Odling av virus i kycklingembryon. Odling på kycklingembryon Infektion i blodkärl CAO

De flesta kända virus har förmågan att föröka sig i kycklingembryot (Fig. 4). Embryon i åldern 8 till 14 dagar används, beroende på typ av virus, infektionsmetod och forskningsmål. Influensavirus odlas på 9-10 dagar, smittkoppsvacciner - på 12 dagar, påssjuka - i 7-dagars kycklingembryon. Reproduktion av viruset i kycklingembryon sker i olika delar av embryot, vilket beror på egenskaperna hos virusets tropism. Tekniken att odla ett virus i ett kycklingembryo används i stor utsträckning i industriell odling.

Strukturen hos ett kycklingembryo och metoder för dess infektion: 1 - in i amnion; 2 - in i allantoiska håligheten; 3 - i gulesäcken. (Microbiology and immunology. Redigerad av Vorobyov A.A. - M. - 1999).

Det yttersta extraembryonala membranet, som gränsar till skalet eller moderns vävnader och därför fungerar som en plats för utbyte mellan embryot och dess miljö, kallas Chorion. Hos äggläggande arter är korionens huvudsakliga funktion att utföra respiratoriskt gasutbyte. Hos däggdjur är chorion involverad i andning och näring, utsöndring, filtrering och syntes av ämnen. Hos primitiva organismer är chorion ett sekundärt membran, och i avancerade organismer är det fostrets membran. Kaviteten mellan chorion och amnion är chorioamnionhålan.

Amnion(grekisk amnion), fostersäck eller vattenmembran - ett av de embryonala membranen i embryon från reptiler, fåglar och däggdjur.

Evolutionärt uppstod amnion för att skydda embryon från att torka ut under utveckling utanför vattenmiljön. Därför klassificeras ryggradsdjur som lägger ägg (reptiler och fåglar), liksom däggdjur som härstammar från reptiler, som fostervatten (”Djur med ägghinnor”). De tidigare klasserna och superklasserna av ryggradsdjur (cefalochordates, cyclostomes, fiskar, amfibier) lägger ägg i vattenmiljön, så de kräver inte ett vattenskal. Dessa klasser av djur kombineras till gruppen anamni. Till skillnad från anamnia kräver fostervatten inte en vattenmiljö för reproduktion och tidig utveckling, därför är fostervatten inte fästa vid vattendrag. Detta är amnionens evolutionära roll.

Under däggdjurens födelse spricker vattenmembranet, vattnet rinner ut och resterna av amnion på den nyföddas kropp kallas ofta "skjortan", vilket har varit ett tecken på lycka och annan vidskepelse överallt sedan antiken gånger (därav i synnerhet det ryska ordspråket om de som var "födda i en skjorta").

Allantois (av grekiskan allantoeid?s - korvformad) är det embryonala andningsorganet hos högre ryggradsdjur; germinal membran som utvecklas från embryots baktarm. Dessutom är allantoisen involverad i embryots gasutbyte med miljön och frigörandet av flytande avfall. Allantois, tillsammans med andra embryonala membran - amnion och chorion, är en avgörande egenskap hos högre ryggradsdjur - däggdjur, fåglar och reptiler.

Hos oviparösa fåglar och reptiler utvecklas allantois runt embryot längs skalets väggar. I sitt yttre lager, som kallas mesoderm, skapar det ett omfattande nätverk av blodkärl genom vilka det interagerar med den yttre miljön. Hos däggdjur är allantois en del av navelsträngen.

Det finns flera sätt att infektera ett kycklingembryo under utveckling: på chorioallantoiska membranet, i allantois- och fostervattenhålorna, gulesäcken och embryots kropp.

Infektion av korioallantoiska membranet används för att isolera och odla virus som bildar plack på membranen (vaccinvirus, smittkoppor, herpes simplex). Före infektion undersöks äggen med ett ovoskop, och gränsen för luftrummet och det korioallantoiska membranet skisseras med en penna. Äggets yta ovanför luftrummet och på infektionsplatsen torkas med alkohol, bränns, behandlas med jod och ett hål görs i luftsäckens hålighet.

