter. Förändringens natur bestäms av tillsatsens natur och koncentration. Metanol och acetonitril förbättrar inte separationen av den studerade AA, vilket tydligen beror på deras låga förmåga att bilda blandade AA-SDS-R-konjugat, där R är en organisk lösningsmedelsmolekyl. Tillsatsen av 3-5% 2-propanol förbättrar avsevärt graden av upplösning av komponenterna, med en relativt liten ökning av migreringstiden för AA. Med en ökning av koncentrationen av 2-propanol observeras en märkbar ökning av migrationstiden för AA, vilket leder till en minskning av bestämningshastigheten. Särskilt genomförda studier har visat att den bästa separationen av AA i närvaro av en effektiv mängd av ett organiskt lösningsmedel (2-propanol) sker om bakgrundselektrolyten innehåller 50 mM borsyra, 33 mM natriumborat och 50 mM SDS. I fig. Figur 4 visar ett elektroferogram av en blandning av 14 AA.

Data som presenteras indikerar den effektiva separationen av 13 av 14 genetiskt kodade AA. Den totala separationstiden överstiger inte min. Migreringstiden Sr är 0,03. Något större Sr-värden, nära 0,06-0,08, observeras för alanin, valin och histidin.

Ris. 4. Separering av en blandning av 14 AA med MEKC med direkt UV-detektion Kapillär: innerdiameter 75 μm, total längd 61 cm, effektiv längd 41 cm.

Buffert: 33 mM natriumtetraborat, 100 mM borsyra, 50 mM SDS, 5 % 2-propanol, pH=10,2. Spänning: 25 kV. Ström: 65 µA. Temperatur: 29,5 oC. Provinsprutningstid: 1,5 s (vakuum). De administrerade mängderna av AA var 0,5 ng.

Identifiering: 1 -Lysin; 2 - Prolin; 3 - Fenylalanin; 4 - Alanin; 5 - Valine; 6 - Glycin;

7 - Histidin; 8 - Tyrosin; 9 – Leucin + Isoleucin; 10 - Serin; 11 - Treonin; 12 - Glutaminsyra; 13 - Cystein.

Den uppnådda upplösningsnivån gjorde det möjligt att genomföra studier om den kvantitativa bestämningen av de övervägda AA:erna. En analys av en modellblandning av 14 AA med känd sammansättning utfördes. Studier har visat att MEKC-metoden med direkt UV-detektion med en boratbuffertlösning innehållande 3-5 % 2-propanol gör det möjligt att kvantifiera 14-16 genetiskt kodade AA med ett fel (Sr) på 6-8 % på mindre än 30 minuter. Noggrannheten av de erhållna resultaten utfördes dessutom med hjälp av metoden "entered-found" (tabell 1). Verifiering av riktigheten av att bestämma innehållet av genetiskt kodade AA: er med hjälp av MEKC-metoden (mo(AA) = 0,50 ng; in - 1,00 ng) Analys av homocystein och andra lågmolekylära aminotioler i plasmablod Homocystein (Hcy) och dess medföljande aminotioler (AT) (kodad aminosyra - cystein (Cys), tripeptidglutation (GSH)) i blodplasma är molekylära markörer för dysfunktion i det kardiovaskulära systemet. Huvudmålet med denna studie var att utveckla en metod för att bestämma innehållet av homocystein som en pålitlig riskfaktor för sådana sjukdomar.

Kvantitativ analys av lågmolekylära aminotioler i blodplasma inkluderar reduktion av disulfidbindningar, deproteinisering av blodplasma, modifiering av aminotioler med lämpliga reagenser, separation och identifiering av modifierade aminotioler med RP HPLC eller CE med en eller annan detektionsmetod. I detta arbete reducerades oxiderade och proteinbundna aminotioler med trifenylfosfin. För att avlägsna tungmetallkatjoner användes en EDTA-tillsats. Den föreslagna reduktionstekniken gav snabb (15 min) och fullständig reduktion (96%) av disulfider och frisättning av sulfhydrylgrupper vid rumstemperatur. Utbytena av reduktionsreaktioner bestämdes med användning av ett standardförfarande för mätning av innehållet av fritt AT. Plasmaproteiner med hög molekylvikt fälldes ut med 5-sulfosalicylsyra.

Dess koncentration optimerades under studien, vilket undviker förlust av känslighet på grund av utspädning under neutraliseringssteget.

Modifiering av fria sulfhydryler utfördes med monobromobiman (mBrB) eller 5-jodacetamido-fluorescein (5-IAF). Det erforderliga pH-värdet upprätthölls med dietanolamin (pKa = 8,9) och natriumortofosfat, beroende på reagenset som användes för AT-modifiering. Användningen av dietanolamin gjorde det möjligt att direkt kontrollera bildandet av målprodukter genom masspektrometri. För att identifiera AT-derivat användes fotometriska och fluorimetriska detektionsmetoder. Derivaten karakteriserades genom absorptions-, fluorimetrisk och masspektroskopi (MALDI-TOF, ESI). Fotometrisk och fluorimetrisk detektion utfördes vid våglängder valda enligt absorptionsspektra (Hcy-MB - 234 nm) och fluorescensspektra för Hcy-derivat (390 nm (excitation) och 478 nm (fluorescens)). Från fluorescensspektrumet för Hcy-AF-konjugatet följer att under fluorimetrisk detektion är den optimala våglängden för excitation 462 nm och för fluorescens 504 nm.

För att förena metoderna för att bestämma och verifiera den grundläggande möjligheten att använda samma detektor för att identifiera både monobiman- och fluoresceinderivat studerades excitationseffektiviteten vid en våglängd på 390 nm. Intensiteten för det resulterande fluorescensmaximumet och, som en konsekvens, detektionskänsligheten var en storleksordning lägre än när man använder strålning vid en våglängd på 462 nm för excitation.

Individuella monobromobiman (MB) och acetamidofluorescein (AF) AT-derivat, såväl som deras modellblandningar, analyserades. De individuella monobrombimanderivaten Cys, Hcy och GSH eluerade med retentionstider (min) på 6,01 ±0,19, 10,76 ±0,17 respektive 11,89 ±0,11 (fig. 5)1.

Samma retentionstid upprätthålls vid användning av blandningar av aminotioler med känd sammansättning. De erhållna experimentella data gjorde det möjligt att beräkna utbytet av modifieringsreaktionen. Den var inte mindre än 97 %, vilket stämmer väl överens med de kända data, men erhållits under strängare provberedningsbetingelser. De resulterande derivaten isolerades från blandningen och karakteriserades genom masspektrometri.

Fluoresceinderivat Cys, Hcy och GSH eluerades med retentionstider (min) av 8,49 ± 0,12; 10,46 ±0,15 respektive 12,96 ±0,14 (fig. 6).

Kromatografisk analys utfördes på en inhemsk högpresterande vätskekromatograf "MiliChrom A-02" (EkoNova, Novosibirsk) Fig. 5. RP HPLC av en modellblandning av aminotioler modifierad med monobromobiman. Cys-MB-50,0 µM, Hcy-MB-25,0 µM, GS-MB-25,0 µM.

Fluorimetrisk detektion (exc = 390 nm, exp = 478 nm) Fig. 6. RP HPLC av en modellblandning av aminotioler modifierad med 5-jodacetamidofluorescein. Cys-AF-100,0 µM, Hcy-AF-150,0 µM, GS-AFµM. Fluorimetrisk detektion (abs = 390 nm, esp = 478 nm) När 5-IAF används som märkning uppnås bättre upplösning av topparna av tiolfluorescerande konjugat jämfört med tiol-monobimankonjugat. Utbytet av AT-modifieringsreaktionen 5-IAF, bestämd experimentellt genom att reducera intensiteten av den fluorescerande markörtoppen, var 95%. Alla de resulterande derivaten isolerades från blandningen och karakteriserades genom masspektrometri.

De erhållna uppgifterna tjänade som grund för utvecklingen av en metod för kvantitativ bestämning av homocystein. För att konstruera en kalibreringskurva användes prover av blandningar med dess innehåll från 2,5 till 100 μM. Det valda intervallet inkluderar intervallet av fysiologiska koncentrationer av Hcy (5-50 μM). mBrB användes som en märkning. Det resulterande kalibreringsberoendet för den kromatografiska topparean på homocysteinhalten i blandningen är linjär genom hela det studerade koncentrationsintervallet och beskrivs av ekvationen:

Den relativa standardavvikelsen för bestämningsresultaten efter topparea överstiger inte 0,083 och efter återhämtningstid – 0,026. Detektionsgränsen för fluorimetrisk detektion av MB-derivat är 1 μM (Fig. 7).

Ris. 7. Förändring i området för den kromatografiska toppen beroende på koncentrationen av Hcy. Metodens effektivitet bekräftas genom att jämföra kromatogram erhållna för enskilda substanser och för blodplasmaprover framställda med den föreslagna metoden. De genomförda studierna gjorde det möjligt att utveckla en metod för kvantitativ bestämning av homocystein, cystein och glutation i blodplasma och framgångsrikt använda den för rutinanalys av de ovan nämnda antikropparna i form av deras MB-derivat (Fig. 8). . Vid utvecklingen av metoden utfördes ytterligare kontroll med metoden "entered-found" (tabell 2).

Ris. 8. RP HPLC av blodplasma från en frisk givare. Cys-MB-192,4 µM, HcyMB-10,1 µM, GS-MB-15,7 µM. Fluorimetrisk detektion Bestämning av Hcy i form av MB-derivat med mikrokolumn-HPLC. Med den utvecklade metoden analyserades mer än 50 prover av blodplasma från friska patienter och de som lider av hjärt-kärlsjukdomar av varierande svårighetsgrad. För friska patienter var det genomsnittliga innehållet (μM) av AT i blodplasma från en ven på fastande mage på morgonen:

för Hcy 12,75 ±3,21, för GSH 9,53 ±1,17 och för Cys 206,34 ±24,61. De erhållna koncentrationsvärdena faller inom intervallet för referensvärden som anges i litteraturen. För patienter som lider av hjärt-kärlsjukdomar berodde den påträffade koncentrationen av Hcy i blodplasman på sjukdomens svårighetsgrad. Resultaten korrelerar med patienternas kliniska tillstånd.

Möjligheten att analysera AT med en så billigare och vanligare detektionsmetod som fotometrisk undersöktes. Experimentet visade att det ger en känslighet som gör att man kan bestämma patologiskt höga nivåer av AT i blodplasma. Vid användning av fotometrisk detektion är det att föredra att använda 5-IAF som en märkning eftersom det löser upp topparna till baslinjen (fig. 9), vilket möjliggör kvantifiering.

Ris. 9. RP HPLC av modellblandningar av aminotioler modifierade med monobromobiman (a) och 5-jodacetamidofluorescein (b). A) Cys-MB-50,0 µM, HcyMB-25,0 µM, GS-MB-25,0 µM. B) Cys-AF-50,0 µM, Hcy-AF-75,0 µM, GS-AF-25,0 µM. Fotometrisk detektion (a = 234 nm, b = 250 och 300 nm) Sålunda gjorde det utförda arbetet det möjligt att optimera provberedningssteget genom att utföra det under "milda förhållanden" med ett garanterat kvantitativt utbyte av den analyserade komponenten. På grundval av detta har en metod utvecklats som gör att man snabbt och tillförlitligt kan bestämma innehållet av lågmolekylära antikroppar i blodplasman hos friska och sjuka patienter. Mätfelet överstiger inte 8,5 %. Den nedre gränsen för intervallet för uppmätta koncentrationer (2,5 μM) indikerar den grundläggande möjligheten att använda denna teknik för att bestämma det minskade innehållet av Hcy i blodplasma. Detektionsgränsen för den beskrivna metoden är 1 µM. Den utvecklade metoden testades på riktiga prover av patientblodplasma och kan användas för rutinbruk.

Bestämning av homocystein och andra lågmolekylära aminotioler i plasma Fig. 10. CZE för AT-modellblandningen, har en migreringstid på 6,18 ±0,16; cysteinmodifierad mBrB Hcy-MB-700,0 µM, Cys-MB-300,0 µM 6,83 ± 0,20 respektive glutation - 8,54 ± 0,17 min (fig. 10). Jämfört med GS-MB-700,0 µM. (absorbera = 234 nm).

Kapillär: inre diameter 50 µm, full HPLC CZE-metod används, tillåter längd 82 cm, effektiv längd 62 cm.

Buffert: 50 mM natriumtetraborat pH=11,0. minska tiden för AT-analys med 2-3 minuter.

Spänning: 25 kV. Ström: 58 µA.

(vakuum) direkt UV-detektion är inte tillräckligt för att bestämma små mängder Hcy i blodplasma. Vid ett homocysteninnehåll på 10 µM är signal/bakgrundsförhållandet 2,5-3, och den relativa standardavvikelsen är i intervallet 0,3-0,5. Denna metod är tillämpbar för att kontrollera innehållet av Hcy i blodplasman hos patienter med patologiskt höga nivåer (25 µM). Den relativa standardavvikelsen vid bestämning av dessa koncentrationer är 0,12 för MB-Cys, 0,18 för MB-Hcy och 0,17 för MB-GS.

Kapillärzonelektrofores med fluorimetrisk detektion utfördes på en kapillärjonanalysator "Nanofor 02" (INP RAS, St. Petersburg) Analys av Hcy i form av MV-derivat med användning av RP HPLC med fluorimetrisk och CZE med fotometrisk detektion (n = 5; P = 0,95) Modellblandningar av AF-derivat studerades med CZE-metoden med direkt fotometrisk (Fig. 11) och fluorimetrisk (Fig. 12) detektion (Tabell 3). Fotometrisk detektion utfördes vid en våglängd på 492 nm, vilket motsvarar excitationsvåglängden för 5-IAF. För fluorimetrisk detektion var excitationsvåglängden 473 nm och emissionsvåglängden 514 nm. Det har fastställts att användningen av 5-IAP gör det möjligt att öka känsligheten för bestämning av Hcy med CZE-metoden med fluorimetrisk detektion.

