Laboratorinis tyrimas PGR. Ką rodo PGR kraujo tyrimas? Kaip pasiruošti analizei. Kur atlikti PGR tyrimą

Norint tinkamai ir veiksmingai gydyti daugelį infekcinių ligų, būtina laiku nustatyti tikslią diagnozę. Sprendžiant šią problemą šiandien naudojami aukštųjų technologijų diagnostikos metodai, pagrįsti molekulinės biologijos metodais. Šiuo metu polimerazės grandininė reakcija (PGR) jau gana plačiai naudojama praktinėje medicinoje kaip patikimiausia laboratorinės diagnostikos priemonė.

Kas paaiškina PGR populiarumą šiuo metu?

Pirma, šis metodas naudojamas labai tiksliai nustatyti įvairių infekcinių ligų sukėlėjus.

Antra, stebėti gydymo veiksmingumą.

Įvairiuose žinynuose, brošiūrose, straipsniuose, taip pat medicinos specialistų paaiškinimuose dažnai susiduriame su nesuprantamų terminų ir žodžių vartojimu. Kasdieniais žodžiais kalbėti apie aukštųjų technologijų mokslo produktus tikrai sunku.

Kokia yra PGR diagnostikos esmė ir mechanika?

Kiekvienas gyvas organizmas turi savo unikalius genus. Genai yra DNR molekulėje, kuri iš tikrųjų yra kiekvieno atskiro organizmo „vizitinė kortelė“. DNR (genetinė medžiaga) yra labai ilga molekulė, sudaryta iš statybinių blokų, vadinamų nukleotidais. Kiekvienam infekcinių ligų sukėlėjui jie yra išdėstyti griežtai konkrečiai, tai yra, tam tikra seka ir deriniu. Kai reikia suprasti, ar žmogus turi tam tikrą ligos sukėlėją, paimama biologinė medžiaga (kraujas, šlapimas, seilės, tepinėlis), kurioje yra mikrobo DNR arba DNR fragmentai. Tačiau patogeno genetinės medžiagos kiekis yra labai mažas, ir neįmanoma pasakyti, kuriam mikroorganizmui jis priklauso. Šiai problemai išspręsti naudojamas PGR. Polimerazės grandininės reakcijos esmė yra ta, kad paimamas nedidelis kiekis tyrimams skirtos medžiagos, kurioje yra DNR, o PGR proceso metu padidėja specifiniam patogenui priklausančios genetinės medžiagos kiekis, todėl jį galima identifikuoti.

PGR diagnostika – genetinis biomedžiagos tyrimas.

PGR metodo idėja priklauso amerikiečių mokslininkui K. Mullinsui, kurią jis pasiūlė 1983 m. Tačiau jis buvo plačiai naudojamas klinikoje tik XX amžiaus 90-ųjų viduryje.

Supraskime terminologiją, kas tai yra – DNR ir kt. Kiekvienos gyvos būtybės (gyvūno, augalo, žmogaus, bakterijos, viruso) ląstelė turi chromosomas. Chromosomos yra genetinės informacijos, kurioje yra visa kiekvienos konkrečios gyvos būtybės genų seka, saugotojos.

Kiekviena chromosoma susideda iš dviejų DNR grandinių, susuktų į spiralę viena kitos atžvilgiu. DNR yra chemiškai dezoksiribonukleino rūgštis, susidedanti iš struktūrinių komponentų – nukleotidų. Yra 5 nukleotidų tipai – timinas (T), adenozinas (A), guaninas (G), citozinas (C) ir uracilas (U). Nukleotidai išsidėstę vienas po kito griežta individualia seka, formuodami genus. Vienas genas gali susidėti iš 20-200 tokių nukleotidų. Pavyzdžiui, insulino gamybą koduojantis genas susideda iš 60 nukleotidų porų.

Nukleotidai turi komplementarumo savybę. Tai reiškia, kad priešingas adeninas (A) vienoje DNR grandinėje būtinai yra timinas (T) kitoje grandinėje, o priešingas guaninas (G) yra citozinas (C). Schematiškai tai atrodo taip:
G-C
T-A
A-T
Ši komplementarumo savybė yra pagrindinė PGR.

Be DNR, RNR turi tą pačią struktūrą – ribonukleino rūgštį, kuri nuo DNR skiriasi tuo, kad vietoj timino naudojamas uracilas. RNR yra kai kurių virusų, vadinamų retrovirusais (pavyzdžiui, ŽIV), genetinės informacijos saugotoja.

DNR ir RNR molekulės gali „daugintis“ (ši savybė naudojama PGR). Tai vyksta taip: dvi DNR arba RNR grandinės nutolsta viena nuo kitos, o ant kiekvienos grandinės sėdi specialus fermentas, kuris sintezuoja naują grandinę. Sintezė vyksta pagal komplementarumo principą, tai yra, jei pradinėje DNR grandinėje yra nukleotidas A, tai naujai susintetintoje bus T, jei G, tada C ir kt. Norint pradėti sintezę, šiam specialiam „statybiniam“ fermentui reikia „sėklos“ - 5–15 nukleotidų sekos. Šis „pradmuo“ apibrėžiamas kiekvienam genui (chlamidijos genui, mikoplazmos, virusai) eksperimentiškai.

Taigi, kiekvienas PGR ciklas susideda iš trijų etapų. Pirmajame etape įvyksta vadinamasis DNR išsivyniojimas – tai yra dviejų viena su kita sujungtų DNR grandinių atskyrimas. Antrajame „sėkla“ pritvirtinama prie DNR grandinės dalies. Ir galiausiai šių DNR grandžių pailgėjimas, kurį gamina fermentas „statybininkas“. Šiuo metu visas šis sudėtingas procesas vyksta viename mėgintuvėlyje ir susideda iš kartotinių aptinkamos DNR dauginimo ciklų, siekiant gauti daug kopijų, kurias vėliau galima aptikti įprastais metodais. Tai yra, iš vienos DNR grandinės gauname šimtus ar tūkstančius.