På infektionsplatsen avlägsnas skalet för att inte skada subshell-membranet, som sedan genomborras med en kort steril nål för att inte skada det korioallantoiska membranet. Luften från luftsäckens hålighet sugs ut. Viralt material (0,05 - 0,2 ml) appliceras på korioallantoisk membran med en tuberkulinspruta med en kort nål eller Pasteurpipett. Hålet i skalet täcks med ett sterilt täckglas eller samma utsågade bit av skalet och kanterna fylls med smält paraffin. Infekterade embryon placeras horisontellt på ett stativ och inkuberas i en termostat. Embryona dissekeras tidigast 48 timmars inkubation. På det infekterade membranet finns vitaktiga ogenomskinliga fläckar av olika former (plack).

Infektion i allantoishålan. Viruset som införs i allantois förökar sig i endodermala celler och passerar sedan in i allantoisvätskan. Infektion utförs på följande sätt: en punktering görs i skalet ovanför luftkammaren med spetsen av en skalpell eller sax, varefter en nål med en spruta förs in genom hålet i vertikal riktning, som passerar genom chorioallantoic membran och kommer in i allantoic kaviteten, materialet injiceras i en volym av 0,1 ml och hålet fylls med paraffin.

Infektion i gulesäcken. För detta ändamål används embryon 5 till 10 dagar gamla. De vanligaste är två infektionsmetoder. Enligt den första införs materialet genom luftrummet. Ett hål görs i mitten av ägget, det placeras på ett stativ med den trubbiga änden åt höger, och en nål fäst vid en spruta förs in genom hålet i vertikal riktning; nålen passerar genom det korioallantoiska membranet, allantoiskaviteten in i äggulan. Från 0,1 till 0,5 ml virusinnehållande material kan injiceras i gulesäcken. Efter infektion fylls hålet i skalet med paraffin och embryot placeras i en termostat. Enligt den andra metoden, vid gränsen av luftrummet på den sida där äggulan ligger (sidan motsatt embryot), görs en punktering i skalet, genom vilken infektiöst material introduceras. Riktningen på nålen ska vara mot mitten av ägget.

Ett kycklingembryo infekterat med viralt material placeras i en inkubator i 2-3 dagar, beroende på typen av det introducerade viruset. För utveckling av virus från prover som tagits från en patient (till exempel nasofaryngeala pinnprover som används för att diagnostisera influensa) ger kycklingembryot en bra miljö. Genom typen av förändringar, säg, i vävnaderna i det korioallantoiska membranet, kan vi direkt bestämma vilken typ av virus vi har att göra med. Smittkoppor och herpesvirus ger mycket karakteristiska förändringar. Vissa virus förökar sig mycket intensivt i olika vävnader i kycklingembryot och utgör utgångsmaterialet för framställning av virala antigener som är nödvändiga för laboratoriediagnostik av virussjukdomar. Virus som förökats i kycklingembryon användes som utgångsmaterial för att producera arton typer av vaccinationsvacciner.

Trots de positiva aspekterna av cellkulturer, som har blivit så utbredda i moderna virologilaboratorier, har kycklingembryot i många fall behållit sin företräde och fortsätter att fungera som ett klassiskt material för arbete. Indikation av virus i ett kycklingembryo görs genom embryots död, en positiv hemagglutinationsreaktion på glas med allantoin- eller fostervatten, genom bildandet av fokala lesioner (”plack”) på korion-allantoiska membranet, samt i RHA.

Många virus som infekterar människor och djur kan föröka sig i större eller mindre utsträckning i kycklingembryot. Närvaron av ett tätt skal skyddar embryot från mikroorganismer från den yttre miljön.

Metoden för att odla virus i kycklingembryon används i laboratoriediagnostik av virusinfektioner, såväl som för produktion av virusvacciner och diagnostiska läkemedel. Men denna metod har nackdelar: 1) det är omöjligt att i dynamiken observera de patologiska förändringarna som inträffar i embryot efter infektion med viruset; 2) när man öppnar ett embryo som är infekterat med ett virus detekteras ofta inga synliga förändringar och det är nödvändigt att detektera närvaron av viruset i embryots vävnader och vätskor med andra virologiska metoder (till exempel hemagglutinationsreaktionen); 3) metoden för odling i kycklingembryon är inte lämplig för alla virus. Trots de befintliga nackdelarna är metoden relativt enkel, bekväm och billig och används flitigt i virologiska studier. Det är viktigast när man arbetar med ortomyxovirus, herpesvirus och poxvirus.