Absorbans, 492 nm Fig. Fig. 11. CZE av en modellblandning av AT, mo- Fig. 12. CZE av en modellblandning av AT modifierad med 5-jodacetamido-modifierad 5-jodacetamidofluorescein med direkt UV-fluorescein med fluorimetrisk Hcy-AF-100,0 µM, Cys-AF-300,0 µM, GS-AF-15-Hcy-AF µM, Cys-AF-15,0 µM, GS-AFµM. (abs = 473 nm, exp = 514 nm) 700,0 uM. (absorbera = 492 nm).

Kapillär: innerdiameter 50 µm, totalt Kapillär: innerdiameter 50 µm, total längd 68 cm, effektiv längd 53 cm längd 65 cm, effektiv längd 57 cm.

Buffert: 25 mM natriumtetraborat, 25 mM fosfat Buffert: 25 mM natriumtetraborat, 25 mM natriumfosfat pH = 11,2. Spänning: 20 kV. Strömstyrka: natrium pH = 11,2. Spänning: 20 kV. Strömstyrka:

22 µA. Temperatur: 25,0 oC. Ingångstiden är 18 µA. Temperatur: 25,0 oC. Provinjektionstid: 5 s (elektrokinetisk, spänning vid: 5 s (elektrokinetisk, spänning vid) De utvecklade metoderna för att bestämma homocysteinhalten i blodplasma med RP HPLC och kapillärelektrofores har introducerats i praktiken av biomedicinsk analys av JSC Medical Technologies, Ltd.

med hjälp av kapillär gelelektrofores Förändringar i innehållet av molekylära markörer i fysiologiska vätskor kan också bero på patientens genetiska predisposition för en specifik sjukdom. Därav behovet av att utföra en jämförande analys av DNA-fragment för att öka tillförlitligheten för att fastställa orsaken till sjukdomen som studeras och effektivare dess terapi.

I detta arbete undersökte vi möjligheten att använda tillgänglig inhemsk CE-utrustning för att bestämma mutationer i DNA-molekyler med hjälp av exemplet med fragment av mutantgenen för venös trombos, med hjälp av allelspecifik PCR. Nukleotider separerades genom kapillärgelelektrofores (CGE) med omodifierade kvartsglaskapillärer med en diameter på 25 till 100 μm. Linjär poly-N,N-dimetylakrylamid (pDMA) från inhemsk produktion användes som en separationsmatris. Valet av denna polymer är relaterat till möjligheten att den kan användas i chipversionen av CGE. pDMA syntetiserades vid Synthol JSC från dimetylakrylamidmonomer genom radikalpolymerisation. Kedjelängden kontrollerades genom att ändra temperaturen eller lägga till radikalfångare. Polymerer innehållande 5-8% pDMA-monomer användes. 0,1 M TBE (0,1 M TRIS, 0,1 M borsyra och 2,5 mM EDTA; pH = 8,3) och 0,1 M TAPS (N-tris(hydroximetyl)metyl) användes som bakgrundselektrolyter. 3-aminopropansulfonsyra; pH = 8,3) Alla studerade polymerer hade en låg nivå av nativ fluorescens (0,5 AU). Polymerer framställda med 0,1 M TAPS tillåter upp till 5 separationer utan att fylla på kapillären med gel, medan de som innehåller TBE inte tillät mer än 3. Dessa polymerer ger en upplösning som är jämförbar med deras motsvarande västerländska motsvarigheter, men är också mer överkomliga .

Studier av en blandning av fluorescensmärkta polynukleotider med längder på 5-15 nukleotider. med en halt av 10-9 M av var och en av dem var det möjligt att bestämma den optimala polymersammansättningen för att separera oligonukleotider med en kedjelängd på upp till 100 nt. (Fig. 13). Detta är en pDMA-baserad gel som innehåller 6 % monomer, 7 M urea och 0,1 M TAPS.

Ris. 13. Separation av en blandning av polynukleotider med längder Kapillär: inre diameter - 50 µm, total längd - 45 cm, effektiv längd - 38,5 cm Polymer: 6% pDMA-monomer, 0,1M TAPS, 7M urea. Arbetselektrolyt: 0,1M TAPS. Spänning:

10 kV. Ström: 4,3 µA. Temperatur: 25,0 oC. Provinsprutningstiden är 10 s (elektrokinetisk, provtagningsspänningen är 10 kV).

Optimering av separationsförhållanden (spänning, ström, effektiv längd och kapillärdiameter) gjorde det möjligt att uppnå separation till en baslinje av oligonukleotider med en total längd på mindre än 100 nt. och en längdskillnad på 1 n.o. (Fig. 14.).

Ris. 14. Separation av en blandning av polynukleotider med en skillnad i längd på 1 bp.

Kapillär: innerdiameter - 50 µm, total längd - 65 cm, effektiv längd - 57,5 ​​cm Polymer: 6 % pDMA-monomer, 0,1 M TAPS, 7 M urea. Arbetselektrolyt: 0,1M TAPS. Spänning:

11 kV. Ström: 5,1 µA. Temperatur: 25,0 oC. Provinsprutningstiden är 10 s (elektrokinetisk, provtagningsspänningen är 10 kV).

De erhållna uppgifterna tjänade som grund för utvecklingen av ett system för snabb och effektiv diagnos av mutantgenen för venös trombos (Leiden-genen av faktor V i det mänskliga blodkoagulationssystemet).

För att bevisa möjligheten till gemensam bestämning av produkter av vild- och mutanttyp (skillnad 5 bp), utfördes följande PCR: 1.

Vildtyps-DNA (ingen mutation) + vildtypsprimer; 2. Vildtyps-DNA (utan mutation) + FV Leiden-primer; 3. DNA med heterozygot mutation FV Leiden + primer FV Leiden; 4. FV Leiden primer utan DNA. Reaktionsprodukterna, efter behandling med formamid och spädning med vatten, analyserades med CGE med fluorimetrisk detektion. Analys av prov 1 och 3 visade närvaron av produkten i blandningen efter PCR, och prov 2 och 4 visade sin frånvaro. För att bekräfta detta mönster analyserade vi en blandning av mutant primer/mutant produkt och vildtyp primer/vildtyp produktprov i ett 1:1-förhållande (Fig. 15).

Ris. 15. Gemensam bestämning av mutanta och icke-mutanta PCR-produkter Kapillär: inre diameter – 50 µm, total längd – 45 cm, effektiv längd – 38,5 cm Polymer 6 % pDMA-monomer, 0,1 M TAPS, 7 M urea. Arbetselektrolyt: 0,1M TAPS. Spänning: 12 kV.

Ström: 6,5 µA. Temperatur: 25,0 oC. Provtagningstid: 10 s (elektrokinetisk, provtagningsspänning – 10 kV).

De erhållna data visar möjligheten till gemensam bestämning av allelspecifika PCR-produkter av FV Leiden-mutationen och vildtypen. Det föreslagna tillvägagångssättet, nämligen selektion och syntes av allelspecifika primrar av olika längd och en gemensam motprimer, följt av analys av CGE med fluorimetrisk detektion, kan utvidgas för att diagnostisera andra genetiskt bestämda sjukdomar. Det bör också noteras att det är möjligt att analysera oligonukleotider med användning av vanlig hushållsutrustning som används för analys av aminosyror och korta peptider.

1. Metoder har utvecklats för analys av genetiskt kodade aminosyror utan deras preliminära derivatisering med användning av micellär elektrokinetisk kromatografi och kapillärzonelektrofores med refraktometrisk och direkt UV-detektion. Inverkan av bakgrundselektrolytens sammansättning och pH-värde, liksom tillsatsen av organiska lösningsmedel, på separationseffektiviteten studerades.

2. Med användning av metoden micellär elektrokinetisk kromatografi med direkt UV-detektion utfördes en kvantitativ bestämning av en modellblandning av 14 genetiskt kodade fria aminosyror.

3. En metod har utvecklats för snabb och tillförlitlig bestämning av halten av lågmolekylära aminotioler i blodplasma hos friska och sjuka patienter med omvänd fas HPLC med fluorimetrisk detektion. Den grundläggande möjligheten att använda denna teknik för att bestämma låga nivåer av homocystein i blodplasma visas. Den utvecklade metoden testades på riktiga prover av patientblodplasma.

4. Möjligheten att bestämma patologiskt höga koncentrationer av homocystein i blodplasma genom kapillärzonelektrofores med fotometrisk detektion har visats. Den utvecklade metoden testades på riktiga prover av patientblodplasma. Möjligheten att använda 5-jodacetamidofluorescein som en absorberande och fluorogen märkning studerades.

5. En metod har utvecklats för selektiv bestämning av fragment av mutantgenen för venös trombos (FV Leiden-mutation) genom kapillärgelelektrofores med fluorimetrisk detektion. Möjligheten att analysera nukleotider med en kedjelängd på upp till 100 nukleotider har visats. och med en längdskillnad av 1 n.o.

Huvudmaterialet i avhandlingen presenteras i följande verk:

1. Melnikov I.O., Nazimov I.V., Stukacheva E.A., Glubokov Yu.M. Bestämning av innehållet av homocystein och andra lågmolekylära aminotioler i blodplasma. // J. Anal. Chem. -2006. -T. 61. -Nr 11. -S. 1185-1191.

2. Melnikov I.O., Glubokov Yu.M., Nazimov I.V. Kapillärelektrofores av fria aminosyror med refraktometrisk och direkt UV-detektion. // Inf.-anal. bulletin "Vetenskapliga anteckningar från MITHT." M.:

MITHT. -2004. Vol. 11. -S. 54-57.

3. Melnikov I.O., Glubokov Yu.M., Nazimov I.V. Analys av aminotioler med låg molekylvikt genom kapillärelektrofores och RP HPLC med fluorescerande och direkt UV-detektion. // J. "Modern högteknologisk teknik." M.: Naturvetenskapsakademin, -2005. -Nr 3. -P.40-41.

4. Melnikov I.O., Nazimov I.V., Stukacheva E.A., Glubokov Yu.M. HPLC och HPCE bestämning av homocystein som ett kriterium för vaskulärt riskfaktor för sjukdomar. // FEBS J. -2006. -V. 273. -S.1. -P. 256.

5. Melnikov I.O., Nazimov I.V., Lobazov A.F., Popkovich G.V. Kapillärelektrofores av omodifierade aminosyror. // Abstrakt. Rapportera 8th All-Russian Symposium on Molecular Liquid Chromatography and Capillary Electrophoresis, Moskva, oktober 2001, s. 23.

6. Melnikov I.O., Nazimov I.V., Lobazov A.F., Popkovich G.B. Kapillärelektrofores av kodade icke-modifierade aminosyror med refraktometrisk Upptäckt. // 3rd International Symposium on Separations in BioSciences, Moskva, maj 2003, s. 263.

7. Melnikov I.O., Stukacheva E.A., Glubokov Yu.M., Nazimov I.V. Bestämning av homocystein och andra lågmolekylära aminotioler i blodplasma med CEF- och RP-HPLC-metoder. // Material från den internationella konferensen för studenter och forskarstuderande i grundvetenskap "Lomonosov-2005".

M.: MSU, 2005. Kemisektionen. -T. 1. -S. 31.

8. Nazimov I.V., Melnikov I.O., Glubokov Yu.M., Sivopliasova E.A. Instrumentella mikrometoder för att bestämma homocystein som en riskfaktor för hjärt-kärlsjukdomar. // Material från den andra vetenskapliga och praktiska konferensen "Current problems of Medical Biotechnology", Anapa, september 2005, -S. 15-16.

9. Melnikov I.O., Nazimov I.V., Sivoplyasova E.A., Glubokov Yu.M. Mikrometoder för kvantitativ bestämning av homocystein i blodplasma. // Material från den tredje kongressen för Society of Biotechnologists of Russia uppkallad efter. Yu.A. Ovchinnikova, Moskva, oktober 2005, -S. 61.

10. Melnikov I.O., Sivopliasova E.A., Glubokov Yu.M., Nazimov I.V. Bestämning av riskfaktorer för hjärt-kärlsjukdomar med hjälp av kromatografiska analysmetoder. // Material från den första konferensen för unga forskare MITHT im. M.V. Lomonosov, Moskva, oktober 2005, -S. 31.

11. Melnikov I.O., Nazimov I.V., Stukacheva E.A., Glubokov Yu.M. Separation och identifiering av aminotioler med låg molekylvikt i blod genom omvänd fas högpresterande vätskekromatografi och kapillärelektrofores. // Internationell kongress om analytiska vetenskaper ICAS-2006, Moskva, juni 2006, -P. 204.

12. Melnikov I.O., Nazimov I.V., Patrushev L.I., Alekseev Ya.I., Glubokov Yu.M., Mosina A.G. Bestämning av mänsklig leiden-genmutation genom högpresterande kapillärgelelektrofores. // 26th International Symposium on the Separations of Proteins, Peptides and Polynucleotiders, LMP, Innsbruck, Österrike, oktober 2006, -P. 24.

Liknande verk:

"Dmitry Sergeevich KOPCHUK FUNKTIONALISERADE 5-ARYL-2,2'-BIPIRIDIINES OCH DERES LUMINESCENTKOMPLEX MED LANTHANID(III) 02.00.03. – Organic chemistry abstract of the dissertation for the scientific degree of Candidate of Chemical Sciences Ekaterinburg 2010 Arbetet utfördes vid Institutionen för organisk kemi vid State Educational Institution of Higher Professional Education USTU-UPI uppkallad efter Rysslands första president B.N. Jeltsin FORSKNINGSHANDLEDARE: Doktor i kemiska vetenskaper Kozhevnikov Dmitrij Nikolajevitj OFFICIELLA OPPONERARE: Doktor i kemi...”