PGR tyrimo etapai

Biologinės medžiagos rinkimas tyrimams

Mėginiui naudojamos įvairios biologinės medžiagos: kraujas ir jo komponentai, šlapimas, seilės, gleivinės išskyros, smegenų skystis, išskyros iš žaizdų paviršių, kūno ertmių turinys. Visi biologiniai mėginiai renkami vienkartiniais instrumentais, o surinkta medžiaga dedama į plastikinius sterilius mėgintuvėlius arba dedama ant auginimo terpės, vėliau vežama į laboratoriją.

Į surinktus mėginius pridedami reikalingi reagentai ir dedami į programuojamą termostatą – termociklerį (stiprintuvą). Stiprintuve PGR ciklas, susidedantis iš trijų etapų (denatūravimo, atkaitinimo ir pratęsimo), kartojamas 30-50 kartų. Ką tai reiškia? Pažiūrėkime atidžiau.

Tiesioginės PGR reakcijos etapai, kopijuojant genetinę medžiagą

ašPGR etapas – genetinės medžiagos paruošimas kopijavimui.
Vyksta 95 ° C temperatūroje, o DNR grandinės yra atskirtos ir ant jų gali nusileisti „sėklos“.

„Sėklas“ pramoniniu būdu gamina įvairios tyrimų ir gamybos asociacijos, o laboratorijos perka jau paruoštas. Tuo pačiu metu „gruntas“, skirtas, pavyzdžiui, chlamidijoms identifikuoti, veikia tik chlamidijoms ir kt. Taigi, jei biomedžiaga tiriama, ar nėra chlamidinės infekcijos, tada į reakcijos mišinį dedamas chlamidijų „gruntas“; jei biomedžiaga tiriama dėl Epstein-Barr viruso, tai ji taip pat yra Epstein-Barr viruso "sėkla".

IIetapas – infekcinio sukėlėjo ir „sėklos“ genetinės medžiagos derinimas.
Jei yra aptinkamo viruso ar bakterijų DNR, ant šios DNR yra „pradukas“. Šis „pradmens“ pridėjimo procesas yra antrasis PGR etapas. Šis etapas vyksta 75°C temperatūroje.

IIIetapas – Infekcinio sukėlėjo genetinės medžiagos kopijavimas.
Tai yra genetinės medžiagos pailgėjimo arba dauginimosi procesas, vykstantis 72 °C temperatūroje. Fermentas „statybininkas“ priartėja prie „sėklų“ ir sintezuoja naują DNR grandinę. Pasibaigus naujos DNR grandinės sintezei, PGR ciklas baigiasi. Tai yra, per vieną PGR ciklą genetinės medžiagos kiekis padvigubėja. Pavyzdžiui, pradiniame mėginyje buvo 100 viruso DNR molekulių, o po pirmojo PGR ciklo mėginyje jau bus 200 tiriamo viruso DNR molekulių. Vienas ciklas trunka 2-3 minutes.

Norint sukurti pakankamą kiekį genetinės medžiagos identifikavimui, dažniausiai atliekama 30-50 PGR ciklų, kurie trunka 2-3 valandas.

Dauginamos genetinės medžiagos identifikavimo etapas

Tiesą sakant, PGR baigiasi čia ir tada ateina ne mažiau reikšmingas identifikavimo etapas. Identifikavimui naudojamas elektroforezės metodas arba pažymėtos „sėklos“. Taikant elektroforezę, gautos DNR grandinės yra atskiriamos pagal dydį, o skirtingo ilgio DNR fragmentų buvimas rodo teigiamą tyrimo rezultatą (tai yra konkretaus viruso, bakterijų ir kt. buvimas). Naudojant pažymėtas „sėklas“, į galutinį reakcijos produktą pridedamas chromogenas (dažiklis), dėl kurio fermentinę reakciją lydi spalvos susidarymas. Spalvos atsiradimas tiesiogiai rodo, kad pradiniame mėginyje yra viruso ar kito aptinkamo agento.

Šiandien naudojant pažymėtas „sėklas“, taip pat atitinkamą programinę įrangą, galima iš karto „perskaityti“ PGR rezultatus. Tai yra vadinamasis realaus laiko PGR.

Kodėl PGR diagnostika tokia vertinga?

Vienas iš reikšmingų PGR metodo privalumų yra didelis jo jautrumas – nuo ​​95 iki 100%. Tačiau šios išmokos turi būti pagrįstos griežtai laikantis šių sąlygų:

1. teisingas biologinės medžiagos surinkimas ir transportavimas;
2. sterilių, vienkartinių instrumentų, specialių laboratorijų ir apmokyto personalo prieinamumas;
3. griežtas metodikos laikymasis ir sterilumas analizės metu

Skirtingų aptiktų mikrobų jautrumas skiriasi. Pavyzdžiui, PGR metodo jautrumas hepatito C virusui nustatyti yra 97-98%, ureaplazmos nustatymo jautrumas yra 99-100%.

PGR analizei būdingos galimybės leidžia pasiekti neprilygstamą analitinį specifiškumą. Tai reiškia, kad reikia tiksliai nustatyti ieškomą mikroorganizmą, o ne panašų ar glaudžiai susijusį.
PGR metodo diagnostinis jautrumas ir specifiškumas dažnai viršija kultivavimo metodą, vadinamą „auksiniu standartu“ infekcinių ligų aptikimui. Atsižvelgiant į kultūros auginimo trukmę (nuo kelių dienų iki kelių savaičių), PGR metodo pranašumas tampa akivaizdus.

PGR diagnozuojant infekcijas
PGR metodo privalumai (jautrumas ir specifiškumas) lemia platų pritaikymo spektrą šiuolaikinėje medicinoje.
Pagrindinės PGR diagnostikos taikymo sritys:

1. įvairių lokalizacijų ūminių ir lėtinių infekcinių ligų diagnostika
2. terapijos veiksmingumo stebėjimas
3. patogeno tipo išaiškinimas

PGR naudojamas akušerijoje, ginekologijoje, neonatologijoje, pediatrijoje, urologijoje, venerologijoje, nefrologijoje, infekcinių ligų klinikoje, oftalmologijoje, neurologijoje, ftiziopulmonologijoje ir kt.