1.3.1. Strukturen hos ett kycklingembryo

Kycklingembryot är täckt med ett kalkhaltigt skal - ett skal, till vilket skalmembranet ligger intill från insidan. I den trubbiga änden av ägget delar det sig och innehåller ett luftutrymme. Under skalmembranet finns ett korioallantoiskt membran; vid den trubbiga änden av ägget löper det längs insidan av skalmembranet och omsluter luftrummet; detta membran är rikt på blodkärl och fungerar som ett andningsorgan för embryot. Intill den från insidan finns allantoiskaviteten, som är ett utsöndringsorgan och skyddar embryot från uttorkning och skador. Allantoishålan omger embryot som ligger i amnionhålan, som är fylld med fostervatten. Genom gulesnöret är embryot anslutet till gulesäcken, den huvudsakliga näringskällan.

För framgångsrik odling av virus i kroppen av utvecklande kycklingembryon krävs en viss temperaturregim (36 0 -38 0), fuktighet (50-70%), såväl som tillräcklig ventilation. Kycklingembryon i en viss ålder infekteras, inkuberas i 6 till 13 dagar, beroende på typ av virus och infektionsmetod. Det är nödvändigt att förbereda: ett äggställ, injektionsflaskor med alkohol och jod, ett provrör med steril paraffin, täckglas, påsar med steril bomullsull och gasväv, sterila behållare inslagna i papper, sterila sprutor, nålar, pincett, dissektionsnålar. Instrumenten placeras i ett glas alkohol, där de förblir under hela arbetet, före varje manipulation steriliseras de dessutom genom att elda i en brännarlåga. Händerna tvättas noggrant före arbetet, det rekommenderas att bära en gasmask.

Livskraftiga embryon väljs ut för arbete genom att undersöka de inkuberade äggen i ett ovoskop. Ett livskraftigt embryo är rörligt, membranets blodkärl är fyllda med blod. Utvalda ägg desinficeras noggrant i den trubbiga änden (eller på sidan av ägget): skalet torkas av med alkohol, smörjs med jod, behandlas om med alkohol och bränns.

1.3.2. Infektion av kycklingembryot på det korioallantoiska membranet

Kycklingembryon 10-12 dagar gamla används för infektion. Huvudstadier av infektion:

1. Ägget placeras på ett stativ i vertikalt läge så att krockkudden är överst, och skalet steriliseras i den trubbiga änden av ägget.

2. En punktering av skalet görs ovanför mitten av luftsäcken med hjälp av en dissekeringsnål.

3. Saxens käke sätts in i det resulterande hålet och ett fönster ca 1,5 cm i diameter skärs ut i skalet.

4. Genom hålet, riv försiktigt av skalets innerblad med en nål och skala av på en liten yta (0,5-1 cm 2).

5. Det korioallantoiska membranet infekteras genom att applicera 0,1-0,2 ml virusinnehållande material på det med en Pasteurpipett eller spruta.

6. Fönstret i skalet är täckt med en speciell elastisk film eller ett sterilt täckglas och fäst med smält paraffin.

Infekterade embryon placeras i en termostat i vertikal position och inkuberas i 2-3 dagar, varefter en obduktion utförs enligt följande regler:

1. Ägget placeras på ett stativ så att luftutrymmet är överst, och öppningsplatsen steriliseras.

2. Använd en steril sax och klipp av skalet längs gränsen till luftrummet.

3. Ta bort skalet längs kanten med en pincett. Det exponerade korioallantoiska membranet trimmas längs kanten av skalet. Genom det resulterande hålet, häll hela innehållet i ägget i en kopp eller bricka.

4. Det korioallantoiska membranet som finns kvar inuti skalet avlägsnas försiktigt med en pincett och placeras i en steril kopp med saltlösning. Här rätar de ut den och studerar förändringarna genom att placera koppen på en mörk bakgrund.