“Venv Sergey Valerievich e Teoretisk studie av påverkan av elektrostatiska interaktioner och den primära strukturen hos makromolekyler på deras självorganisering 02.00.06 – Högmolekylära föreningar ABSTRAKT av avhandlingen för graden av kandidat för fysikaliska och matematiska vetenskaper Moskva - 2011 The arbete utfördes vid institutionen för fysik av polymerer och kristaller vid fakulteten för fysik vid Moscow State University uppkallad efter M.V. Lomonosov. Vetenskaplig handledare: läkare...”

“NIKOLAEV ANDREY ALEXANDROVICH TEORETISK OCH EXPERIMENTELL STUDIE I SAMVERKAN MELLAN KOMPLEX I METALER 6 OCH 1 0 G R U P Y S D A L K I L F O S F I T A M I ​​02.00.08 – Chemistry of organoelement Science degree of the dissertica of the dissertica Chemistry degree of the dissertica - 2008 Arbetet utfördes vid avdelningen för högmolekylära och organoelementföreningar vid Kemiska institutet uppkallat efter. A. M. Butlerov State..."

"Vilesov Alexander Sergeevich STRÅLNINGSKEMISK SYNTES AV POLYMERFORMER AV FOSFOR I OLIKA MILJÖER 02.00.01. – Oorganisk kemi ABSTRAKT av avhandlingen för den vetenskapliga graden Candidate of Chemical Sciences Moskva 2009 Arbetet utfördes vid Institute of Chemistry and Sustainable Development Problems of the Russian Chemical-Technological University uppkallat efter D.I. Mendeleeva Vetenskaplig handledare: Motsvarande medlem av Ryska vetenskapsakademin, doktor i kemiska vetenskaper, professor Natalia Pavlovna Tarasova tjänsteman..."

“Slovokhotov Yuri Leonidovich ATOMSTRUKTUR OCH EGENSKAPER HOS KRISTALLKEMI HOS NYA FULLERENSDERIVATIV 02.00.03 – organisk kemi 02.00.04 – fysikalisk kemi ABSTRAKT av avhandlingen av avhandlingen för kemi -70 Doktorgraden i kemi -20 avhandlingen utfördes vid doktorsexamen i kemi. av organiska elementföreningar uppkallade efter A.N. Nesmeyanov Russian Academy Sciences Doctor of Chemical Sciences, officiell..."

“Varnavskaya Olga Alekseevna FYSIKALISK-KEMISKA EGENSKAPER FÖR KOMPLEXERING AV NEODYMIUM (III) OCH EUROPIUM (III) MED 2,2-DIPIRIDILIN I ORGANISKA MILJÖER AV OLIKA POLARITET 02.00.04 Sammanfattning av fysikalisk kemiexamen 02.00. vetenskaper Tomsk - 2010 Arbete utfört i Altai State University, Barnaul Vetenskaplig handledare: kandidat för kemiska vetenskaper, docent Smagin Vladimir Petrovich Officiella opponenter: doktor...”

“Krasnova Tatyana Aleksandrovna Masspektrometri med matris(yt)aktiverad laserdesorption/jonisering vid identifiering och bestämning av oligomerer av polysulfonsyra, polykarboxylsyror och antibiotika 02.00.02 - analytisk kemi SAMMANSÄTTNING av avhandlingen av avhandlingen i kemisk vetenskap Candidate - 2013 Arbetet utfördes vid avdelningen för kemi vid Vladimir State University uppkallad efter Alexander Grigorievich och Nikolai Grigorievich..."

"ANALYS Specialty 02.00.02 - analytisk kemi ABSTRAKT av avhandlingen för graden av kandidat för kemiska vetenskaper Tomsk - 2012 www.sp-department.ru Arbetet utfördes vid Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Professional Education National Research. .."

“SMIRNOV Aleksey Aleksandrovich FYSIKALISKA OCH KEMISKA PROCESSER I INGEN JÄVLIGT LÅGTEMPERATUR PLASMA HBr OCH DESS BLANDNINGAR MED ARGON, HELIUM OCH VÄTE 02.00.04 – Fysikalisk kemi examen i fysikalisk kemi och fysikalisk kemi. Ivanovo 2010 Arbete utfört kl statens utbildningsinstitution för högre yrkesutbildning Ivanovo State Chemical Technology University . Vetenskaplig handledare: Doktor i kemiska vetenskaper, professor Efremov Alexander Mikhailovich Officiella opponenter:..."

“VASYUTIN Oleg Alekseevich FORSKNING AV SYNTESFÖRHÅLLANDENS PÅVERKAN PÅ ADSORPTIONSEGENSKAPERNA HOS FERROSPINEL OCH YTAGENSKAPER HOS YTTRIUM FERROGARNET GENOM METODER FÖR POTENTIOMETRI OCH VÄTNING Specialty.10ct. ation för den vetenskapliga graden av Candidate of Chemical Sciences St Petersburg 2012 Arbetet utfördes vid institutionen för kolloidkemi vid fakulteten för kemi St. -Petersburg State..."

“Melnikova Tatyana Igorevna UTVECKLING AV TEORETISKA OCH EXPERIMENTELLA RAMAR FÖR FASTSTÄLLNING AV SAMMANSÄTTNING OCH STRUKTURELLA EGENSKAPER HOS BISMUTH BORATES OCH SILLENITES Specialitet 02.00.21 Solid State Chemistry Science Abstract of the Candidical Chemistry AbstraCT of the Candidate of the Candidate. 011 Arbete avslutat och vid institutionen of Physics and Chemistry of Solid State, Moscow State University of Fine Sciences kemisk teknologi uppkallad efter M.V. Lomonosov Vetenskaplig handledare: Doktor...”

“Starostina Irina Alekseevna SYRA-BAS INTERAKTIONER AV POLYMERER OCH METALLER I LIMSFÖRENINGAR 02.00.06 – Högmolekylära föreningar ABSTRAKT av avhandlingen för doktorsexamen i kemivetenskap Kazan - 2011 1 www.rus-avdelningen. Arbetet utfördes. ute på Kazan National Federal State Budgetary Educational Institute of Higher Professional Education forskningsteknologiskt universitet Vetenskaplig konsult Doktor i tekniska vetenskaper, professor Oleg Vladislavovich Stoyanov Officiella motståndare Doktor...”

“VASILIEV Vladimir Petrovich SPEKTRAL - LUMINESCENS STUDIE AV INTERMOLEKYLAR INTERAKTIONER gör METALLOCENE KOMPLEX Zr och Hf i SOLUTIONS 02.00.04. - fysikalisk kemi Sammandrag av avhandlingen för graden av kandidat för kemiska vetenskaper Chernogolovka - 2008 Arbetet utfördes vid Institute of Problems of Chemical Physics vid den ryska vetenskapsakademin och det pedagogiska institutet vid Southern Federal University Vetenskaplig handledare: Candidate of Chemical Sciences LUKOVA Galina Viktorovna Official..."

“SPANCHENKO Olga Valerievna FUNKTIONELL TOPOGRAFI AV TRANSPORTMATTER RNA 02.00.10 - bioorganisk kemi ABSTRAKT av avhandlingen för doktorsexamen i kemiska vetenskaper Moskva - 2010 2 Arbetet utfördes vid Institutionen för kemi för naturkemierna i fakulteten kemi. i Moskva-staten..."

“KOSHELEV Ekaterina Valentinovna SOLID ELEKTROLYTES IN CaY2S4-Yb2S3 and CaYb2S4-Y2S3 SYSTEMS Specialitet: 02.00.05 – Elektrokemi ABSTRAKT av avhandlingen för den vetenskapliga graden av kandidat för kemiska vetenskaper arbete vid avdelningen för fysikaliska vetenskaper i Ekaterinburg - 20142 i organiska avdelningen och Fysiska vetenskapsarbetet. Kemi vid den federala statliga budgetutbildningsinstitutionen vid V PA Vyatka State University, Kirov Kalinina Lyudmila Alekseevna, vetenskaplig handledare: kandidat för kemiska vetenskaper, docent vid Vyatka State University,...

“Ekaterina Konstantinovna Lavrentyeva Template i system som innehåller leror som en metod för att kontrollera egenskaperna hos polymerkompositsorbenter och platinaelektrokatalysatorer Specialiteter: 02.00.06 – högmolekylära föreningar 02.00.05 – elektrokemi ABSTRAKT av avhandlingen för den vetenskapliga kandidaten fysiska och matematiska vetenskaper Moskva – 2009 Arbete utfört vid institutionen för fysik...”

“Evgenia Viktorovna Korchagina AGGREGATION AV KITOSAN OCH DESS DERIVAT I UTSPÄDDA VATTENLÖSNINGAR 02.00.06 – högmolekylära föreningar, fysikaliska och matematiska vetenskaper och Sammanfattning av avhandlingen för den vetenskapliga graden av kandidat för fysikalisk vetenskap och fysikalisk vetenskap201hema-w utfördes matte201 ut vid Institutionen för fysik av polymerer och kristaller vid Fysiska fakulteten och Moscow State University..."

“Vorobeva Ekaterina Georgievna CHIRAL COMPLEXES OF PALLADIUM BASERADE PÅ KVÄVEHÅLLANDE DERIVAT AV NATURLIGA MONOTERPENOIDER 02.00.03 – Organisk kemi SAMMANSÄTTNING av avhandlingen för den vetenskapliga graden av vetenskapsexamen11 Den ryska vetenskapskandidaten11 arbetade vid Rysslands 20 kemi. Academy Sciences Institute of Chemistry vid Komi Scientific Center i Ural-grenen av Ryska vetenskapsakademin och vid Institutionen för kemi FSBEI HPE Syktyvkar State University. Vetenskaplig handledare: Olga Zalevskaya...”

“Rykunov Alexey Aleksandrovich PORTABILITY OF QUANTUM-TOPOLOGICAL ATOMIC AND BOND BESCRIPTORS IN THE RANGE OF SUBSTITUTED HYDROPYRIMIDINES speciality 02.00.04 - Physical chemistry ABSTRACT of the avhandling för Science Candidate Chemical examen 2 var fullbordad vetenskaplig examen i kemi1 vid 2. Institutionen för Quantum of Chemistry, Naturvetenskapliga fakulteten, Russian Chemical-Technological University. . DI. Mendeleev Vetenskaplig handledare: doktor i fysikaliska och matematiska vetenskaper, professor..."

“KORSHUN Vladimir Arkadievich MODIFIERADE PYRIMIDINUKLEOSIDER OCH ICKE-NUKLEOSIDEREAGENSER I SYNTESEN AV OLIGONUKLEOTIDKONJUGAT, DERAS EGENSKAPER OCH ANVÄNDNING 02.00.10 – Bioorganisk kemi Abstrakt för doktorsexamen i 20 kemiska ämnen. 2 Arbetet utfördes i Interleukin Genetic Engineering Group, Laboratory of Gene Expression Mechanisms, Laboratory of Nucleic Acid Chemistry, Laboratory of Organic Synthesis and the Group...”

Transkript

1 NOVOSIBIRSK STATE UNIVERSITY Naturvetenskapliga fakulteten Institutionen för analytisk kemi Kursuppgifter Förutsägelse av retentionsvolymer och UV-spektra av peptider i omvänd fas HPLC. Slutförd av: Kuchkina A.Yu., gr. 147 Vetenskaplig handledare: Ph.D. Azarova I.N. Novosibirsk-2005

2 INNEHÅLL 1. Inledning Litteraturöversikt 2.1. Peptider. Aminosyror av HPLC-peptider Förutsägelse av retentionsvolymer och UV-spektra för peptider i RP HPLC Experimentell del Resultat och diskussion om dessa 4.1. Övervakning av det kromatografiska systemets stabilitet Beräkning av peptidretentionsvolymer Linjär "kompositionsretention"-modell Icke-linjär "kompositionsretention"-modell Beräkning av UV-spektra av peptider Slutsatser Litteraturbilaga

3 1. INLEDNING Identifiering av proteiner som fungerar i levande celler baserat på känd information om genomets struktur, proteomik, anses vara en av modern molekylärbiologis viktigaste uppgifter. Detta problem har uppstått efter den fullständiga dechiffreringen av genomen för vissa organismer under de senaste åren. Det visade sig att genom kodar för många fler proteiner än vad kroppen producerar dem. Identifiering av proteinet av intresse i summan av alla proteiner är en komplex metodologisk uppgift, som i regel inte kan lösas med en direkt metod. Ett av tillvägagångssätten för att lösa denna typ av problem, som kallas peptidomics, är att summan av proteiner hydrolyseras med ett specifikt proteas, och summan av de resulterande peptiderna separeras genom kapillärelektrofores eller högpresterande vätskekromatografi (HPLC). Det slutliga målet är att detektera en peptid (peptider) med en känd struktur, som är (är) a priori ett fragment av ett protein som kodas av genomet hos organismen som studeras. Om en eller flera sådana peptider detekteras i ett prov dras slutsatsen att proteinet produceras av kroppen. Metodproblem som uppstår vid lösning av problem av detta slag kan delas in i 2 grupper. Det första problemet är att separera en blandning, vanligtvis bestående av flera tusen peptider. Den andra är bestämning av strukturen för de isolerade individuella peptiderna. Separationsproblemet löses genom att fraktionera primärblandningen följt av separering av de separerade fraktionerna i individuella komponenter. Det andra problemet löses huvudsakligen med masspektrometriska metoder, som i slutändan gör det möjligt att bestämma molekylmassorna för enskilda komponenter (peptider). Om en peptid har en ganska "unik" struktur (en uppsättning aminosyror) - dessa inkluderar vanligtvis långa (mer än aminosyrarester) peptider - så kommer dess molekylvikt också att vara "unik", och sannolikheten för felaktig identifiering blir försumbar . Eftersom peptidseparationsproceduren syftar till att isolera en peptid med en känd uppsättning aminosyror, uppstår frågan: är det möjligt att förutsäga tidpunkten för frisättning av en sådan peptid från HPLC-kolonnen, med kännedom om dess aminosyrasammansättning? Detta tillvägagångssätt demonstrerades först i början av 80-talet. Målet med denna studie var att utveckla en metod för att förutsäga retentionsvolymerna av peptider på en Milichrom A-02-kromatograf i omvänd fas HPLC (RP HPLC)-läge med användning av en mobil fas lämplig för direkt injektion i masspektrometern. 3