PGR diagnostika naudojama kartu su kitais tyrimo metodais (ELISA, PIF, RIF ir kt.). Jų derinį ir tinkamumą nustato gydantis gydytojas.

Infekciniai sukėlėjai, nustatyti PGR

Virusai:

1. retrovirusai ŽIV-1 ir ŽIV-2
2. herpetiforminiai virusai
3. 1 ir 2 tipų herpes simplex virusas

PGR diagnostika – kas tai? Polimerazės grandininės reakcijos esmė ta, kad tiriant biologinę medžiagą naudojami specialūs žymenų tipai, kurie greitai analizuoja infekcinių agentų DNR. Ginekologijoje moterims taikomi skirtingi PGR tyrimo metodai, priklausomai nuo tiriamos medžiagos (kraujo, šlapimo, tepinėlių ir kt.). Apdorojus duomenis, nustatomas patogeno tipas (tai vadinama „PGR kokybinė analizė“) ir (arba) jų koncentracija – toks tyrimas vadinamas „PGR kiekybine analize“.

Tyrimų atlikimas PGR metodu leidžia greitai patikrinti, ar nėra infekcinės patologijos sukėlėjų, kai to neįmanoma padaryti kitais tyrimais (imunologiniais, bakteriologiniais, mikroskopiniais). Šiuolaikinėje laboratorinėje diagnostikoje PGR yra veiksmingiausias ir geriausias būdas aptikti mikrobų ir virusų DNR. Tyrimas leidžia ginekologui ir kitiems klinikos gydytojams ne tik nustatyti moterų ir vyrų negalavimo priežastį, bet ir stebėti proceso eigą bei teisingai įvertinti terapijos rezultatą.

PGR diagnostikos kainos

Infekcija	PGR	Kaina
Chlamidijos (Clamidia Trachomatis)	kokybinis	450
Chlamidija	kiekybinis	850
Ureaplazma (U. urealiticum / U. parvum)	kokybinis	450
Ureaplazma	kiekybinis	750
Mycoplasma hominis	kokybinis	450
Mikoplazma	kiekybinis	750
Mycoplasma genitalium	kokybinis	450
Mikoplazma	kiekybinis	750
Gardnerella (Gardnaerella vaginalis)	kokybinis	450
Trichomonas vaginalis	kokybinis	400
Trichomonas	kiekybinis	850
	kokybinis	500
Gonokokai (Neisseria gohorrhoeae)	kiekybinis	650
Citomegalovirusas (CMV)	kokybinis	400
Sifilio (Treponema pallidum) sukėlėjas	kokybinis	500
Candida (Candida albicans)	kokybinis	450
Candida (Candida albicans / Candida glabrata / Candida crusei)	kokybinis	750
I ir II tipo herpes virusas (HSV)	kokybinis	450
Epstein-Barr virusas	kokybinis	500
Varicella-Zoster virusas	kokybinis	350
Žmogaus papilomos virusai

KĄ RODYJA PGR

Kokybinė PGR analizė rodo tiesioginį infekcijos sukėlėjo buvimą žmogaus ar gyvūno organizme. Galite paimti beveik bet kurios vietos (lyties organų, šlaplės, burnos ir ryklės ir kt.) tepinėlį arba PGR kraujo tyrimus. Ginekologijoje tepinėliu ar grandymu patikrinama, ar nėra chlamidijų, šlapalo ir mikoplazmų, herpeso viruso, ŽPV ir kitų mikrobų. DNR analizės rezultatas pacientui pateikiamas su laboratorijos išvada „aptikta“ arba „neaptikta“. Kraujo tyrimo atveju jis leidžia labai ankstyvoje stadijoje nustatyti ŽIV, hepatitą, herpesą, citomegalovirusą ir kitus mikroorganizmus, o kai kuriais atvejais nustatyti jų genotipą ir parodyti kiekį.

Kiekybiniai PGR tyrimai.
Tyrimas leidžia ne tik greitai nustatyti norimą genetinę medžiagą, bet ir parodyti jų DNR koncentraciją (kiekybinis PGR metodas). Patogenų tipo ir skaičiaus nustatymas yra svarbus sprendžiant dėl ​​gydymo, ypač jei, pavyzdžiui, aptinkama mikoplazmos (DNR kiekio nustatymas), ureaplazmos tipo nustatymas (DNR kiekybinis nustatymas) arba, svarbiausia, genotipų nustatymas ir virusų kiekio nustatymas gali būti atliktas atliekant tyrimus. ŽPV infekcija.

PGR REZULTATAI

Iš viso to, kas pasakyta, aišku, kas yra PGR analizė ir kokie šio tyrimo privalumai ginekologijoje. Kitas svarbus šios diagnozės niuansas – rezultato iššifravimas yra prieinamas ir patogus neprofesionalui. Atsižvelgiant į tai, kiek klinikoje atliekama PGR analizė, taip pat kiek reikia ataskaitos paruošimo (laboratorija dažniausiai informaciją pateikia per 1-2 dienas), šis diagnostikos metodas tampa geriausiu pasirinkimu nustatant visas pagrindines ginekologines ir. kitos infekcijos.

Naudodama kokybinį moterų ir vyrų tepinėlių DNR tyrimo metodą, laboratorija daro dviejų tipų išvadas:

1. „PGR neigiamas“ – tiriamojoje medžiagoje patogeno neaptikta ir
2. „PGR teigiamas“ – atliekant tyrimą buvo rasta mikrobo ar viruso RNR arba DNR.