För att få material som innehåller viruset från korioallantoiska membranet måste det krossas med sax och sedan malas i en mortel med kvartsglas, tillsätt en saltlösning. Den resulterande suspensionen centrifugeras vid 2000 rpm under 10-15 minuter och supernatanten används som ett virusinnehållande material.

Ris. 3. Infektion av kycklingembryon

1.3.3. Infektion i allantoishålan

Embryon som är 10-11 dagar gamla tas för infektion. Huvudstadier av infektion:

1. Ägget ställs på ett stativ med den trubbiga änden uppåt och skalet steriliseras över luftrummet.

2. En punktering av skalet görs i mitten av den trubbiga änden med hjälp av en dissekeringsnål.

3. Nålen på en spruta som innehåller en spädning av viruset förs in i hålet. Nålen förs fram i vertikal riktning 2-3 mm under nivån på luftsäcken och sedan injiceras 0,1-0,2 ml material.

4. Hålet i skalet tätas med smält sterilt paraffin.

Infekterade embryon förvaras i en termostat vanligtvis i 2 dagar. Innan öppning läggs äggen i kylen över natten vid 4 0 C. Öppning görs i följande ordning:

1. Ägget ställs på ett stativ så att krockkudden är överst, skalet ovanför steriliseras.

2. Med hjälp av en sax skärs skalet av något ovanför luftrummets gräns.

3. Ta försiktigt bort skalmembranet med en pincett, varefter korioallantoinmembranet genomborras med en pasteurpipett på den plats där det inte finns några kärl och allantoisvätskan sugs in.

4. Allantoisvätskan överförs till ett sterilt provrör och en del av det inokuleras i buljongen för att testa bakteriologisk sterilitet.

Embryon används vid åldern 8 till 14 dagar, beroende på typ av virus och infektionsmetod. Reproduktion i kycklingembryon sker i olika delar av embryot.Infektionsmetoder: på korioallantoiska membranet, i alloton- och fosterhinnan, gulesäcken, embryokroppen.

29. Vävnadskulturer.

Beroende på beredningstekniken finns det 3 typer av celler:

Enkelskiktsglas kan reproducera sig på ytan av kemiskt neutralt glas i form av ett monolager;

Suspension, spridning över hela volymen av näringsmediet;

Organ är hela bitar av organ och vävnader som behåller sin ursprungliga struktur.

Beredningen av en primär cellkultur består av flera steg: malning av vävnaden, separering av cellerna och tvättning av den resulterande suspensionen från trypsin.

Indikation:

- cytopatisk effekt - morfologiska förändringar i celler synliga under ett mikroskop, upp till avstötning från glaset.

Virala inneslutningar är en ansamling av virala partiklar eller separation av virala komponenter i cytoplasman eller cellkärnan.

Plack är begränsade områden som består av degenerativa celler. De är synliga som ljusa fläckar mot bakgrunden av färgade celler.

Färgtest

Hemadsorption är förmågan hos cellkulturer att adsorbera röda blodkroppar på sin yta.

Interferens.

30. Klassificering, kemisk sammansättning av bakteriofager.

Bakteriofager är bakteriella virus som har förmågan att penetrera bakterieceller och orsaka deras upplösning. De har en grodyngelform, vissa är kubiska trådliknande. De består av ett ikosaedriskt huvud och en svans. Inuti den kaudala processen finns en cylindrisk stång, utanför finns en mantel, processen slutar i en hexagonal basalplatta med korta ryggar. Fager är sammansatta av nukleinsyra och protein. I spermieformade fager är dubbelsträngat DNA tätt packat i en helix inuti huvudet. Proteiner är en del av skalet. Förutom strukturella proteiner upptäcktes interna proteiner associerade med nukleinsyra och enzymproteiner involverade i interaktionen mellan fagen och cellen.

31. Interaktionsprocessen mellan virulenta fager och en bakteriecell som är känslig för dem

Virulenta fager kan bara öka i antal genom den lytiska cykeln. Processen för interaktion mellan en virulent bakteriofag och en cell består av flera steg: adsorption av bakteriofagen på cellen, penetration in i cellen, biosyntes av fagkomponenter och deras sammansättning och frisättning av bakteriofager från cellen.