4 2. LITTERATURGRANSKNING 2.1. Peptider. Aminosyror Peptider är biopolymerer byggda av α-aminosyrarester kopplade till varandra genom peptidbindningar (-NH-CO-). Den allmänna formeln för en peptid kan presenteras enligt följande: NH 2 CH CO NH CH CO... NH CH R 1 R 2 Rn Det finns ingen tydlig gräns mellan proteiner och peptider, som regel inkluderar peptider biopolymerer som inte innehåller mer än 100 aminosyrarester. Aminosyror är alla organiska syror vars molekyler innehåller en aminogrupp; detta namn betyder ofta α-aminosyror, eftersom de har en viktig biologisk betydelse. Molekylerna av de flesta naturliga aminosyror som utgör proteiner har den allmänna formeln H 2 NCH R Som framgår av strukturformeln skiljer sig aminosyror (med undantag för prolin) från varandra endast i strukturen av sidokedjan R Aminosyror är amfotera föreningar, eftersom deras molekyler innehåller både en sur karboxylgrupp och en basisk aminogrupp. I en starkt sur miljö är karboxylgruppen övervägande odissocierad, och aminogruppen är protonerad. I en starkt alkalisk miljö är aminogruppen i form av en fri bas och karboxylgruppen är i form av en karboxylatanjon. I det kristallina tillståndet finns aminosyror i form av en zwitterjon, där en proton från karboxylgruppen överförs till aminogruppen. Endast 20 aminosyror är involverade i biosyntesen av naturliga peptider och proteiner. Aminosyror och deras egenskaper anges i tabell 1. Tabell 1. Aminosyror och deras egenskaper. Aminosyranamn Kod Struktur p a - -NH 2 -R Glycin G H 2,35 9,78 Alanin AH 3 C 2,35 9,87 Valin V H 3 C CH CH 3 2,29 9,74 4

5 Namn på aminosyra Kod Struktur p a - -NH 2 -R Leucin L H 3 C CH CH 3 2,33 9,74 Isoleucin I H 3 C * CH CH 3 2,32 9,76 H 2 C Prolin P HC NH 1,95 10,64 Fenylalanin NH 9 W 20,1 CHP N H 20 10,64 Fenylalanin NH9. 2 2,46 9,41 Tyrosin Y HO CH NH 2 2,20 9,21 10,46 Serin S HO 2,19 9,21 Treonin T HO * CH CH 3 2,09 9,10 Cystein C HS 1,92 10,70 8. OC 9. 9. OC 9. Glutaminsyra E HOOC 2,10 10,47 4,07 Asparagin N H 2 N C O 2,14 8,72 Glutamin Q H 2 N C O 2,17 9,13 Lysin K H 2 N 2,16 9,06 10,54 Arginin R H 2 N C NH 1,82 8,99 12,48 NH Histidin H 2 NH 9, H 3 3 M H 3 M 0 4, C H 3 M H 3 .13 9,28 5

6 Beroende på sidokedjornas karaktär delas aminosyror in i två grupper: aminosyror med opolära (hydrofoba) alifatiska eller aromatiska R-grupper; aminosyror med polära (hydrofila) R-grupper. Den första gruppen inkluderar 8 aminosyror: alanin, valin, leucin, isoleucin, metionin, prolin, fenylalanin, tryptofan. Sju aminosyror innehåller grupper i sidokedjan som kan ha en negativ eller positiv laddning: asparaginsyra och glutaminsyra är negativt laddade vid pH 7,0; lysin, arginin, histidin är basiska aminosyror vars sidokedjor kan vara positivt laddade; under alkaliska förhållanden kan tyrosin- och cysteinsidogrupperna i HPLC-peptider vara negativt laddade. Separationen av blandningar av peptider är en mycket svår uppgift. För närvarande är RP HPLC den viktigaste metoden för att separera peptider. Peptider är polära ämnen, som förhindrar deras interaktion med den hydrofoba ytan av den stationära fasen och leder till interaktion med kvarvarande silanolgrupper. För att minska interaktionen med silanolgrupper tillsätts starka syror eller salter till eluenten. För att minska peptidernas polaritet bör kromatografi utföras vid låga pH-värden (under 3). Om dessa principer följs visar sig HPLC vara en mycket flexibel metod för att separera peptider. Detta beror på det faktum att denna metod kännetecknas av en hög separationshastighet, reproducerbarhet av resultat och förmågan att analysera mikrogrammängder av ämnen. En annan fördel med RP HPLC är förmågan att samla fraktioner i en liten volym av flyktiga lösningsmedel, vilket förenklar ytterligare masspektrometrisk analys. Som regel används 0,1 % trifluorättiksyra och myrsyror som flyktiga lösningsmedel. Trifluorättiksyra är transparent i UV-området upp till 205 nm, vilket är en stor fördel vid kromatografi av komplexa blandningar. Dessutom är peptiderna mycket lösliga i trifluorättiksyra. Eluering av peptider från omvända faser utförs vanligtvis i en gradientmod med tillsats av en organisk modifierare. Det vanligaste organiska modifieringsmedlet är acetonitril. Den är transparent i UV-området upp till 200 nm och har god selektivitet. 6

7 En annan faktor som driver den utbredda användningen av RP HPLC för analys av peptider är förmågan att förutsäga deras kromatografiska beteende Förutsägelse av retentionsvolymer och UV-spektra av peptider i RP HPLC Tanken att det kromatografiska beteendet hos peptider som innehåller mindre än 25 aminosyrarester kan förutsägas genom att känna till dem aminosyrasammansättning, först angavs av J. Meek. Retentionen av peptider i den omvända fasen bestäms av hydrofobiciteten hos aminosyraresterna som ingår i deras sammansättning. Aminosyror med aromatiska eller stora alifatiska kedjor är de största bidragsgivarna till retention. Baserat på ovanstående föreslog Meek att man skulle beräkna retentionsvolymerna för peptider i omvänd fas som summan av bidragen från aminosyraresterna som utgör peptiden. Han föreslog en linjär (additiv) "kompositionsretention"-modell: V R = V 0 + Z N* + Z C* + Z i (1) där V R peptidretentionsvolymen, v 0 är kolonnens fria volym; ZN* och ZC* är bidragen från fria -NH2 respektive - eller modifierade terminala grupper av peptiden; Zi är bidraget från den i:te aminosyran (retentionskonstant). Meek kromatograferade 25 peptider under gradient-RP-HPLC-förhållanden och, löste det omvända problemet, beräknade aminosyraretentionskonstanterna. Korrelationskoefficienterna för beroendet V R (beräknat)=f(v R (exp.)) var 0,997 (vid ph 2,1) och 0,999 (vid ph 7,4). Trots de höga korrelationskoefficienterna motsäger denna modell den fysiska innebörden, eftersom aminosyraretentionskonstanterna som erhålls på detta sätt inte reflekterar verkliga skillnader i deras hydrofobicitet och vissa av bidragen har negativa värden. Dessutom finns det många fakta enligt vilka, med en ökning av antalet aminosyrarester i en peptid, ökar ytan av dess hydrofoba kontakt med den omvända fasen, som bestämmer retention, olinjärt. Författarna till arbetet gjorde också antagandet att retentionsvolymerna för peptider beräknas från summan av bidragen från aminosyrarester. För att beräkna retentionsvolymerna för peptider föreslog de följande modell: V R = A* ln (1+ Z j * n j) + B (2) 7

8 där Zj är den empiriska retentionsparametern, vilken beräknas baserat på aminosyrornas hydrofobicitet; A- och B-konstanter; nj är antalet aminosyrarester j i peptiden. Denna modell ger en bra korrelation mellan beräknade och experimentella peptidretentionsvolymer. Nackdelen med modellen är att den endast är giltig för ett specifikt kromatografiskt system (linjär gradient med en given lutning, fast flödeshastighet, mobila och stationära faser). Således är tillämpningen av denna modell mycket begränsad. Därför föreslog författarna till det undersökta arbetet en annan modell baserad på teorin om gradienteluering, som gör att man kan beräkna retentionsvolymerna av peptider för ett bredare spektrum av kromatografiska system. Med tanke på att det tillgängliga området för hydrofob kontakt mellan peptiden och den stationära fasen varierar i proportion till dess molekylvikt till styrkan 2/3, valde författarna en funktion för att beräkna retentionsvolymerna för peptider: V R = f (3) där a, b, c är konstanter beroende på egenskaperna hos ett speciellt kromatografisystem bestämdes experimentellt från kromatografidata för 15 peptider valda för detta ändamål. Korrelationskoefficienten för beroendet V R (beräknad)=f(v R (exp.)) var 0,98. En betydande nackdel som begränsar användningen av denna metod är behovet av att beräkna konstanterna a, b och c för ett specifikt kromatografiskt system från preliminära experiment med modellpeptider, vilket är en mycket arbetskrävande procedur. Arbetet beräknade retentionsvolymerna och UV-spektra för peptider med en känd aminosyrasekvens, efter att tidigare bestämt bidragen från aminosyror till ovanstående parametrar. Värdena för dessa bidrag hittades experimentellt från kromatogram av lösningar av individuella aminosyror erhållna genom fotometrisk detektion med flera våglängder under samma förhållanden som peptiderna kromatograferades under. Författarna till arbetet föreslog följande ekvation för att beräkna retentionsvolymerna för peptider: V R = 209 [(Z i) + Z C*+N* + V 0 ] 1/3 990 (4) där Z i är retentionskoefficienten för aminosyra "i"; V 0 fri volym av kolonnen; Z C*+N* är den totala retentionskonstanten för de terminala grupperna av peptiden. Vid beräkning av peptidernas UV-spektra betraktades peptidens spektrum som summan av spektra av alla dess strukturella element. För att testa den föreslagna metoden fanns det 8

9 kromatograferades 30 peptider och korrelationskoefficienten mellan de beräknade och experimentellt funna retentionsvolymerna var 0,95. Den föreslagna metoden för att beräkna UV-spektra för peptider har också tillfredsställande prediktiv förmåga. I detta arbete användes acetonitril och en vattenlösning av litiumperklorat (0,2 M LiCLO M HClO 4), som är en icke-flyktig substans, som elueringsmedel, vilket gör efterföljande masspektrometrisk identifiering av peptider mycket svår. Därför verkade det lämpligt för oss att utveckla en metod som använder en mobil fas av kompositionen acetonitril - trifluorättiksyra, vars alla komponenter är flyktiga ämnen och inte stör masspektrometrisk analys. 9

10 3. EXPERIMENTELL HPLC utfördes på en Milichrome A-02-kromatograf på en 2x75 mm kolonn med ProntoSIL C 18 AQ-fas (Bischoff Analysentechnik und Geräte GmbH, Tyskland) under följande betingelser: elueringsmedel A: 0,01 M trifluorättiksyra; elueringsmedel B: acetonitril; linjär gradient: 40 min från 5 till 100 % B; flödeshastighet: 100 ul/min; kolonntemperatur: 40 C; detektion: vid 210, 220, 230, 240, 250, 260, 280 och 300 nm, τ = 0,18 s; provvolym: 4 µl. Lösning för att testa det kromatografiska systemet: KBr - 0,2 mg/ml; uridin - 0,2 mg/ml; koffein-1 mg/ml; m-nitroanilin - 0,1 mg/ml; o-nitroanilin-0,1 mg/ml; lösningsmedel 2% acetonitril i vatten. Alla reagenser med en massandel av huvudämnet på minst 98 %. Aminosyror (Serva, Tyskland), acetonitril "Grade 0" (NPF "Kriochrome", St. Petersburg) och vattenfri trifluorättiksyra (ICN Biomedicals, USA) användes i arbetet. Peptidprover tillhandahölls vänligen av V.V. Samukov (NPO "Vector", Novosibirsk) och I.V. Nazimov (IBCh RAS, Moskva). Koncentrationerna av aminosyror i de kromatograferade lösningarna var 0,2 1 mg/ml, peptider 0,1 2 mg/ml. Kromatogram bearbetades med användning av Multichrome-programmet (Ampersend JSC, Moskva). För att beräkna VR, områden med kromatografiska toppar när de detekterades vid 8 våglängder (S λ) och grafisk representation av peptidkromatogram, användes programmet "CHROM P" (ZAO Institute of Chromatography "EcoNova", Novosibirsk). Linjärisering av kurvan som visas i figur 1 utfördes med användning av Microsoft Excel-programmet (Microsoft Corporation). 10

11 4. RESULTAT OCH DISKUSSION DERAS 4.1. Övervakning av det kromatografiska systemets stabilitet Stabiliteten hos det kromatografiska systemet övervakades med användning av ett förfarande som reglerades av metodiken. Testlösningen kromatograferades och 14 parametrar beräknades från de resulterande kromatogrammen, som var och en kontrollerar en viss indikator på det kromatografiska systemet: VR-bromidjonfri volym av kolonnen; spektralförhållande S 280/S 250 för uridin, detektoravstämningsnoggrannhet i området från 250 till 280 nm; spektralförhållande S 260/S 280 koffein linjärt område för detektorn; spektralkvot S 260 /S 230 m - nitroanilins lämplighet för eluent A. O-nitroanilintoppen användes för att kontrollera: V R avvikelse för gradienten från en given form, spektralförhållanden, detektoravstämningsnoggrannhet i området från 210 till 300 nm, asymmetri av topp A 10% överträdelse i kolumnpackning, S 210 provdoseringsnoggrannhet. Periodiska mätningar av de kromatografiska och spektrala parametrarna för modelllösningen gjorde det möjligt för oss att verifiera reproducerbarheten av driften av det använda kromatografiska systemet. Testresultaten visas i Tabell 2. Tabell 2. Resultat av testning av det kromatografiska systemet, n = 8. Ämne Parameter 11 Medelvärde för parameter S r (%) Bromid V R, µl 148 1,0 Uridin S 280 /S 250 0,53 1,3 Koffein S 260 /S 280 0,73 0,6 m-nitroanilin S 260 /S 230 0,80 1,0 o-nitroanilin V R, µl,6 S 220 /S 210 1,71 0,5 S 230 /S 210 1,76 S 210 1,76. 260 /S 210 0,58 0,9 S 250 /S 210 0,40 1,4 S 280 /S 210 0,59 0,9 S 300 /S 210 0,32 1,2 A 10% 1,05 1,1 Utsignal (topparea) S .1p0 S .1p. ul 25,00 1,4