PGR ginekologijoje

Indikacijos atlikti šiuos tyrimus moterims yra šios:

• Įtarimas dėl galimos LPI infekcijos;
• Anoniminė apklausa;
• Išskyrų iš lytinių takų buvimas, niežulys;
• Skausmas apatinėje pilvo dalyje;
• Diskomfortas šlapinantis;
• Skausmas lytinių santykių metu;
• Padidėjęs leukocitų kiekis floros tepinėlio analizėje;
• Gimdos kaklelio erozijos buvimas;
• Nėštumo planavimas;
• Vaiko pastojimo ir gimdymo problemos;
• Pasiruošimas ginekologinėms operacijoms, IVF;
• Prevenciniais tikslais.

Kur geriausia vieta atlikti PGR testą Maskvoje?
Šis ginekologijos diagnostikos tipas priklauso šiuolaikiniams ir aukštųjų technologijų metodams. Infekcijų tyrimus naudojant PGR metodą reikia atlikti klinikoje, kurioje yra viskas, ko reikia norint gauti pilnus rezultatus. Mūsų medicinos centre mėginius ima kvalifikuoti, patyrę gydytojai ginekologai (ne vidutinis gydymo kabineto personalas), naudojami vienkartiniai instrumentai ir specialios laboratorinės medžiagos, o iš pacientų gauti mėginiai kasdien siunčiami į darbą. Tai leidžia ne tik greitai gauti PGR rezultatus, bet ir užtikrinti jų patikimumą. Jei pageidaujate, užpildykite apklausos anonimiškumą.

Kiek kainuoja PGR?
Šią paslaugą teikia daugelis sostinės gydymo įstaigų. Išlaidoms įtakos turi daug veiksnių, pradedant nuo vietos ir baigiant vidine kainų politika. Tačiau yra objektyvių veiksnių, nulemiančių vidutinį minimalų skaičių, žemiau kurio kokybiška ir patikima paslauga negali būti suteikta dėl minėtų veiksnių. Vidutinė PGR diagnostikos kaina Maskvos klinikose kai kurioms infekcijoms yra tokia:

• kokybinė PGR tepinėlio analizė - 400 - 500 rublių;
• kiekybinė PGR tepinėlio analizė - nuo 600 rublių (1 vnt.);
• Nubrozdinimų RNR diagnostika - nuo 1000 rublių (1 vnt.);
• Kokybinis PGR kraujo tyrimas (pavyzdžiui, dėl herpeso, ŽPV, Epstein-Barr viruso, citomegaloviruso) - 450 - 550 rublių, kiekybinis - nuo 2000 rublių;
• Kokybinė ŽIV DNR (ŽIV buvimo ikiklinikiniu laikotarpiu paneigimas / patvirtinimas) - nuo 2000 rublių, kiekybinė RNR - nuo 7000 rublių, atsparumas - nuo 14 000 rublių.

Pasiruošimas PGR

Kad gautų teisingus ir patikimus tyrimų rezultatus, merginos ir moterys, prieš eidamos pasitikrinti dėl infekcijų, turėtų laikytis tam tikrų taisyklių:

Likus 1-2 dienoms iki apsilankymo klinikoje tyrimams susilaikyti nuo lytinių santykių;
- susilaikyti nuo šlapinimosi likus 1,5 - 2 valandoms iki tepinėlio;
- atlikti išorinių lytinių organų higieną paprastu vandeniu, be ploviklių, vengti dušo;
- nenaudokite makšties tablečių, žvakučių;
- nedarykite PGR tyrimų menstruacijų metu;
- jei esate mergelė, prieš apžiūrą apie tai iš anksto įspėkite ginekologą.

Kaip atlikti PGR testus

Atlikti PGR testą mūsų klinikoje, taip pat ir anonimiškai, yra gana paprasta. Toliau paaiškinsime, kaip PGR paimama iš moterų ir vyrų ir kur, iš kurių vietų šis tyrimas yra informatyviausias.

Moters atveju analizę atlieka ginekologas. Tai dažniausiai nutinka pirminio susitikimo su gydytoju metu arba atvykus tiesiog išsitirti dėl infekcijų, be išankstinės konsultacijos. Viskas pagal jūsų pageidavimus. Pasakote savo pageidavimus, dėl kokių infekcijų norėtumėte išsitirti, o po to prasideda medžiagos rinkimo procedūra. Pacientas nusirengia žemiau juosmens ir atsisėda ant kėdės. Išskleidęs mažąsias lytines lūpas, gydytojas į makštį įdeda tinkamo dydžio ginekologinį spenelį. Ginekologai imasi PGR iš moterų, dažniausiai iš gimdos kaklelio, taip pat iš šlaplės. Pastaruoju atveju, prieš įvedant zondą, pirštu įkišus į makštį atliekamas trumpas šlaplės masažas. Jei PGR testą atlieka paauglės ar mergaičių nekaltos merginos, veidrodis nenaudojamas, o išskyrų mėginiai imami per mergystės plėvės angą arba makšties prieangio sritį. Gauta medžiaga dedama į sandarų mėgintuvėlį su specialia terpe ir siunčiama į laboratoriją.

Šios analizės paėmimas iš vyrų nesukelia jokių ypatingų sunkumų. Zondas įkišamas į šlaplę 3-4 cm gylyje ir keletą kartų pasukamas pagal laikrodžio rodyklę ir prieš laikrodžio rodyklę. Medžiaga taip pat dedama į mėgintuvėlį vėlesnei diagnostikai.