Initialt fäster bakteriofager till fagspecifika receptorer på ytan av bakteriecellen. Fagsvansen, med hjälp av enzymer som finns i dess ände (främst lysozym), löser lokalt upp cellmembranet, drar ihop sig och DNA:t som finns i huvudet injiceras i cellen, medan bakteriofagens proteinskal förblir utanför. Injicerat DNA orsakar en fullständig omstrukturering av cellens ämnesomsättning: syntesen av bakteriellt DNA, RNA och proteiner stoppas. Bakteriofagens DNA börjar transkriberas med sitt eget transkriptasenzym, som aktiveras efter att ha kommit in i bakteriecellen. Först syntetiseras tidiga och sedan sena mRNA, som går in i värdcellens ribosomer, där tidiga (DNA-polymeraser, nukleaser) och sena (kapsid- och svansproteiner, enzymer lysozym, ATPas och transkriptas) bakteriofagproteiner syntetiseras. Bakteriofag-DNA-replikation sker enligt en semi-konservativ mekanism och utförs med deltagande av dess egna DNA-polymeraser. Efter syntesen av sena proteiner och fullbordandet av DNA-replikationen börjar den slutliga processen - mognaden av fagpartiklar eller kombinationen av fag-DNA med höljesproteinet och bildandet av mogna infektiösa fagpartiklar.

Infektion av det korioallantoiska membranet. Denna metod är en av de mest använda. Dess främsta fördel är att ett antal virus, när de förökar sig på det korioallantoiska membranet, orsakar dess karakteristiska förändringar och bildar lesioner i form av vitaktiga fläckar-plack av olika morfologier.

Embryon 10-12 dagar gamla används för infektion. Vanligtvis penetreras det korioallantoiska membranet genom att göra ett hål i skalet ovanför luftsäcken eller på sidan av ägget.

De viktigaste stadierna av infektion på det korioallantoiska membranet från luftrummet:

1. Ägget placeras på ett stativ i vertikalt läge
så att krockkudden är överst)"; utför
grundlig sterilisering av skalet vid den trubbiga änden av ägget.

2. Skalet punkteras ovanför mitten av luftsäcken.
med hjälp av en dissekeringsnål.

3. Saxens käke sätts in i det resulterande hålet och
skär ett fönster i skalet ca 1,5 cm i diameter. (Vart i
Låt inte bitar av skalet komma in i ägget).

4. Genom det gjorda hålet syns innerbladet
skalmembran, det slits försiktigt med ögat
pincett eller en nål och dra av på ett litet område (0,5-1
cm 2), exponerar det korioallantoiska membranet.

5. Infekterar det korioallantoiska membranet
genom att applicera 0,1-0,2 ml virusinnehållande material på den
(till exempel vacciniavirus) med en Pasteurpipett
eller spruta.

6. Fönstret i skalet är stängt med en speciell resår
film, sterilt täckglas eller glas
keps. För att fästa glas och mössa på skalet
använd smält paraffin.

Infekterade embryon placeras i en termostat i vertikal position och inkuberas i 2-3 dagar, varefter en obduktion utförs enligt följande regler:

1. Ägget placeras på ett stativ så att luften
utrymmet var överst, platsen håller på att steriliseras
kommande öppning genom lämplig bearbetning
alkohol och jod.

2. Efter att ha tagit bort filmen, täckglaset eller locket,
Använd en steril sax och klipp av skalet längs luftens gräns
Plats.

3. Ta bort skalet med en pincett.
Det exponerade korioallantoiska membranet (som kan
vara synliga förändringar) trimmas längs kanten av skalet. Genom
hålet som bildas, häll hela innehållet i ägget i koppen
eller bricka.

4. Den återstående korioallantoiska vävnaden inuti skalet
skalet tas försiktigt bort med en pincett och placeras i
steril kopp med koksaltlösning. Här är det
räta ut och studera förändringarna genom att placera koppen på en mörk
bakgrund.