12 De erhållna värdena för S r tillåter oss att dra en slutsats om stabiliteten hos det beskrivna kromatografiska systemet. Beräkning av peptidretentionsvolymer De initiala kromatografiska data som krävs för att beräkna amerhölls från kromatogrammen för dessa aminosyror och peptiderna GG och GGG under de förhållanden som anges i avsnitt 3. Aminosyraretentionskoefficienter beräknade med hjälp av ekvationen: Z i = V Ri V 0 Z C*+N* (5) där V Ri är retentionsvolymen för aminosyran "i"; V 0 fri volym av kolonnen (retentionsvolym Br -, i detta kromatografiska system var den 148 ul); ZC+N är den totala retentionskonstanten för de terminala grupperna i peptiden. Z C+N beräknades med hjälp av ekvationen: Z C*+N* = V R (G) V 0 ((6) där V R (G) är retentionsvolymen för glycin, μL; V R (GGG) och v R (GG) är retentionsvolymerna för GGG- och GG-peptider, µl Summan av retentionskoefficienterna för ändgrupperna [(-NH 2) + (-CONH 2)] ansågs vara lika med summan av retentionskoefficienterna för grupperna [(- NH 2) + (-)]. Kromatografiska data och beräknade retentionskonstanter för peptidernas strukturella element ges i tabell 3. Tabell 3. Retentionsvolymer av aminosyror och peptider GG och GGG Retentionskonstanter för peptidernas strukturella element Kod V R , μl Z i, μl Kod V R, μl Z i, μl N P S V G M Q Y D I H L T F E W K GG C GGG A (C*+N*) end - 25 R

13 Linjär modell "sammansättningsretention" För att förutsäga retentionsvolymerna av peptider inom ramen för den linjära modell som föreslagits i arbetet, beräknade vi retentionsvolymerna för 28 peptider (tabell 4) och jämförde erhållna data med data som hittats experimentellt (Figur 1). Tabell 4. Experimentellt hittade och beräknade peptidretentionsvolymer (linjär modell). Peptid V R (exp.), µl V R (beräknat), µl 1 GG GGG AS GRGDS TKPR WAGGDASGE GL MY KPVGKKRRPVKVYP W-D-YGGDASGE W-D-AGGDA NCMLDY SYSMEHFRWG W-D-VGGDASGE YFRGGGFFLKFRRKY RPPGGFLK FLR YGGFM DRVYIHPF QATVGDINTERPGMLDFTGK ELYENKRPRRPYIL DRVYIHPFHL Y-D-AGFL RPKPQQFFGLM -NH PQQFFGLM-NH GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ-NH

14 V VR R(beräknad), µl VR(exp.), R µl Fig. 1. Jämförelse av experimentellt hittade och beräknade peptidretentionsvolymer. Beräkningen av VR-värden utfördes enligt ekvation (1). Som kan ses från de erhållna data ger den linjära modellen tillfredsställande resultat endast för relativt hydrofila peptider; för hydrofoba peptider är de beräknade värdena märkbart högre än de experimentella. Liknande resultat erhölls i arbetsmodellen för icke-linjär "sammansättningsretention" Linearisering av kurvan som visas i fig. 1 ger ekvationen: V R = 173 [(n Z i) + V 0 ] 1/3 785 (7) En jämförelse av de beräknade värdena och de experimentellt hittade retentionsvolymerna för 28 peptider visas i Tabell 5 och Fig.

15 V R (beräknad), µl VR VR (exp.), µl VR Fig. 2. Jämförelse av experimentellt hittade och beräknade peptidretentionsvolymer. Beräkningen av VR-värden utfördes enligt ekvation (7). 15

16 Tabell 5. Experimentellt hittade och beräknade peptidretentionsvolymer (icke-linjär modell). Peptid V R (exp.), µl V R (beräknat), µl 1 GG GGG AS GRGDS TKPR WAGGDASGE GL MY KPVGKKRRPVKVYP W-D-YGGDASGE W-D-AGGDA NCMLDY SYSMEHFRWG W-D-VGGDASGE YFRGGGFFLKFRRKY RPPGGFLK FLR YGGFM DRVYIHPF QATVGDINTERPGMLDFTGK ELYENKRPRRPYIL DRVYIHPFHL Y-D-AGFL RPKPQQFFGLM -NH PQQFFGLM-NH GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ-NH Korrelationskoefficienten för beroendet V R (beräknat)=f(v R (exp.)) var 0,96. Bilagan visar experimentella och beräknade kromatogram av en modellblandning av 11 peptider. 16

17 4.3. Beräkning av UV-spektra för peptider Specifika spektralkoefficienter för strukturella element i peptider togs från arbetet, eftersom I det kromatografiska system som vi använder försvåras den korrekta beräkningen av spektralförhållanden av systemiska toppar, såväl som dålig retention av hydrofila aminosyror och korta peptider. Värdena för de specifika spektrala koefficienterna anges i Tabell 6. Tabell 6. Spektralkoefficienter för UV-absorberande strukturella element av peptider som arean av kromatografiska toppar vid C = 1 mm och en provvolym på 4 μl, ( e.o.p. μl). λ, nm W F Y H C M R Q N E D N*+C* PS där S C*+N* spektrala koefficienter för summan av grupperna (-NH+ -) av peptiden, S PS absorption av peptidbindningen. De spektrala egenskaperna hos peptider som arean av deras kromatografiska toppar vid C = 1 mM och en provvolym på 4 μl beräknades med hjälp av ekvationen: en λ-peptid = a λ N*+C* + (m-1) a λ λ PS + a i (9) där m är det totala antalet aminosyrarester i peptiden, en λ N*+C* är den villkorade topparean för de terminala grupperna av peptiden, och λ PS är den specifika absorption av peptidbindningen vid våglängden λ λ, och i är de spektrala egenskaperna hos aminosyrarester för våglängden λ. De kvantiteter som ingår i ekvation (9) erhölls enligt följande. De specifika spektrala egenskaperna hos peptidernas strukturella element vid en våglängd λ=210 nm (a 210 i) beräknades som arean av deras kromatografiska toppar för en lösning med en koncentration av 1 mM och en provvolym på 4 μl enligt till ekvationen: a 210 i = a 210 AA a 210 N*+C *, (10) där a 210 AA är topparean för aminosyran; a 210 N*+C* är den konventionella topparean för de terminala grupperna av peptiden. Värdet på en 210 N*+C* togs lika med en 210 Leu, eftersom NH2-grupper är de enda Leu-kromoforerna i nm-våglängdsområdet. 17

18 Den specifika absorptionen av peptidbindningen (en 210 PS) beräknades som skillnaden mellan de specifika absorptionerna av GGG- och GG-peptiderna: a 210 PS = a GGG a GG (11) Spektrala egenskaper för våglängd λ beräknades med hjälp av ekvationen : a λ i = a 210 i (S λ /S 210), (12) där S λ /S 210 är spektralförhållandena för aminosyror och peptider GG och GGG, som är förhållandena mellan toppareor vid våglängderna λ till topparea vid X = 210 nm. Tabell 7 visar en jämförelse av de beräknade spektralförhållandena SX/S210 för 28 peptider med de som erhållits experimentellt. De experimentellt erhållna och beräknade spektralförhållandena för peptiderna överensstämmer ganska bra med varandra. I de flesta fall är skillnaderna inte mer än 0,06. För vissa peptider (5, 9, 12, 16, 18, 22, 23, 26, 27) observeras mer märkbara skillnader i förutsagda och experimentella spektralförhållanden. Orsakerna till dessa skillnader kräver ytterligare forskning. Tabell 7. Jämförelse av experimentella och beräknade värden av spektrala förhållanden av peptider. Peptidvärde Spektralförhållanden S λ /S 210 för våglängder λ(nm): Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp

19 Peptidvärde Spektralförhållanden S λ /S 210 för våglängder λ(nm): Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Calc Exp Calc Exp

20 Peptidvärde Spektralförhållanden S λ /S 210 för våglängder λ(nm): Vt Exp V V Exp Från erhållna data är det tydligt att den beskrivna metoden för att beräkna retentionsvolymerna för peptider med känd sammansättning och deras UV-spektra under gradientförhållanden RP HPLC har tillfredsställande prediktiv förmåga och kan vara användbar i studier som involverar separation av blandningar av peptider. 20

21 5. SLUTSATSER 1. En metod har utvecklats som gör det möjligt att förutsäga retentionsvolymerna av peptider med känd sammansättning i gradient RP HPLC-läge på en Milichrome A-02-kromatograf med användning av en flyktig mobil fas lämplig för direkt införande av isolerade fraktioner i en masspektrometer. 2. En metod har utvecklats för att beräkna den optiska absorptionen av peptider vid våglängder på 210, 220, 230, 240, 250, 260, 280 och 300 nm direkt i den mobila fasen som används för att separera peptider. 3. De utvecklade metoderna testades för 28 modellpeptider. Korrelationskoefficienten för de beräknade retentionsvolymerna med motsvarande experimentella värden var 0,96. Diskrepansen mellan de beräknade och experimentellt erhållna spektralförhållandena S λ / S 210 var inte mer än 0, REFERENSER 1. Reznikov V.A., Shteingarts V.D. Aminosyror. Novosibirsk: NSU, S. Dawson R., Elliott D., Elliott W., Jones K. Handbook of a biochemist. Moskva: Mir, sid. 3. Ovchinnikov Yu.A. Bioorganisk kemi. Moskva: Upplysning, ca. 4. Högpresterande vätskekromatografi i biokemi (redigerad av Henschen A.). Moskva: Mir, sid. 5. Meek J.L. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1980, V. 77. No.3. P Sakamoto Y., Kawakami N., Sasagawa T. // J. Chromatogr V P Sasagawa T., Okuyama T., Teller D.C. // J. Chromatogr V P Browne C.A., Bennet H.P.J., Solomon S. // Anal. Biochem V.124. P Meek J.L., Rossetti Z.L. // J. Chromatogr V P Azarova I.N., Baram G.I., Goldberg E.L. // Bioorganisk kemi. I pressen. 11. Masskoncentration av UV-absorberande ämnen. Metodik för att utföra mätningar med högpresterande vätskekromatografi. FR Irkutsk

22 7. Appendix Experimentella (A) och beräknade (B) kromatogram av en blandning av 11 peptider. Peptidtal i enlighet med Tabell A 0,5 e.o.p nm B nm Volym, µl

UTBILDNINGSMINISTERIET OCH VETENSKAP AV RYSKA FEDERATIONEN FEDERAL UTBILDNINGSMYNDIGHET NOVOSIBIRSK STATE UNIVERSITY Naturvetenskapliga fakulteten Institutionen: Analytisk kemi avhandling

Föreläsning 1: Primär struktur av proteiner - aminosyror 1 Mångfald av proteiner Många biologiska funktioner i kroppen utförs av proteiner. Dessa funktioner inkluderar transport och lagring av syre (hemoglobin

273 UDC 543. 544 SEPARATION AV DERIVAT-ENANTIOMERER AV AMINOSYROR PÅ AMINERAD β-cyklodextrin GENOM METOD FÖR HÖGPRESTANDA VÄTSKAKROMATOGRAFI I. A. Ananyeva, E. N. Shapovalova, S. O. A. Lopatin, S.

1. Kovalenta bindningar i proteiner och enzymer. Ge exempel. BILJETT 1 2. Vad är grunden för separation av proteiner genom fraktionering i närvaro av olika saltkoncentrationer. Vilka föroreningar tar denna metod bort?

Ämne 23. Aminer. Aminosyror och peptider Ämnesinnehåll: Aminer, deras klassificering och nomenklatur. Metoder för framställning och kemiska egenskaper hos aminer. Anilin, dess elektroniska struktur. Beroende av grundläggande egenskaper

T.P. Vavilova A.E. Medvedev Biologisk kemi Biokemi i munhålan Lärobok Utbildnings- och vetenskapsministeriet i Ryska federationen Rekommenderas av den statliga budgetutbildningsinstitutionen för högre yrkesutbildning "Första Moscow State Medical University uppkallad efter

Moscow Institute of Physics and Technology (State University) Institutionen för molekylär och biologisk fysik Fysiska forskningsmetoder Föreläsning 9 Vätskekromatografi Metoder och teknik

RYSSSKA FEDERATIONENS HÄLSOMINISTRET LÄKEMEDELSARTIKEL Indapamid FS.2.1.0017.15 Indapamid Indapamidum Ersätter FS 42-0303-08 N-[(2RS)-2-Methyl-2,3-indolhydro-1H-yl] 3-sulfamoyl-4-klorbensamid

AMINOSYROR. PEPTIDER. PROTEINER Aminosyror är karboxylsyror där en eller flera väteatomer är ersatta av aminogrupper i kolväteradikalen. Beroende på den relativa positionen

BIOCHEMI Redigerad av korresponderande ledamot av Ryska vetenskapsakademin, professor E.S. SEVERINA 5:e upplagan, reviderad och utökad Lärobok Rekommenderad av Educational and Methodological Association for Medical and Pharmaceutical

1 Aminosyror och proteiner Struktur, egenskaper Spiraler finns inom många områden: inom arkitektur, i makromolekyler av proteiner, nukleinsyror och även i polysackarider (Loretto hapel, Santa Fe, NM/ Sarbo)

UTBILDNINGSMINISTERIET OCH VETENSKAP AV DEN RYSKA federala statens autonoma utbildningsinstitution för högre utbildning "NOVOSIBIRSK NATIONAL RESEARCH STATE UNIVERSITY" Naturvetenskapliga fakulteten

APP NOTE-16/2016LC Analytiska möjligheter hos MaestroHPLC vätskekromatografen med en lågtemperaturdetektor för evaporativ ljusspridning MAESTRO ELSD med hjälp av exemplet att bestämma aminosyror i hydrolysat

8. Frågor 1. Definiera kromatografi. 2. Vilka egenskaper hos kromatografi gör det möjligt att uppnå bättre separation av ämnen med liknande egenskaper jämfört med andra separationsmetoder. 3. Lista

UTBILDNINGSMINISTERIET OCH VETENSKAP FÖR RF FEDERAL STATE BUDGET UTBILDNINGSINSTITUTET FÖR HÖGRE YRKESUTBILDNING ”NIZHNY NOVGOROD STATE TECHNICAL UNIVERSITY uppkallad efter R.E.

