Penelitian laboratorium PCR. Apa yang ditunjukkan oleh tes darah PCR? Bagaimana mempersiapkan analisis. Tempat tes PCR

Untuk pengobatan banyak penyakit menular yang memadai dan efektif, diperlukan diagnosis akurat yang tepat waktu. Saat ini, dalam memecahkan masalah ini, metode diagnostik berteknologi tinggi berdasarkan metode biologi molekuler digunakan. Saat ini, reaksi berantai polimerase (PCR) sudah cukup banyak digunakan dalam pengobatan praktis sebagai alat diagnostik laboratorium yang paling andal.

Apa yang menjelaskan popularitas PCR saat ini?

Pertama, metode ini digunakan untuk mengidentifikasi patogen berbagai penyakit menular dengan akurasi tinggi.

Kedua, memantau efektivitas pengobatan.

Dalam berbagai buku manual, brosur, artikel, maupun penjelasan para dokter spesialis, seringkali kita menjumpai penggunaan istilah dan kata yang tidak dapat dipahami. Sangat sulit untuk berbicara tentang produk sains berteknologi tinggi dalam bahasa sehari-hari.

Apa inti dan mekanisme diagnostik PCR?

Setiap organisme hidup memiliki gen uniknya sendiri. Gen terletak di dalam molekul DNA, yang sebenarnya merupakan “kartu panggil” setiap organisme. DNA (materi genetik) adalah molekul yang sangat panjang yang terdiri dari bahan penyusun yang disebut nukleotida. Untuk setiap patogen penyakit menular, lokasinya sangat spesifik, yaitu dalam urutan dan kombinasi tertentu. Ketika perlu untuk memahami apakah seseorang memiliki patogen tertentu, bahan biologis (darah, urin, air liur, apusan) diambil, yang mengandung DNA atau fragmen DNA mikroba. Tetapi jumlah materi genetik patogen tersebut sangat kecil, dan tidak mungkin untuk mengatakan mikroorganisme mana yang termasuk dalam patogen tersebut. PCR digunakan untuk mengatasi masalah ini. Inti dari reaksi berantai polimerase adalah sejumlah kecil bahan untuk penelitian yang mengandung DNA diambil, dan selama proses PCR, jumlah materi genetik milik patogen tertentu meningkat sehingga dapat diidentifikasi.

Diagnostik PCR – studi genetik biomaterial.

Ide metode PCR adalah milik ilmuwan Amerika K. Mullins, yang ia usulkan pada tahun 1983. Namun, penggunaan klinisnya meluas hanya pada pertengahan tahun 90-an abad ke-20.

Mari kita pahami terminologinya, apa itu - DNA, dll. Setiap sel makhluk hidup (hewan, tumbuhan, manusia, bakteri, virus) memiliki kromosom. Kromosom merupakan penjaga informasi genetik yang memuat seluruh rangkaian gen setiap makhluk hidup tertentu.

Setiap kromosom terdiri dari dua untai DNA yang dipilin menjadi spiral relatif satu sama lain. DNA secara kimia adalah asam deoksiribonukleat, yang terdiri dari komponen struktural - nukleotida. Ada 5 jenis nukleotida - timin (T), adenosin (A), guanin (G), sitosin (C) dan urasil (U). Nukleotida disusun satu demi satu dalam urutan individu yang ketat, membentuk gen. Satu gen dapat terdiri dari 20-200 nukleotida tersebut. Misalnya, gen yang mengkode produksi insulin terdiri dari 60 pasang nukleotida.

Nukleotida mempunyai sifat saling melengkapi. Artinya, berlawanan dengan adenin (A) dalam satu rantai DNA pasti ada timin (T) di rantai lain, dan berlawanan dengan guanin (G) pasti ada sitosin (C). Secara skematis tampilannya seperti ini:
G-C
T-A
PADA
Sifat saling melengkapi ini adalah kunci PCR.

Selain DNA, RNA memiliki struktur yang sama - asam ribonukleat, yang berbeda dari DNA karena menggunakan urasil sebagai pengganti timin. RNA adalah penjaga informasi genetik pada beberapa virus yang disebut retrovirus (misalnya HIV).

Molekul DNA dan RNA dapat “berkembang biak” (sifat ini digunakan untuk PCR). Hal ini terjadi sebagai berikut: dua untai DNA atau RNA menjauh satu sama lain, dan enzim khusus berada di setiap untai, yang mensintesis rantai baru. Sintesis berlangsung menurut prinsip saling melengkapi, yaitu jika rantai DNA asli mengandung nukleotida A, maka rantai DNA yang baru disintesis akan mengandung T, jika G, maka C, dst. Untuk memulai sintesis, enzim “pembangun” khusus ini membutuhkan “benih” - rangkaian 5-15 nukleotida. “Primer” ini ditentukan untuk setiap gen (gen klamidia, mikoplasma, virus) secara eksperimental.