För att få material som innehåller viruset från korioallantoiska membranet måste det krossas med sax och sedan malas i en mortel med kvartsglas, tillsätt en saltlösning. Den resulterande suspensionen centrifugeras vid 2000 rpm under 10-15 minuter och supernatanten används! som ett virusinnehållande material (obligatorisk testning för frånvaro av bakteriell kontaminering krävs).

Infektion i allantoishålan. Den här metoden

Det kännetecknas av sin enkelhet och är värdefullt eftersom det bidrar till en betydande ansamling av viruset. Embryon som är 10 dagar gamla tas vanligtvis för infektion. De viktigaste stadierna av infektion i allantoic kaviteten:

}. Ägget ställs på ett stativ med den trubbiga änden uppåt och skalet steriliseras över luftrummet.

2. I mitten av den trubbiga änden görs en punktering i skalet med
med hjälp av en dissekeringsnål.

3. Nålen på en spruta som innehåller en utspädning förs in i hålet
virus (som influensavirus). Nålen förs in i
vertikal riktning 2-3 mm under luftnivån
påse och injicera sedan OD-0,2 ml material.

4. Hålet i skalet tätas med
smält sterilt paraffin.

Infekterade embryon förvaras i en termostat vanligtvis i 2 dagar. Innan öppning läggs äggen i kylen över natten vid 4°. Öppningen utförs i följande ordning:

1. Ägget läggs på ett stativ så att krockkudden är överst, skalet ovanför steriliseras;

2. Använd en sax och klipp skalet lite högre
luftrummets gränser.

3. Ta sedan försiktigt bort skalet med en pincett
varför korioallantoiska membranet är genomborrat med en pasteur
pipettera på den plats där det inte finns några kärl, och sug allantoisen
vätska (du kan samla 5-6 ml).

4. Allantoisk vätska överförs till en steril
provrör, och en del inokuleras i buljongen för att kontrollera efter
bakteriologisk sterilitet.

Infektionsmetoden för allantoishålan används ofta för att odla influensavirus, såväl som påssjuka och vaccinia.

Infektion i amnionhålan

Denna metod är svårare att utföra och används något mindre frekvent än de tidigare. Dess egenhet är att när de infekteras med vissa pneumotropa virus (till exempel influensavirus, påssjuka), förökar sig de senare inte bara i cellerna i amnionmembranet utan också i embryots andningsvägar och lungvävnad, där den infekterade vätskan tränger igenom. Embryon 7-12 dagar gamla används för infektion. Infektion i fostervattenhålan utförs med den öppna metoden, då ett relativt stort hål görs i skalet för att införa material, eller den stängda metoden, när infektionen utförs genom en punktering av skalet.

Den första av dem är mer traumatisk, den andra är mindre tillförlitlig, eftersom det inte alltid är möjligt att föra in en nål i amnionhålan, när man agerar blint.

Öppen infektionsteknik:

1. Ägget ställs på ett stativ och steriliseras
skal i området för den trubbiga änden.

2. Ovanför mitten av luftrummet i skalet
Använd en sax och klipp ut ett fönster 2 cm i diameter (som
för infektion på det korioallantoiska membranet).

3. Ta försiktigt bort det inre bladet på skalet
membran med hjälp av pincett, exponerar det underliggande
korioallantoiskt membran.

Använd en sax för att klippa ett litet hål i
chorioallantoic membran på en plats där det inte finns några blodkärl, och okulär pincett sätts in i snittet. Amnionmembranet greppas med en pincett och fostersäcken dras ut över ytan av korioallantoinmembranet.

5. Håll fosterhinnan i denna position,
infektera amnionhålan genom att injicera 0,1-
0,2 ml virusspädning.

6. Hålet i skalet stängs med en steril hatt.
eller täckglas, med hjälp av för att fixa dem och
försegla ägget med smält paraffin.

Infekterade embryon inkuberas i 2 dagar, de döda kasseras under den första dagen (observationer görs genom ett fönster i skalet). Efter öppning förvaras embryona över natten i ett kylskåp vid 4°C.