1 Funktioner för struktur, reaktivitet och metoder för syntes av aminosyror. Proteiner En förening som innehåller både en sur funktionell grupp och en aminogrupp är en aminosyra. Syra bas

Dra nytta av Agilent AdvanceBio SEC Size Exclusion Chromatography Kolumner för biofarmaceutisk analys Jämför kolumner från flera tillverkare för förbättrad datakvalitet Teknisk översikt

"Fabrikslaboratorium. Diagnostik av material" 4. 2007. Volym 73 23 UDC 543.544 BESTÄMNING AV AMINOSYROR I LÄKEMEDEL MED REVERSE FAS HPLC MED APEROMETRISK DETEKTION M. G.

UDC 615.22.074: 543.544.5.068.7.062 VALIDERING AV METODER FÖR KVANTITATIV BESTÄMNING AV TRIMETAZIDIN-DIHYDROKLORID I 0,02 g TABLETTER E. V. Kompantseva, G. A. State G. A. Martirossyva, G. A.

MODERN PREPARATIV FLASH KROMATOGRAFI Del 2* A. Abolin, Ph.D., "GalaKhim" [e-postskyddad] P.-F. Icarus, Interchim (Frankrike) Vi fortsätter att publicera material om moderna metoder för förberedelse

Bilaga till certifikat 44071 blad 1 om godkännande av typen av mätinstrument BESKRIVNING AV TYP AV MÄTINSTRUMENT Högpresterande vätskekromatografer ”Milichrome A-02”, ”Alphachrom A-02” (“Alphachrom A-02”)

STATLIG STANDARD FÖR RYSSLAND ÖSTSIBERISKA FORSKNINGSINSTITUTET FÖR FYSIKALISK-TEKNISKA OCH RADIOTEKNISKA MÄTNINGAR Certifiering CERTIFIKAT MVI 02-2002 Metodik för att utföra masskoncentrationsmätningar

AVSNITT 1 BESTÄMNING AV EVOLUTIONÄRA AVSTÅNDER OCH UTVECKLINGSHASTIGHETER FÖR AMINOSYRASEKVENSER 1.1. TEORETISK GRUNDLÄGGANDE Evolutionärt avstånd mellan aminosyrasekvenser (p, d) genomsnitt

01/2016:20255 2.2.55. PEPTIDMAPPLING Peptidkartläggning är en metod för att identifiera proteiner, särskilt de som produceras av rekombinant DNA. Metoden inkluderar kemisk eller enzymatisk

Ryska federationens ministerium för utbildning och vetenskap FEDERAL STATE BUDGET UTBILDNINGSINSTITUTION FÖR HÖGRE UTBILDNING "SARATOV NATIONELLA FORSKNINGSSTATE UNIVERSITY"

Konformation av proteiner: principer för bildning 1. Bindningar som bestämmer konformationen av proteinmolekyler kovalenta bindningar: peptiddisulfid icke-kovalenta interaktioner: joniska interaktioner vätebindning

FEDERAL BYRÅ FÖR UTBILDNING Statlig läroanstalt för högre yrkesutbildning “Ural State University uppkallad efter. A.M. Gorky" IONC "Ekologi och naturförvaltning"

RYSSSKA FEDERATIONENS HÄLSOMINISTRET LÄKEMEDELSARTIKEL Ketorolac trometamol FS.2.1.0022.15 Ketorolac trometamol Ketorolacum trometamolum Ersätter GF XII, del 1, FS 42-0242-07 (obenzoyl)-2,3-hydrogen-2,3-hydrogen. pyrrolysin-1-karboxylat

Moscow Institute of Physics and Technology (State University) Institutionen för molekylär och biologisk fysik Fysiska forskningsmetoder Föreläsning 8 Detektorer i kromatografi Vätskekromatografi

RYSSSKA FEDERATIONENS HÄLSOMINISTERIE LÄKEMEDELSARTIKEL Meloxicam FS.2.1.0025.15 Meloxicam Meloxicamum Istället för GF XII, del 1, FS 42-0254-07 4-Hydroxi-2-metyl-1,(3-metyl-thiazol) -2-yl)-l,l-dioxo-lX

NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF BELARUS RUE "RESEARCH AND PRACTICAL CENTRE OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF BELARUS FOR FOOD" INNOVATIV TEKNIK I LIVSMEDELSINDUSTRIN Material från XI International Scientific and Practical

ALLMÄNNA EGENSKAPER FÖR ARBETET Arbetets relevans För närvarande används metoden för högpresterande vätskekromatografi (HPLC) i stor utsträckning för att identifiera och bestämma innehållet av komplexa organiska ämnen

Validering av analysmetoder: praktisk tillämpning. Pisarev V.V., Ph.D., MBA, biträdande generaldirektör för Federal State Unitary Enterprise "State Scientific Center for Antibiotics", Moskva (www.pisarev.ru) Introduktion

2.2.29. HÖGPRESTANDA VÄTSKROMATOGRAFI Högpresterande vätskekromatografi (HPLC) är en separationsmetod baserad på olika fördelning av ämnen mellan två oblandbara

UTBILDNINGSMINISTERIET OCH VETENSKAP FÖR DEN RYSSISKA NATIONELLA FORSKNING TOMSK STATE UNIVERSITY KEMISKA FAKULTETET Kommenterat arbetsprogram för disciplinen Kromatografiska analysmetoder Utbildningens inriktning

Användning av Agilent Bond Elut Plexa-produkter för att minska jonundertryckning och förbättra vätskekromatografi-masspektrometri (LC-MS) Riktlinjer för känslighet Läkemedel

RYSSSKA FEDERATIONENS HÄLSOMINISTRET FARMACOPOEIAL ARTIKEL Karbamazepin FS.2.1.0020.15 Karbamazepin Ersätter FS 42-2803-96; Karbamazepinum istället för GF XII, del 1, FS 42-0240-07 5H-dibensazepin-5-karboxamid

Föreläsning 22 Aminosyror. Ekorrar Arbete är det bästa sättet att njuta av livet. I. Kant Nomenklatur för aminosyror. Naturliga aminosyror. Kiralitet av aminosyror som bildar proteiner. Syra-bas egenskaper,

APP NOTE-10/2016LC Analytiska möjligheter för MaestroHPLC vätskekromatograf med en diod array detektor och en fotometrisk detektor med fasta våglängder (LED) med hjälp av exemplet på bestämning

Kemiföreläsning 3 α-aminosyror, peptider, proteiner. Föreläsningen hålls av prof. Belavin Ivan Yuryevich 2. α-aminosyror, peptider, proteiner α-aminosyror proteiner bioregulatorer energikälla α-aminosyror heterofunktionella

Laborationer 11. MEKANISMER FÖR GRUNDLÄGGANDE MOLEKYLÄRGENETISKA PROCESSER Syfte med lektionen: att bli bekant med sammansättningen av DNA och RNA, processerna för replikering, transkription och translation med hjälp av exemplet att lösa typiska

APP NOTE-34/2018LC Analytiska möjligheter hos Maestro HPLC vätskekromatograf med en diod array detektor med hjälp av exemplet att bestämma innehållet av fenol- och furanföreningar i konjak enligt

Testa kombinationsläkemedel med fasta doser för orenheter med hjälp av Agilent 129 Infinity II HDR-DAD Impurity Analyzer-lösning

APP NOTERA-18/2017LC Analytiska möjligheter hos MaestroHPLC vätskekromatografen med en amperometrisk detektor med exemplet att bestämma katekolaminer i blodplasma Yashin A. Ya. Sc., ledande ingenjör

GOST R 51435-99 Äppeljuice, koncentrerad äppeljuice och drycker som innehåller äppeljuice. Metod för att bestämma patulinhalt med hjälp av högpresterande vätskekromatografi. OKS 67.160.20

RECENSION AV DEN OFFICIELLA OPPONITOREN om avhandlingen av Mikhail Vadimovich Shashkov "Studie av högpolära stationära vätskefaser baserade på joniska vätskor för kapillär gaskromatografi" för tävlingen

PEPTIDER, naturlig eller syntetisk. föreningar, vars molekyler är uppbyggda av a-aminosyrarester kopplade till varandra genom peptid (amid) bindningar C(O) NH. Molekylen kan också innehålla en icke-aminosyrakomponent (till exempel en kolhydratrest). Baserat på antalet aminosyrarester som ingår i peptidmolekyler särskiljs di-peptider, tripeptider, tetrapeptider etc. Peptider som innehåller upp till 10 aminosyrarester kallas. oligopeptider innehållande mer än 10 aminosyrarester polypeptider Pri-polypeptider med en mol. m. mer än 6 tusen namn. proteiner

Historisk referens. För första gången isolerades peptider från enzymatiska proteinhydrolysat. Termen "peptider" föreslogs av E. Fischer. Den första syntetiska peptiden erhölls av T. Curtius 1881. E. Fischer utvecklade 1905 den första allmänna metoden för syntes av peptider och syntetiserade ett antal oligopeptider. byggnader. Varelser E. Fischers elever E. Abdergalden, G. Leike och M. Bergman bidrog till utvecklingen av peptidkemin. År 1932 använde M. Bergman och L. Zer en bensyloxikarbonylgrupp (karbobensoxigrupp) i syntesen av peptider för att skydda a-aminogrupperna i aminosyror, vilket markerade ett nytt stadium i utvecklingen av peptidsyntes. De resulterande N-skyddade aminosyrorna (N-karbobensoxiaminosyror) användes i stor utsträckning för att erhålla olika peptider, som framgångsrikt användes för att studera ett antal nyckelproblem i kemin och biokemin hos dessa B-B, till exempel för att studera substratspecificiteten hos proteolytisk. enzymer. Naturliga peptider (glutation, karnosin, etc.) syntetiserades först med användning av N-karbobensoxiaminosyror. En viktig prestation på detta område utvecklades i början. 50-tal P. Vaughan et al syntes av peptider med användning av den blandade anhydridmetoden (metoder för peptidsyntes diskuteras i detalj nedan). 1953 syntetiserade V. Du Vigneault det första peptidhormonet, oxytocin. Baserat på konceptet med fastfaspeptidsyntes som utvecklades av P. Merrifield 1963, skapades automatiska sådana. peptidsyntes. Metoder för kontrollerad enzymatisk syntes av peptider har utvecklats intensivt. Användningen av nya metoder gjorde det möjligt att syntetisera hormonet insulin m.m.

Framgångar av syntetiska peptidkemi framställdes genom framsteg i utvecklingen av metoder för separation, rening och analys av peptider, såsom jonbyteskromatografi, nedbrytningselektrofores. media, gelfiltrering, högpresterande vätskekromatografi (HPLC), immunkemisk. analys etc. Metoder för att analysera ändgrupper och metoder för stegvis klyvning av peptider har också fått stor utveckling. I synnerhet skapades automatiska system. aminosyraanalysatorer och automatiska anordningar för att bestämma den primära strukturen av peptider - den så kallade. sequencers.

Peptidnomenklatur. Aminosyrarester av peptider som bär fri. a-aminogrupp, kallad N-terminal, och transportören är gratis. a-karboxylgrupp - C-terminal. Peptidnamnbildkommer från namnet. aminosyraresterna inkluderade i dess sammansättning, listade sekventiellt, utgående från den N-terminala. I det här fallet används triviala namn. aminosyror, där ändelsen "in" ersätts med "sil"; exkludering av den C-terminala resten, kallad som sammanfaller med namnet. motsvarande aminosyra. Alla aminosyrarester som ingår i peptiderna är numrerade med början från N-terminalen. För att registrera den primära strukturen av peptider (aminosyrasekvens) används beteckningar med tre bokstäver och en bokstav för aminosyrarester i stor utsträckning (till exempel Ala Ser -Asp Phe -GIy alanyl-seryl-asparagyl-fenylalanyl-glycin).

Strukturera. Peptidbindningen har egenskaperna hos en delvis dubbelbindning. Detta manifesteras i en minskning av längden på denna bindning (0,132 nm) jämfört med längden på en enkel CN-bindning (0,147 nm). Den delvis dubbelkopplade naturen hos peptidbindningen gör det omöjligt att fritt rotation av substituenter runt den. därför är peptidgruppen plan och har vanligtvis en trans-konfiguration (f-la I). Således är ryggraden i peptidkedjan en serie stela plan med en rörlig (”gångjärn”) led på den plats där de asymmetriska delarna är belägna. C-atomer (i fas I anges med en asterisk).

I peptidlösningar observeras den föredragna bildningen av vissa konformers. När kedjan förlängs får ordnade element i den sekundära strukturen (a-helix och b-struktur) mer uttalad stabilitet (liknande proteiner). Bildandet av en sekundär struktur är särskilt karakteristiskt för vanliga peptider, i synnerhet polyaminosyror.