Straipsnio pabaigoje žr
Polimerazės grandininė reakcija (PGR) 1983 metais išrado Kary Mullis (amerikiečių mokslininkas). Vėliau jis gavo Nobelio premiją už šį išradimą. Šiuo metu PGR diagnostika yra vienas tiksliausių ir jautriausių infekcinių ligų diagnostikos metodų.
Polimerazės grandininė reakcija (PGR)- eksperimentinis molekulinės biologijos metodas, metodas, leidžiantis žymiai padidinti mažas tam tikrų nukleino rūgšties fragmentų (DNR) koncentracijas biologinėje medžiagoje (mėginyje).
PGR metodas pagrįstas pakartotiniu tam tikros DNR dalies padvigubinimu, naudojant fermentus dirbtinėmis sąlygomis (in vitro). Dėl to susidaro DNR kiekiai, kurių pakanka vizualiniam aptikimui. Tokiu atveju nukopijuojamas tik tas skyrius, kuris atitinka nurodytas sąlygas, ir tik tuo atveju, jei jis yra tiriamame pavyzdyje.
Be to, kad paprasčiausiai padidinamas DNR kopijų skaičius (šis procesas vadinamas amplifikacija), PGR leidžia atlikti daugybę kitų manipuliacijų su genetine medžiaga (mutacijų įvedimas, DNR fragmentų sujungimas) ir yra plačiai naudojamas, pavyzdžiui, biologinėje ir medicinos praktikoje. , ligų (paveldimų, infekcinių) diagnozavimui, tėvystei nustatyti, genams klonuoti, įvesti mutacijas, išskirti naujus genus.

Specifiškumas ir pritaikymas

PGR atlikimas

Norint atlikti PGR paprasčiausiu atveju, reikalingi šie komponentai:

• DNR šablonas, kuriame yra DNR sekcija, kurią reikia amplifikuoti;
• du pradmenys, papildantys norimo fragmento galus;
• termostabili DNR polimerazė;
• deoksinukleotido trifosfatai (A, G, C, T);
• Mg2+ jonai, būtini polimerazės veikimui;
• buferinis tirpalas.

PGR atliekama termocikleryje – įrenginyje, kuris periodiškai vėsina ir kaitina mėgintuvėlius, dažniausiai ne mažesniu kaip 0,1°C tikslumu. Kad reakcijos mišinys neišgaruotų, į mėgintuvėlį įpilkite aukštai verdančio aliejaus, pvz., vazelino. Pridėjus specifinių fermentų, gali padidėti PGR reakcijos išeiga.
Reakcijos eiga

Paprastai PGR atlieka 20–35 ciklus, kurių kiekvienas susideda iš trijų etapų. Dviejų grandžių DNR šablonas kaitinamas iki 94–96 °C (arba 98 °C, jei naudojama ypač termostabili polimerazė) 0,5–2 minutes, kad būtų atskirtos DNR grandinės. Šis etapas vadinamas denatūravimu – vandeniliniai ryšiai tarp dviejų grandinių sunaikinami. Kartais prieš pirmąjį ciklą reakcijos mišinys pašildomas 2–5 minutes, kad visiškai denatūruotų matricą ir pradmenis.
Kai sruogos atsiskiria, temperatūra sumažinama, kad gruntai galėtų prisijungti prie viengubo šablono. Šis etapas vadinamas atkaitinimu. Atkaitinimo temperatūra priklauso nuo gruntų ir dažniausiai pasirenkama 4–5°C žemesnė už jų lydymosi temperatūrą. Scenos laikas 0,5 - 2 minutės.

DNR polimerazė replikuoja šablono grandinę, naudodama pradmenį kaip pradmenį. Tai pailgėjimo etapas. Pailgėjimo temperatūra priklauso nuo polimerazės. Dažniausiai naudojamos polimerazės aktyviausios 72°C temperatūroje. Pailgėjimo laikas priklauso ir nuo DNR polimerazės tipo, ir nuo amplifikuoto fragmento ilgio. Paprastai pailgėjimo trukmė yra viena minutė tūkstančiui bazinių porų. Pasibaigus visiems ciklams, dažnai atliekamas papildomas galutinis pailginimo etapas, kad būtų užbaigti visi vienos grandinės fragmentai. Šis etapas trunka 10-15 minučių.
Medžiagos paruošimas tyrimams ir transportavimas į laboratoriją

Kad analizė būtų sėkminga, svarbu teisingai surinkti medžiagą iš paciento ir tinkamai ją paruošti. Yra žinoma, kad laboratorinėje diagnostikoje daugiausia klaidų (iki 70%) padaroma būtent mėginio paruošimo stadijoje. Kraujui imti INVITRO laboratorijoje šiuo metu naudojamos vakuuminės sistemos, kurios, viena vertus, minimaliai sužaloja pacientą, kita vertus leidžia surinkti medžiagą taip, kad ji nesiliestų su arba personalas, arba aplinka. Taip išvengiama medžiagos užteršimo (užteršimo) ir užtikrinamas PGR analizės objektyvumas.

DNR – dezoksiribonukleino rūgštis – tai biologinis polimeras, vienas iš dviejų nukleorūgščių tipų, užtikrinančių saugojimą, perdavimą iš kartos į kartą ir gyvų organizmų vystymosi ir funkcionavimo genetinės programos įgyvendinimą. Pagrindinis DNR vaidmuo ląstelėse yra ilgalaikis informacijos apie RNR ir baltymų struktūrą saugojimas.

RNR-ribonukleorūgštis yra biologinis polimeras, savo chemine struktūra panašus į DNR. RNR molekulė sudaryta iš tų pačių monomerų vienetų – nukleotidų – kaip ir DNR. Gamtoje RNR paprastai egzistuoja kaip viena grandinė. Kai kuriuose virusuose RNR yra genetinės informacijos nešėja. Ląstelėje jis vaidina svarbų vaidmenį perduodant informaciją iš DNR į baltymą. RNR sintetinama ant DNR šablono. Šis procesas vadinamas transkripcija. DNR yra sričių, kuriose yra informacijos, atsakingos už trijų tipų RNR sintezę, kurios skiriasi savo atliekamomis funkcijomis: pasiuntinio arba pasiuntinio RNR (mRNR), ribosomų RNR (rRNR) ir transportavimo RNR (tRNR). Visi trys RNR tipai vienaip ar kitaip dalyvauja baltymų sintezėje. Tačiau informacija apie baltymų sintezę yra tik mRNR.