Teknik för att öppna ett embryo under infektion i fostervattenhålan:

1. Efter att ha steriliserat platsen för den kommande obduktionen, klipp av den
skal något ovanför luftsäckens kant.

2. Det korioallantoiska membranet punkteras
pastörpipettera och ta bort allantoisvätskan.

3. Ta tag i fostersäcken med pincett, pierce
dess membran med en sprutnål eller Pasteurpipett och
amnestikvätska sugs in (från 0,5 till 1,5 ml). U
infekterat embryo, bör vätskan vara grumlig under tiden
som ett vanligt embryo är det genomskinligt.

4. Den intagna vätskan överförs till ett sterilt provrör, 0,1-
0,3 ml av det inokuleras i buljongen för att kontrollera bakteriologisk
sterilitet.

Införandet av metoder för att odla virus i kycklingembryon var av stor betydelse för utvecklingen av virologi. För reproduktion av viruset används kycklingembryon i 7-12 dagars ålder, inkuberade i en termostat vid 37 C. En nödvändig förutsättning för korrekt utveckling av embryot är att upprätthålla en viss luftfuktighet, som kan skapas genom att placera ett kärl med vatten i termostaten. Odling av virus i kycklingembryon utförs på olika platser i embryot, som är infekterat:

1) på korion-allantoiska membranet;

2) in i allantoishålan;

3) in i fostervattenhålan;

4) i gulesäcken.

Infektion av kycklingembryon utförs i en låda med hjälp av sterila instrument. Före: infektion torkas kycklingembryon två gånger med en bomullstuss fuktad med alkohol.

Infektion av korion-allantoiska membranet. Efter desinfektion av ägget, skär försiktigt av en bit av skalet från den trubbiga änden, ta bort subshell-membranet - detta avslöjar korion-allatiosmembranet. Infektiöst material i en mängd av 0,1-0,2 ml appliceras på korion-allantoiska membranet med hjälp av en spruta eller Pasteurpipett. Efter infektion stängs hålet med ett lock och gapet mellan det och kycklingembryot fylls med paraffin. På andra sidan av ägget, skriv namnet på det smittsamma materialet och infektionsdatumet med en enkel penna.

Infektion i fostervattenhålan.Ägget är ovoskopiskt och ett område väljs på den laterala sidan där chorion-allantois saknar stora blodkärl. Detta område är markerat med en penna. Äggen placeras på ett stativ i horisontellt läge, desinficeras och ett hål genomborras med ett speciellt sterilt spjut. Och skal till ett djup av 2-3 mm, genom vilket en nål med smittsamt material förs in på samma avstånd direkt in i fostervattenhålan. För att förhindra att den injicerade vätskan rinner tillbaka görs först en punktering ovanför luftsäcken. Därefter fylls båda hålen med paraffin.

Infektion i allantoishålan. Infektion utförs också i en skuggad låda. Luftrummet markeras, skalet ovanför luftrummet desinficeras och en sprutnål med material sticks in genom ett hål i skalet mot embryot. Om nålen kommer in i allantoiska hålan, observeras en förskjutning av embryots skugga. Efter infektion fylls hålet med paraffin.

Infektion i gulesäcken. Skalet desinficeras. Ägget placeras på stativet med den trubbiga änden åt höger så att gulemärket är vänt uppåt. Ett hål är genomborrat i mitten ovanför luftkammaren. En sprutnål förs in genom ett hål i skalet i horisontell riktning till ett djup av 2-3 mm, som kommer in i gulesäcken. Materialet administreras i en volym av 0,2-0,3 ml. Efter införandet av materialet vaxas hålet.

Temperaturen och varaktigheten av inkubationen beror på virusets biologiska egenskaper. Infekterade ägg kontrolleras dagligen och ovoskoperas för att kontrollera embryots livsduglighet. Om embryon dör den första dagen är orsaken vanligtvis trauma under infektion. Sådana ägg kläcks av erfarenhet. Närvaron av viruset i ett infekterat embryo bestäms av karakteristiska förändringar i korion-allantoiska membranet hos ett infekterat kycklingembryo. Virus som inte har hemagpotinerande aktivitet upptäcks med RSC. För att upptäcka viruset i allantoin- eller fostervatten från infekterade embryon utförs RGA.