Egenskaper. Oligopeptider liknar aminosyror i egenskaper, polypeptider liknar proteiner. Oligopeptider är vanligtvis kristallina. ämnen som sönderdelas vid upphettning. upp till 200 300 0 C. De är vällösliga. i vatten, utspädd. to-takh och alkalier, nästan ingen sol. i org. r-återförsäljare. Undantag: Oligopeptider byggda av hydrofoba aminosyrarester.

Oligopeptider har amfotära egenskaper och kan, beroende på miljöns surhet, existera i form av katjoner, anjoner eller zwitterjoner. Grundläggande Absorptionsbanden i IR-spektrumet för NH-gruppen är 3300 och 3080 cm-1, för C=O-gruppen 1660 cm-1. I UV-spektrumet är absorptionsbandet för peptidgruppen i området 180-230 nm. Isoelektrisk punkten (pl) för peptider varierar kraftigt och beror på sammansättningen av aminosyrarester i molekylen. PKa-värdena för peptiderna är ca. 3, för en -N H2 ca. 8.

Chem. Egenskaperna hos oligopeptider bestäms av de funktioner de innehåller. grupper, såväl som egenskaper hos peptidbindningen. Deras kemi. omvandling till medel. är åtminstone liknande de motsvarande aminosyraförhållandena. De ger mig den. biuretreaktion och ninhydrinreaktion. Dipeptider och deras derivat (särskilt estrar) cykliserar lätt för att bilda diketopiperaziner. Under påverkan av 5,7 n.

saltsyrapeptider hydrolyseras till aminosyror inom 24 timmar vid 105°C.

Syntes. Chem. peptidsyntes innebär att skapa en peptidbindning mellan COOH-gruppen i en aminosyra och NH 2 i en annan aminosyra eller peptid. I enlighet med detta särskiljs karboxyl- och aminkomponenter i peptidsyntesprocessen. För att utföra riktad, kontrollerad syntes av peptider är det nödvändigt att preliminärt. tillfälligt skydd av alla (eller vissa) funktioner. grupper som inte deltar i bildandet av en peptidbindning, och även preliminärt. aktivering av en av komponenterna i peptidsyntes. Efter fullbordande av syntesen avlägsnas skyddsgrupperna. Vid erhållande av biologiskt aktiva peptider är ett nödvändigt villkor att förhindra racemisering av aminosyror i alla stadier av peptidsyntes.

Naib. viktiga sätt att bilda en peptidbindning när man utför r-tion i r-re-metoder aktiverande. etrar, karbodiimid, blandade anhydrider och azidmetoden.

Metoden för aktiverade estrar är baserad på för- bildningen av ett esterderivat av karboxylkomponenten genom att införa i den en alkoholrest innehållande en stark elektronbortdragande substituent. Som ett resultat bildas en mycket reaktiv ester, som lätt utsätts för aminolys under inverkan av aminokomponenten i peptidsyntesen. Som aktivator estrar vid syntesen av peptider, penta-fluor-, pentaklor-, triklor- och n-nitrofenyl och ett antal andra estrar av skyddade aminosyror och peptider används i stor utsträckning.

Karbodiimidmetoden för peptidbindningsbildning involverar användningen av sönderdelning. substituerade karbodiimider. Dicyklohexylkarbodiimid används särskilt i stor utsträckning vid syntes av peptider:

X och Y-resp. N- och C-skyddsgrupper Med detta kondenserande reagens är det möjligt att syntetisera peptider i vattenhaltiga medier, eftersom hydrolys- och aminolyshastigheterna för den mellanbildade O-acylisourean (II) skiljer sig markant. Olika föreningar används också vid syntes av peptider. vattenlösliga karbodiimider (till exempel N-dimetylaminopropyl-N"-etylkarbodiimid).

Den blandade anhydridmetoden bygger på förbehandling. aktivering av karboxylkomponenten i peptidsyntes genom bildning av en blandad anhydrid med en karboxylsyra eller inorg. WHO. Naib. alkylestrar av kloromyrföreningar (kolklorid) används ofta, speciellt etyl- och isobutyletrar, till exempel:

B - tertiär amin

När man syntetiserar peptider med denna metod är blandade anhydrider av N-acylaminosyror och pivaliska (trimetylättiksyror) mycket effektiva. Tack vare den starka putten. På grund av den induktiva effekten av tert-butylgruppen reduceras elektrofiliciteten hos karboxylatomen C i pivalinsyraresten avsevärt, och detta, tillsammans med den steriska. hinder, undertrycker oönskade kollateral bildning av uretan och fri. N-acylaminosyror, kanter utförs enligt schemat:

I en variant av den blandade anhydridmetoden används 1-etoxikarbonyl-2-etoxi-1,2-dihydrokinolin som kondensationsmedel. Detta är kopplingen. bildar lätt en mellanprodukt med karboxylkomponenten i peptidsyntes. blandad anhydrid, som snabbt kommer in i kondensationslösningen, och oönskade ämnen elimineras helt. sidofördelning.

Ett specialfall av den blandade anhydridmetoden är den symmetriska metoden. anhydrider, i vilka aminosyraanhydrider 2 O. Deras användning eliminerar risken för disproportionering eller felaktig aminolys.

Azidsyntesmetoden involverar aktivering av karboxylkomponenten genom att omvandla den till aziden av en N-substituerad aminosyra eller peptid:

På grund av azidernas instabilitet är de fria. form från lösningen, som regel, är inte isolerad. Om istället för alkalimetallnitrit används alkyletrar av kvävehaltiga föreningar (till exempel tert-butylnitrit) för lösningen med hydrazid, kan azidkondensation utföras i org. r-ritele; den resulterande HN3 är bunden med tertiära aminer. Azidkondensering kompliceras ofta av oönskade komplikationer. bireaktioner (omvandlar hydrazid inte till azid, utan till amid; lösninghydrazid med azid, vilket leder till bildningen av 1,2-diacyl-hydrazin; intermittent bildning av isocyanat, som till följd av Curtius-omläggningen kan leda till ett ureaderivat eller motsvarande uretan etc.). Fördelarna med azidmetoden är en låg grad av racemisering, möjligheten att använda serin och treonin utan att skydda hydroxylgrupper.

Att transformera skyddade peptider omvandlas till fria peptider med hjälp av speciella metoder för avblockering, som är baserade på lösningar som säkerställer att sönderdelningen lossnar. skyddsgrupper som garanterar bevarandet av alla peptidbindningar i molekylen. Exempel på avblockering: avlägsnande av bensyloxikarbonylgruppen i katalysatorn. hydrogenolys vid atm. tryck och rumstemperatur, eliminering av tert-butyloxikarbonylgruppen genom mild acidolys, såväl som hydrolytisk. klyvning av trifluoracetylgruppen under inverkan av utspädd. grundlösningar.

Vid syntetisering av biologiskt aktiva peptider är det viktigt att racemisering inte sker, kanter kan uppstå som ett resultat av den reversibla elimineringen av H+ från a-atomen C i en N-acylaminosyra eller peptid. Racemisering främjas av baser och föreningar, höga temperaturer och polära föreningar. Den avgörande rollen spelas av racemisering, katalyserad av baser, som kan ske genom den sk. azlaktonmekanism eller genom enolisering enligt följande schema:

Naib. viktiga sätt att undvika racemisering: 1) förlängning av peptidkedjan i riktning från C-terminalen till N-terminalenmed användning av N-skyddande grupper såsom ROC(O). 2) Aktivering av N-skyddade peptidfragment med C-terminala prolin- eller glycinrester. 3) Användning av azidmetoden (i frånvaro av överskott av tertiär bas och upprätthållande av låga temperaturer i reaktionsmediet). 4) Applikationsaktiv. aminosyraestrar, vars aminolys fortskrider genom ett övergångstillstånd, stabilisator. vätebryggor (till exempel estrar bildade med N-hydroxipiperidin och 8-hydroxikinolin). 5) Användning av karbodiimidmetoden med tillsatser av N-hydroxiföreningar. eller Lewis kontor.

Tillsammans med syntesen av peptider i lösningar är syntesen av peptider med användning av olösliga bärare viktig. Det inkluderar peptidsyntes i fast fas (Maryfield-metoden, eller metod) och peptidsyntes med användning av polymerreagens.

Strategin för peptidsyntes i fast fas involverar tillfällig fixering av den syntetiserade peptidkedjan på en olöslig polymerbärare och utförs enligt följande schema:

Tack vare denna metod var det möjligt att ersätta mycket komplexa och arbetskrävande procedurer för separation och rening av intermediärer. peptider genom enkla tvätt- och filtreringsoperationer, samt reducering av processen för peptidsyntes till en standardsekvens av periodiskt upprepade procedurer som lätt kan automatiseras. Merrifields metod gjorde det möjligt att avsevärt påskynda processen för peptidsyntes. Baserat på denna metod, olika typer av typer automatiska peptidsyntes.

Anslutningen är mycket produktiv. fastfassyntes av peptider med separeringsförmågan hos preparativ HPLC ger tillgång till en kvalitativt ny nivå av kemi. syntes av peptider, vilket i sin tur har en gynnsam effekt på utvecklingen av olika. områden inom biokemi, säger de. biologi, genteknik, bioteknik, farmakologi och medicin.

Strategin för syntes av peptider med användning av polymerreagens involverar tillfällig bindning till hög molekylvikt. bäraren aktiverad karboxylkomponent eller kondensationsmedel för peptidsyntes. Fördelen med denna metod är att reagens fästa till polymeren kan införas i överskott, och separationen av syntetiserade peptider från olösliga polymerer är inte svår.

Ett exempel på en sådan syntes är att föra aminokomponenten i en given sekvens genom flera. kolumner, som var och en innehåller en polymer bunden

Sammanfattning

Granskningen fokuserar på studier av farmakokinetik och biotillgänglighet vid framställning av nya originalläkemedel med peptidstruktur. Mycket uppmärksamhet ägnas åt metoder för kvantitativ bestämning av peptidföreningar i biomaterial, studiet av deras farmakokinetiska egenskaper, faktorer som påverkar biotillgängligheten av dessa substanser och vissa farmakokinetiska data om läkemedel med en peptidstruktur som introduceras i medicinsk praxis.

Nyckelord: farmakokinetik, korta peptider, biotillgänglighet, hjälpämnen

Introduktion

Ångestsyndrom är psykiska störningar som kännetecknas av allmän ihållande ångest, patologisk rädsla, spänningar och nervositet. För närvarande varierar förekomsten av sjukdomar associerade med ångeststörningar från 13,6 till 28,8 % i västländer och ökar ständigt på grund av den höga livstakten, miljömässiga och sociala spänningar.

På grund av den betydande ökningen av sjukdomar associerade med ångest och depressiva störningar är utveckling och implementering av nya anxiolytiska läkemedel relevant. Idag representeras läkemedel som har en sådan farmakologisk effekt främst av en grupp bensodiazepinföreningar, som kännetecknas av trötthet, dåsighet, minnesförsämring, mentalt och fysiskt drogberoende och abstinenssyndrom, vilket minskar patienternas livskvalitet. Ett sådant anxiolytikum, utan dessa biverkningar, är läkemedlet afobazol. Ovanstående bekräftar behovet av att söka efter andra mycket effektiva läkemedel som är fria från biverkningar av bensodiazepiner. Vetenskapen ägnar stor uppmärksamhet åt endogena peptider. Hittills har den viktiga rollen för den endogena neuropeptiden kolecystokinin i patogenesen av ångeststörningar fastställts. Det är känt att kolecystokinin, som verkar på CCK-B-receptorer lokaliserade i det centrala nervsystemet, uppvisar ångestframkallande aktivitet - framkallar panikattacker, interagerar med opiatsystemet och kan därför ha en anti-analgetisk effekt. Det är också möjligt att kolecystokinin spelar en roll i patogenesen av depression och schizofreni.

Eftersom endogena neuropeptider har låg enzymatisk stabilitet, är föremål för hydrolys i mag-tarmkanalen och är aktiva först efter penetration genom BBB, fanns det ett behov av att söka efter potentiella anxiolytika (kolecystokininreceptorantagonister) med en mer kompakt och skyddad struktur som är effektiv när den administreras systemiskt.

Baserat på hypotesen utvecklad av Gudasheva T.A. redan 1985, om möjligheten att simulera strukturen av en icke-peptidprototyp med en viss neurotrop aktivitet, såväl som det aktiva fragmentet av den ursprungliga peptiden med liknande aktivitet, en ny dipeptidanxiolytisk GB-115 (N-fenyl-N) -hexanoyl-L-glycyl-L-amid) syntetiserades -tryptofan) är en retroanalog av kolecystokinin-4. Den farmakologiska aktiviteten av föreningen har fastställts: det har experimentellt bevisats att GB-115 uppvisar anxiolytiska, anti-alkohol, antidepressiva och smärtstillande egenskaper. Vid oral administrering visade GB-115 sin maximala anxiolytiska aktivitet vid en dos av 0,1 mg/kg. Läkemedlet stoppar den ångestframkallande reaktionen som induceras av etanoluttag vid en dos av 0,2 mg/kg, p.o. Maximal analgetisk aktivitet manifesteras vid en dos av 10 mg/kg, och en antidepressiv effekt vid en dos av 0,025-0,05 mg/kg, i.p.

Att genomföra experimentella farmakokinetiska studier av ett läkemedel är ett nödvändigt steg för att det ska kunna främjas vidare till medicinsk praxis. Förbättring av farmakokinetiska parametrar möjliggör skapandet av en optimal doseringsform som skulle särskiljas av lämplig grad och hastighet av absorption, fördelningsegenskaper, metabolismvägar och utsöndring. En bedömning av relativ biotillgänglighet gör att man kan välja till förmån för en doseringsform med de bästa farmakokinetiska parametrarna för den substans som studeras.

Farmakokinetik är en modern, snabbt växande vetenskap som studerar egenskaperna hos läkemedelspenetration i kroppen, distribution, biotransformation och eliminering. Studiet av dessa processer, inklusive deras kvantitativa bedömning, är huvudmålet för farmakokinetiken.