Nukleotidai yra pagrindinis pasikartojantis vienetas nukleorūgščių molekulėse, azoto bazės, penkių anglies cukraus (pentozės) ir vienos ar daugiau fosfatų grupių cheminio derinio produktas. Nukleorūgštyse esantys nukleotidai turi vieną fosfato grupę. Jie pavadinti pagal juose esančią azoto bazę – adeninas (A), turintis adenino, guanino (G) – guanino, citozinas (C) – citozinas, timinas (T) – timinas, uracilas (U) – uracilas. DNR yra 4 tipų nukleotidai – A, T, G, C, RNR taip pat yra 4 tipai – A, U, G, C. Visuose DNR nukleotiduose esantis cukrus yra dezoksiribozė, RNR – ribozė. Susidarius nukleorūgštims, nukleotidai jungiasi, sudarydami molekulės cukraus-fosfato pagrindą, kurio vienoje pusėje yra bazės.

Pradmenys yra trumpa DNR, naudojama šablono grandinei replikuoti. Kiekvienas iš pradmenų papildo vieną iš dvigrandinio šablono gijų, įrėmindamas sustiprintos srities pradžią ir pabaigą.

Literatūra

1. Glick B., Pasternak J. Molekulinė biotechnologija. Principai ir taikymas. Per. iš anglų kalbos - M.: Mir, 2002. - 589 p., iliustr. ISBN 5-03-003328-9
2. Shchelkunovas S.N. Genų inžinerija – Novosibirskas: Sibirskas. Univ. leidykla, 2004. - 496 p.; nesveikas. ISBN 5-94087-098-8
3. Patruševas L.I. Dirbtinės genetinės sistemos - M.: Nauka, 2005 - 2 tomais - ISBN 5-02-033278-X

SVARBU!

Šiame skyriuje pateikta informacija negali būti naudojama savidiagnostikai ir savęs gydymui. Esant skausmui ar kitokiam ligos paūmėjimui, diagnostinius tyrimus gali skirti tik gydantis gydytojas. Norėdami nustatyti diagnozę ir paskirti tinkamą gydymą, turite kreiptis į gydytoją.

00516 straipsnis

Tyrimų blokas lytinių (urogenitalinių, latentinių) infekcijų diagnozavimui naudojant PGR metodą

Šis analizės blokas apima:

• Gardnerella vaginalis (Gardnerella) (medžiagos nustatymas PGR)
• Candida albicans (candida) (medžiagos nustatymas PGR)
• ŽPV, ŽPV (žmogaus papilomos virusas, žmogaus papilomos virusas), tipai: mažos onkogeninės rizikos (6.11) nurodant tipą; didelė onkogeninė rizika (16,18,31,33,35,39,45,51,52) nenurodant tipo (nustatymas medžiagoje PGR metodu) (nustatymas medžiagoje
• Mycoplasma hominis (žmogaus mikoplazma) (medžiagos nustatymas PGR)
• Mycoplasma genitalium (genitalijų mikoplazma) (medžiagos nustatymas PGR)
• Neisseria gonorrhoeae (gonokokai) (medžiagos nustatymas PGR metodu)
• Trichomonas vaginalis (Trichomonas) (medžiagos nustatymas PGR)

Kam tai

Optimalus vienetas diagnozuojant lytiniu keliu plintančias infekcijas (LPL, LPI), taip pat uždegimines vyrų ir moterų Urogenitalinės sistemos ligas.

Makštis nėra sterili aplinka. Makštyje, taip pat žarnyne ir odoje yra daug įvairių mikroorganizmų...

Šis blokas skirtas jums, jei:

• niekada nebuvo tikrinami arba buvo ištirti daugiau nei prieš metus;
• nuo paskutinės apžiūros turėjo neapsaugotų lytinių santykių;
• planuoti nėštumą (abu sutuoktiniai nėščia);
• atsirado bet kokių nusiskundimų, pavyzdžiui, diskomfortas, niežulys, deginimas, išskyros, makšties kvapas, dirginimo pojūtis.

Atkreipiame dėmesį, kad daugelis infekcijų yra besimptomės (vadinamosios latentinės infekcijos), todėl PGR tyrimus reikėtų atlikti ne tik turint nusiskundimų.

Blokas apima šiuos rodiklius:

• Chlamydia trachomatis (chlamidija) (chlamidijos sukėlėjas)
• Mycoplasma hominis (žmogaus mikoplazma)
• Mycoplasma genitalium (lyties organų mikoplazma) (mikoplazmos infekcijos sukėlėjas)
• Ureaplasma parvum (ureaplasma parvum)
• Ureaplasma urealyticum (ureaplasma urealyticum, ankstesnis pavadinimas Biovar "T-960")
• Neisseria gonorrhoeae (gonokokas, gonorėjos sukėlėjas)
• ŽPV (žmogaus papilomos virusas, žmogaus papilomos virusas), didelės onkogeninės rizikos tipai: 16,18, kai tipas nurodytas, 16, 18,31,33,35,39,45,52,67,58,59 nenurodytas tipas
• ŽPV (žmogaus papilomos virusas, žmogaus papilomos virusas), mažos onkogeninės rizikos tipai: 6.11, nurodantis tipą
• ŽPV (žmogaus papilomos virusas, žmogaus papilomos virusas), didelės ir mažos onkogeninės rizikos tipai: 16,18 su tipu, 16,18,31,33,35,39,45,52,67,58,59 nenurodant tipo, 6 , 11 su tipo nuoroda
• Trichomonas vaginalis (Trichomonas, trichomonozės sukėlėjas)
• Gardnerella vaginalis (Gardnerella)
• Candida albicans (Candida) (kandidozės sukėlėjas)

Pagrindiniai šių infekcijų simptomai, įskaitant lytiniu keliu plintančių ligų simptomus

Tyrimo metodas: PGR.

PGR – polimerazės grandininė reakcija (PGR) yra diagnostinis metodas, leidžiantis aptikti nežymius tam tikros genetinės medžiagos kiekius klinikinėje medžiagoje, ją padauginti ir identifikuoti.

Biologinė medžiaga PGR analizei parenkama priklausomai nuo patogeno buvimo vietos. Tačiau norint gauti patikimą analizės rezultatą, rekomenduojamas biologinės medžiagos tipas urogenitalinio trakto infekcijoms nustatyti yra moterims iš makšties išskyrų ir gimdos kaklelio kanalo, o vyrams – iš šlaplės.

Biologinės medžiagos tipai PGR diagnostikai

• Šlapimas infekcijoms izoliuoti
• Įbrėžimai ir tepinėliai (gimdos kaklelio, makšties, šlaplės) nuo infekcijų
• Sperma, prostatos sekrecija
• Kraujas ir jo komponentai (serumas, plazma, leukocitai ir kt.)
• Išmatos
• Seilės, skrepliai ir skalavimai
• Motinos pienas ir krūties išskyros
• Ir pan.

Testų vertė

Kiekvieno patogeno rezultatas: neigiamas / teigiamas

Analizės atlikimo sąlygos

Testą galima atlikti bet kurioje CIR klinikoje darbo dienomis ir valandomis.

Taip pat paklausė:

• Bakteriologinis išskyrų iš gimdos kaklelio kanalo tyrimas, nustačius jautrumą antibiotikams, be jautrumo priešgrybeliniams vaistams

Kaip išsitirti CIR laboratorijose?

Norėdami sutaupyti laiko, pateikite užsakymą analizei adresu Internetinė parduotuvė! Sumokėję už užsakymą internetu, gausite nuolaidą 10% už visą pateiktą užsakymą!

Susijusios medžiagos

Chlamidijos ir chlamidofilija

Šiuolaikinė Chlamydiaceae šeimos klasifikacija (chlamydia, chlamydophila)

PGR – polimerazės grandininė reakcija (PGR, polimerazės grandininė reakcija)

PGR yra DNR diagnostikos metodas, leidžiantis išskirti nežymius tam tikros genetinės medžiagos kiekius klinikinėje medžiagoje, ją padauginti ir identifikuoti.

Chlamidija

Chlamidija- bakterinė liga, kurią sukelia Chlamydia trachomatis.

Makšties mikroflora

Makštis nėra sterili aplinka. Makštyje, taip pat žarnyne ir odoje, yra daug įvairių mikroorganizmų. Mikrofloros pagrindas yra pieno rūgšties bakterijos.

Įvairios medicininės apžiūros programos

Kokie tyrimai yra įtraukti į kasmetinę medicininę apžiūrą? Kodėl svarbu atlikti išsamų tyrimą?

Imunoblotas

Blotavimas(iš anglų kalbos blot - spot) - baltymų identifikavimo metodai, kurie pateikiami atskirtas molekules (pavyzdžiui, antigenus) pritaikant bet kuriam nešikliui.

Spermos infekcijų (ejakuliato) PGR diagnostika

PGR analizė šiandien yra vienas iš aukštųjų technologijų, prieinamų ir efektyvių molekulinės diagnostikos metodų, naudojamų įvairiose medicinos srityse. Dažniausiai jis naudojamas laboratorinei žmonių infekcinių ligų, įskaitant lytiniu keliu plintančių infekcijų (LPI) diagnostikai, urogenitalinių infekcijų sukėlėjų, galinčių sukelti įvairias vyrų ir moterų urogenitalinės sistemos uždegimines ligas, identifikavimui.

Šiuolaikinėje medicinoje didesnė reikšmė teikiama didelio tikslumo laboratoriniams tyrimų metodams, pagrįstiems polimerazės grandinine reakcija. Naudojant PGR technologijas, tapo įmanoma atlikti analizę molekuliniu genetiniu lygmeniu ir nustatyti paciento ūmias ir lėtines paveldimų ir infekcinių ligų formas dar gerokai prieš pasireiškus klinikiniams simptomams.

Kas yra PGR diagnostika

Šį metodą 1984 metais sukūrė amerikiečių biochemikė ir Nobelio premijos laureatė Carrie Mullis.

Daugelis kvalifikuotų specialistų kasdien susiduria su PGR tyrimu ir neįsivaizduoja tikslaus daugumos patologijų formų diagnozavimo be jo rezultatų tais atvejais, kai imunologiniai ir mikrobiologiniai metodai neveikia. Dažnai atsitinka, kad skirtingi virusai gali sukelti tuos pačius klinikinius simptomus, PGR analizė leis identifikuoti patogeną, kurio koncentracija yra mažiausia biomedžiagoje, ir identifikuoti net pavienes virusų ar bacilų ląsteles.

Apie PGR diagnostiką vaizdo įraše

PGR diagnostikos pagrindas yra specialiomis laboratorinėmis sąlygomis pakartotinis tam tikrų DNR sekcijų (dezoksiribonukleino rūgšties) – žmogaus genetinės medžiagos – amplifikacija (dauginimas).

Visas technologinis kopijavimo procesas susideda iš kelių etapų:

1. Denatūravimas – mėginio paruošimas, padidinus biomedžiagos temperatūrą (iki 95 °C), 2 grandžių DNR suskaidoma į dvi atskiras grandines.
2. Atkaitinimas — tiriama biomedžiaga atšaldoma ir į ją pridedami azotiniai pradmenys (reagentai), kurie turi galimybę DNR molekulėje specifiškai atpažinti sekas, būdingas tik patogeniniam sukėlėjui ir su jomis sujungti.
3. Pailgėjimas – pati polimerazės reakcija, įvyksta unikalios molekulinės genetinės vietos užbaigimas, kiekviename iš jungčių su pradmeniu susidaro nauja DNR grandinė, struktūriškai papildanti dukterinę.

Visas ciklas kartojamas 20-30 kartų. Galiausiai susidaro toks komplementarių DNR grandžių skaičius, kurio pakanka vizualiai analizei ir rezultatų palyginimui su turimais duomenimis apie įvairių patogenų ląstelių struktūrą. Nustatomas virusas, jo išvaizdos pobūdis, jo poveikio organizmui stiprumas ir esamų bacilų skaičius. Ši informacija labai naudinga gydančiam gydytojui, skiriant efektyvius gydymo metodus ir parenkant vaistus.