Farmakokinetisk studie av nya farmakologiskt aktiva substanser i experiment är ett obligatoriskt steg i forskningen, utvecklingen och implementeringen av dem i medicinsk praktik. Läkemedlets effektivitet beror direkt på processerna för absorption, distribution och utsöndring av läkemedel från kroppen.

Farmakokinetiska data gör det möjligt att bestämma administreringsvägen och administreringssättet, platsen för penetration av läkemedlet, den ungefärliga doseringsregimen, såväl som huvudvägarna för eliminering av läkemedel.

Absorption, distribution, metabolism och utsöndring av en läkemedelsförening är sammankopplade processer. Alla påverkas av många faktorer: absorptionshastigheten beror på läkemedlets doseringsform, koncentrationen av den aktiva substansen, pH-värdet i mediet i vilket ämnet är löst, tarmens motilitet och tillståndet på absorptionsytan. område. Indikatorerna för distribution och biotransformation av ett läkemedel påverkas av kön, ålder, det somatiska tillståndet hos patientens kropp, såväl som tillståndet i kroppens enzymsystem, vilket ofta beror på individuella skillnader. Således kan hastigheten för metabolism av vissa psykotropa läkemedel variera från 6 till 30 timmar hos olika patienter. Avlägsnandet av metaboliter från kroppen kan påverkas av samtidiga sjukdomar, såväl som påverkan av andra läkemedel.

För att bedöma de olika farmakokinetiska processerna för läkemedel i kroppen hos djur och människor, beräknas motsvarande farmakokinetiska parametrar, inklusive biotillgänglighet (F, %) - den del av läkemedelsdosen som når det systemiska blodomloppet efter dess extravaskulära administrering.

Det är viktigt att notera förutsättningarna för att genomföra farmakokinetiska experiment i prekliniska prövningar av nya farmakologiskt aktiva substanser.

De studerade farmakologiska medlen anses vara föremål för forskning, som i preklinisk praxis utförs på friska djur: råttor, möss, kaniner, hundar, apor och andra, vars vikt inte bör skilja sig från standarden för varje art genom att mer än 10%.

De huvudsakliga typerna av biologiskt material är blodserumplasma, helblod, olika organ och vävnader, urin, avföring.

Administreringsvägen bestäms av läkemedlets form, rekommenderat på grundval av farmakokinetiska studier för ytterligare farmakologisk studie. Administreringsmetoder kan vara olika: intravenös, intraperitoneal, intramuskulär, subkutan, oral, etc. Läkemedlet administreras oralt till djur med användning av ett svalg eller tolvfingertarmen på fastande mage för att undvika interaktion av läkemedlet med mat.

Administrering kan vara upprepad eller enstaka. Med en enda administrering är det nödvändigt att studera farmakokinetiken för den aktiva substansen med hjälp av minst tre dosnivåer. Detta är nödvändigt för att verifiera farmakokinetikens linearitet.

Varaktigheten av experimentet bör motsvara en tid 5 gånger längre än halveringstiden.

Antalet djur per punkt (motsvarande koncentrationsvärde) ska vara minst 5 om endast ett prov tas från varje djur från provet (vid försök på råttor vid halshuggning: ett djur - en poäng).

Ett av de viktiga stegen i den farmakokinetiska och biofarmaceutiska studien av en ny farmakologiskt aktiv substans är studien av dess absoluta och relativa biotillgänglighet (se avsnittet "Biotillgänglighet av läkemedel").

• Analytiska metoder för bestämning av peptider och deras derivat

Det finns olika metoder för kvalitativ och kvantitativ bestämning av aminosyror, peptider och deras derivat. Och det är nödvändigt att rimligen välja den optimala metoden för att analysera ett potentiellt läkemedel med en peptidstruktur. Detta kommer att tillåta oss att uppnå känslig analys och erhålla korrekta och reproducerbara resultat som skulle visa farmakokinetiken för en viss förening.

Klassificering:

• Vätskekromatografimetoder:

Tunnskiktsvätskekromatografi

Högpresterande vätskekromatografi

• Gaskromatografi
• Immunokemiska analysmetoder
• Kapillärelektrofores

1.2 Kromatografi av aminosyror och peptider

Kromatografi är en fysikalisk-kemisk metod för att separera komponenterna i en analyserad blandning, baserad på skillnaden i deras fördelningskoefficienter mellan två faser: stationär och mobil. De mest lovande kromatografimetoderna är: gaskromatografi (GC) och högpresterande vätskekromatografi (HPLC) i kombination med en masspektrometrisk detektor - GC-MS och HPLC-MS. Dessa metoder utvecklas i snabb takt, vilket är förknippat med tillväxten av uppgifter som har uppstått de senaste åren: proteomik, metabolomik, analys av biobränslen, bestämning av biomarkörer för sjukdomar, skapande och kvalitetskontroll av läkemedel, kvalitetskontroll och livsmedelssäkerhet , såväl som terrorism (bestämning av giftiga ämnen, skadliga ämnen och kombattanter) och snabbt fastställande av konsekvenserna av nödsituationer.

1.2.1 Vätskekromatografimetoder

1.2.1.1. Högpresterande vätskekromatografi

HPLC är en fysikalisk-kemisk metod för att separera komponenterna i en blandning av ämnen, baserat på deras olika fördelning mellan två oblandbara faser, varav den ena är rörlig och den andra orörlig. Beroende på polariteten hos de mobila och stationära fasen delas HPLC vanligtvis in i normalfas (den stationära fasen är mer polär än den mobila) och omvänd fas (den stationära fasen är mindre polär än den mobila).

Omvänd fas HPLC används oftare för att separera aminosyror och peptider på grund av det faktum att de flesta analyter är mycket lösliga i vattenhaltiga mobila faser och har begränsad löslighet i de flesta icke-polära lösningsmedel. Normalfas-HPLC används dock för kromatografi av kortkedjiga aminosyraderivat och peptider med låg hydrofobicitet, som inte bibehålls av den stationära fasen i omvändfas-HPLC. Omvänd fas-HPLC var guldstandarden för peptidseparation och rening före tillämpningen av masspektrometri inom detta område. RP-HPLC har följande fördelar jämfört med andra metoder för kromatografisk analys: reproducerbarhet av resultat, hög separationsförmåga, selektivitet (förmågan att differentiera peptider med en skillnad på en aminosyra), känslighet, hög utförandehastighet och användning av en liten volym flyktiga lösningsmedel.

Selektiviteten och kvaliteten på peptidanalys i omvänd fas HPLC beror på det korrekta valet av faser: mobil och stationär.

Som en stationär fas används adsorbenter, som är silikagel modifierade med olika klorsilanderivat. Denna fas har hög styrka och likgiltighet för organiska lösningsmedel. Den omvända fasen kännetecknas av egenskaperna hos matrisen - kiselgel och strukturen hos den ympade radikalen, som skiljer sig i sammansättningen och strukturen av kolfragmentet. Vid kromatografi av peptider bestäms valet av omvänd fas av peptidernas storlek och hydrofobicitet: för peptider med kort kedja används hydrofila peptider, faserna C8 (n-oktyl) och C18 (n-oktadecyl), för stora och hydrofoba sådana - fas C3 (trimetyl- eller dimetylpropyl), C4 (n-butyl), C6 (fenyl).

För att korrekt välja den mobila fasen är det nödvändigt att ta hänsyn till pH, sammansättning och koncentration av det organiska lösningsmedlet:

För att reducera polariteten hos peptiderna och säkerställa bättre retention av adsorbenten bör elueringsmedlets pH vara i intervallet 2-3. För att öka retentionstiden för peptider införs också så kallade modifierare eller jonparreagens (motjoner), som kan bilda jonpar med positivt laddade peptidgrupper, i den mobila fasen. Den huvudsakliga jonmodifieraren i RP HPLC är trifluorättiksyra. Det tas lätt bort från eluat genom avdunstning, löser peptider väl och är UV-transparent i den korta våglängdsregionen, vilket inte skapar ytterligare toppar under detektion. Myrsyra används också som modifierare och ger bra separation, men dess användning begränsas av stark absorption i UV-området.

Det organiska lösningsmedlets inverkan på den mobila fasens elueringsförmåga är mycket stor. Så elueringsstyrkan för lösningsmedlet ökar i följande ordning: vatten - metanol - acetonitril - etanol - dioxan - tetrahydrofuran - 2-propanol - 1-propanol. Denna sekvens beror på en minskning av polariteten hos organiska ämnen i denna serie. Acetonitril används oftast som en organisk komponent i den mobila fasen, eftersom den är transparent i UV-regionen upp till 200 nm, har låg viskositet, är mycket flyktig, vilket gör det möjligt att vid behov enkelt avlägsna det från det uppsamlade eluatet fraktion och kännetecknas av god selektivitet.

Separationen av peptidföreningar kan utföras under isokratiska betingelser, där koncentrationen av det organiska lösningsmedlet är konstant, eller genom gradienteluering, i vilket fall koncentrationen av det organiska lösningsmedlet ökar med tiden. Testämnena eluerar i den ordning de ökar hydrofobiciteten.

1.2.1.2. Metoder för att detektera peptider i högpresterande vätskekromatografi: UV-detektion, masspektrometri.

För att korrekt utföra kvalitativ och kvantitativ analys efter separation av medicinska substanser med HPLC, är det nödvändigt att använda utrustning för att detektera dem, som i sin tur har följande krav: detektorer måste ha hög känslighet (bra signal, inget brus), hastighet, brett linjärt dynamiskt omfång, stabilitet, brist på interaktion med den mobila fasen.

En av de vanligaste detektionsmetoderna vid högpresterande vätskekromatografi är ultraviolett, vilket förklaras av analysens höga känslighet, enkelhet och överkomlighet ur ekonomisk synvinkel. UV-detektion är dock en mindre känslig metod än masspektrometri. UV-detektorer representeras av fyra huvudtyper idag:

• med en fast våglängd;
• med en monokromator som låter dig ändra våglängder i sitt intervall;
• med en automatiskt avstämbar monokromator som tillåter multi-våglängd, multi-kanal detektion;
• diod-matrisdetektorer som gör det möjligt att erhålla full spektral information inom ett givet område.

På grund av närvaron av vissa kromoforer i sammansättningen av aminosyror, såväl som själva peptidbindningen, har det blivit möjligt att detektera peptidföreningar med hjälp av UV-strålning med en av de fyra typerna av utrustning som listas ovan.

Peptidföreningar kan absorbera UV-strålning i tre områden:

Över 250 nm (λ=280 nm), vilket beror på närvaron av aromatiska aminosyror i den analyserade föreningen - tryptofan (λ=278 nm), tyrosin (λ=275 nm) och fenylalanin.

Vid 210-250 nm kan en sådan signal ges av andra aminosyror med intra- och intermolekylära vätebindningar i proteinmolekyler.

Vid 190 nm, vilket förklaras av närvaron av peptidbindningar.

Detektering av föreningarna som studeras utförs dock inte vid våglängder under 210 nm på grund av inverkan av lösningsmedel som används i HPLC, som har sin egen absorption vid våglängder kortare än 210 nm, samt på grund av närvaron av föroreningar. Därför används ofta våglängdsområdet över 250 nm vid detektering av peptidsubstanser. Om föreningarna inte innehåller kromoforer som skulle absorbera UV-strålning i denna region, så tar de till derivatiseringsmetoden.

Derivatisering är den kemiska modifieringen av en analyt för att producera en derivatförening som har förbättrade analytiska egenskaper. När man arbetar med HPLC-UV genom derivatisering är det nödvändigt att erhålla en förening som är registrerad i UV-spektrumet i en region som är lämplig för analys av biologiskt material. Så i arbetet med Rudenko A.O. Vid bestämning av de viktigaste aminosyrorna i komplexa biologiska matriser användes en metod för derivatisering av 16 aminosyror. O-ftalaldehyd användes som ett derivatiseringsmedel.

Den masspektrometriska detekteringsmetoden består av tre steg: jonisering, mass-till-laddning-separation och efterföljande detektion med hjälp av en massanalysator. För analys av läkemedelsföreningar används "mjuka" joniseringstekniker: elektrosprayjonisering, såväl som matrisassisterad laserdesorption (MALDI). Dessa metoder representerar ett skonsamt joniseringsläge, vilket är särskilt viktigt för termiskt instabila biomolekyler. Dessa typer av jonisering är dock inte tillräckligt informativa, så de tar ofta till tandemmasspektrometri (MS/MS), en metod för att registrera fragment av analyter. För att vara mer exakt består denna metod av flera steg: först joniseras de analyserade föreningarna mjukt, passerar genom den första analysatorn, sedan ökar deras energi, på grund av vilket molekylerna som studeras fragmenteras och den andra analysatorn registrerar den resulterande massan spektrum.

För kvantitativ bestämning av nya läkemedelsföreningar används följande typer av massanalysatorer:

Quadrupole (massanalysator baserad på tre kvadrupoler), som är "guldstandarden" i studiet av nya medicinska föreningar;

Time-of-flight (TOF), när den används, uppnår lägre känslighet än när man använder trippelkvadrupolanalysatorer.

Joncyklotronresonans och orbitaljonfälla, som är högupplösta massanalysatorer och som än så länge sällan används på grund av den höga kostnaden och komplexiteten hos sådana enheter.

Användningen av masspektrometridetektion i kombination med HPLC har gjort det möjligt att uppnå höga analyshastigheter, öka detektionsgränsen för läkemedelsföreningar och avsevärt förbättra studiernas stabilitet och noggrannhet.

• Tunnskiktskromatografi

Idag används TLC i mycket mindre utsträckning eftersom mer högteknologiska metoder för peptidseparation har blivit tillgängliga, såsom HPLC, vätskekolonnkromatografi, jonbyteskromatografi, prooch kapillärelektrofores. TLC visade sig dock vara en kvantitativ, högteknologisk, relativt billig och lätt reproducerbar metod på sin tid. Tunnskiktskromatografi var populärt på 80-talet - aminosyror isolerades från växter, djur och olika biologiska vätskor.