PGR diagnostikos metodai skiriasi nuo kitų laboratorinių metodų:

• tiesioginis patogenų buvimo nustatymas;
• didelis viruso aptikimo procedūros jautrumas, specifiškumas ir universalumas;
• analizės greitis;
• gebėjimas diagnozuoti asimptomines patologijas.

Tyrimo rezultatai gali būti nufotografuoti arba įvesti į informacines laikmenas, kad juos galėtų įvertinti nepriklausomi ekspertai.

Kaip tinkamai pasiruošti PGR tyrimui?

Tyrimams naudojamos įvairios biomedžiagos:

• kraujas;
• gleivės;
• seilės;
• šlapimas;
• skrepliai;
• epitelio įbrėžimai;
• prostatos sultys;
• gleivinės įbrėžimai;
• amniono skystis;
• placentos audinys;
• cerebrospinalinis, sąnarių ar pleuros skystis;
• lytinių organų išskyros.

Šiuolaikinė laboratorinė įranga ir laboratorinio gydytojo profesionalumas garantuoja, kad pacientas, kuriam atliekama PGR analizė, gaus patikimą rezultatą. Tačiau tyrimo tikslumas priklauso nuo tinkamo pasirengimo tyrimui ir nuo to, ar laikomasi visų biomedžiagos parinkimo rekomendacijų.

Tinkamai pasiruošti analizei nėra sunku, svarbu laikytis visų galiojančių taisyklių:

1. Dieną prieš tyrimą neturėkite lytinių santykių.
2. Atšaukti sporto užsiėmimus.
3. Prieš tyrimą nesilankykite pirtyje ar saunoje.
4. Vakarieniauti reikėtų išvakarėse ne vėliau kaip 20 val., nesimėgauti aštriu ir riebiu maistu, nevartoti alkoholio.
5. Venų kraują būtina duoti ryte, prieš procedūrą nevalgyti, negerti ir nerūkyti.

Kaip moterims ir vyrams atliekami PGR tyrimai - procedūros ypatybės

Pagrindinis bendras reikalavimas parenkant biomedžiagą – gauti maksimalią mikroorganizmų koncentraciją mėginyje ir nebuvimą nepageidaujamų priemaišų – gleivių, kraujo ar pūlių.

Atliekant tyrimus dėl lytiniu keliu plintančių infekcijų (ureaplazmozės, gardnereliozės, chlamidiozės, mikoplazmozės, trichomonozės), renkamos išskyros iš lytinių organų:

• vyrams paimamas tepinėlis arba įbrėžimas iš šlapimo kanalo (šlaplės);
• moterims – tepinėlis ar įbrėžimas iš makšties, gimdos kaklelio kanalo.

Imant medžiagą iš urogenitalinio trakto, svarbu vengti užteršimo. Tuo tikslu vyrų nuograndų imamas ne anksčiau kaip po 2 valandų po paskutinio šlapinimosi, moterų – atsižvelgiant į mėnesinių ciklo dienas. Gleivių ar pūlių perteklius pašalinamas steriliais vatos tamponais, biomedžiaga surenkama naudojant specialius plastikinius zondus – tai sumažina kraujo patekimo į mėginį tikimybę.

Urogenitalinio grandymo procedūra vyrams yra gana skausminga , todėl analizei dažnai naudojama pirmoji šlapimo dalis po naktinio susilaikymo, kurioje yra didžiausias epitelio kiekis. Šlapimas surenkamas į sterilų indą su sandariu dangteliu ir pristatomas į laboratoriją ne vėliau kaip per dvi valandas po surinkimo. Laboratorijoje centrifuguojant gaunamos ląstelinės šlapimo nuosėdos tolesniam darbui.

Kokios infekcijos įtrauktos į PGR-12 kompleksą?

PGR diagnostiką aktyviai naudoja patyrę specialistai. Paklausiausia yra virusų ir infekcijų diagnostika.

Kokias 12 infekcijų galima nustatyti naudojant PGR diagnostiką?	Kas atsiskleidžia
ŽIV infekcija	1/2 tipo žmogaus imunodeficito virusas
Hepatitas A, B, C, G	Hepatito virusai HAV, HBV, HCV, HGV
Mononukleozė	Epstein-Barr virusas
Citomegalovirusinė infekcija	Sukėlėjas yra citomegalovirusas
Herpetinė infekcija	Herpes simplex viruso tipas 1/2
LPI yra lytiniu keliu plintančios infekcijos	Patogeniniai mikrobai - ureaplasma, gardnellera, chlamidijos, mikoplazma, trichomonos
Tuberkuliozė	Mycobacterium tuberculosis
Onkogeniniai virusai	Žmogaus papilomos virusas – Žmogaus papilomos virusas ir jo onkogeninės rūšys (14 tipų)
Boreliozė	Erkinio encefalito sukėlėjas
Listeriozė	Sukėlėjas yra Listeria monocytogenes
Kandidozė	Candida šeimos grybai
Helicobacter pylori infekcija	Sukėlėjas yra Helicobacter pylori

Šiuo metu polimerazės grandininės reakcijos metodai plečia tyrimų atlikimo galimybes – genotipų nustatymo ir audinių DNR fragmentų sujungimo įdiegimas plačiai paplito m. įvairios šiuolaikinės medicinos sritys:

• ginekologija;
• urologija;
• pulmonologija;
• gastroenterologija;
• hematologija;
• onkologija.

Kur galiu nebrangiai išsitirti Uralo federalinėje apygardoje?

Šiuolaikiniai PGR diagnostikos metodai nuolat tobulinami. Pati technika tobulinama, atsiranda naujų PGR atmainų ir naujų testavimo sistemų, naudojamų grandininėms reakcijoms. Dėl šių naujovių šių tyrimų kaina pacientams tampa prieinamesnė.