Jadi, setiap siklus PCR terdiri dari tiga tahap. Pada tahap pertama, terjadi apa yang disebut pelepasan DNA - yaitu pemisahan dua untai DNA yang terhubung satu sama lain. Yang kedua, “benih” dilekatkan pada bagian untai DNA. Dan terakhir, pemanjangan untaian DNA ini, yang dihasilkan oleh enzim “pembangun”. Saat ini, seluruh proses kompleks ini terjadi dalam satu tabung reaksi dan terdiri dari siklus berulang penggandaan DNA yang dapat dideteksi untuk memperoleh salinan dalam jumlah besar, yang kemudian dapat dideteksi dengan metode konvensional. Artinya, dari satu untai DNA kita mendapatkan ratusan atau ribuan.

Tahapan penelitian PCR

Koleksi bahan biologis untuk penelitian

Berbagai bahan biologis yang digunakan sebagai sampel: darah dan komponennya, urin, air liur, sekret selaput lendir, cairan serebrospinal, sekret dari permukaan luka, isi rongga tubuh. Semua biosampel dikumpulkan dengan instrumen sekali pakai, dan bahan yang dikumpulkan ditempatkan dalam tabung plastik steril atau ditempatkan pada media kultur, kemudian diangkut ke laboratorium.

Reagen yang diperlukan ditambahkan ke sampel yang dikumpulkan dan ditempatkan dalam termostat yang dapat diprogram - siklus termal (penguat). Pada amplifier, siklus PCR yang terdiri dari tiga tahap (denaturasi, anil dan ekstensi), diulangi sebanyak 30-50 kali. Apa artinya ini? Mari kita lihat lebih dekat.

Tahapan reaksi PCR langsung, penyalinan materi genetik

SAYATahap PCR - Persiapan materi genetik untuk disalin.
Terjadi pada suhu 95 ° C, sedangkan untaian DNA terpisah, dan “benih” dapat hinggap di atasnya.

“Benih” diproduksi secara industri oleh berbagai asosiasi penelitian dan produksi, dan laboratorium membeli benih yang sudah jadi. Pada saat yang sama, “primer” untuk mengidentifikasi, misalnya, klamidia, hanya berfungsi untuk klamidia, dll. Jadi, jika suatu biomaterial diuji untuk mengetahui adanya infeksi klamidia, maka “primer” untuk klamidia ditempatkan dalam campuran reaksi; jika biomaterial tersebut diuji untuk virus Epstein-Barr, maka biomaterial tersebut juga merupakan “benih” untuk virus Epstein-Barr.

IItahap – Menggabungkan materi genetik dari agen penular dan “benih”.
Jika ada DNA dari virus atau bakteri yang terdeteksi, “primer” berada pada DNA tersebut. Proses penambahan “primer” ini merupakan tahap kedua dari PCR. Tahap ini berlangsung pada suhu 75°C.

AKU AKU AKUtahap - Menyalin materi genetik dari agen infeksi.
Ini adalah proses pemanjangan atau penggandaan materi genetik, yang terjadi pada suhu 72°C. Enzim “pembangun” mendekati “benih” dan mensintesis rantai DNA baru. Dengan berakhirnya sintesis rantai DNA baru, siklus PCR berakhir. Artinya, dalam satu siklus PCR jumlah materi genetik menjadi dua kali lipat. Misalnya, sampel awal mengandung 100 molekul DNA suatu virus, setelah siklus PCR pertama, sampel tersebut sudah mengandung 200 molekul DNA virus yang diuji. Satu siklus berlangsung 2-3 menit.

Untuk menghasilkan materi genetik dalam jumlah yang cukup untuk identifikasi, biasanya dilakukan 30-50 siklus PCR, yang memakan waktu 2-3 jam.

Tahap identifikasi materi genetik yang diperbanyak

Sebenarnya PCR berakhir di sini dan kemudian tibalah tahap identifikasi yang tidak kalah pentingnya. Untuk identifikasi digunakan metode elektroforesis atau diberi label “biji”. Saat menggunakan elektroforesis, untaian DNA yang dihasilkan dipisahkan berdasarkan ukurannya, dan adanya fragmen DNA dengan panjang berbeda menunjukkan hasil tes positif (yaitu, adanya virus, bakteri, dll. tertentu). Saat menggunakan “biji” berlabel, kromogen (pewarna) ditambahkan ke produk reaksi akhir, sebagai akibatnya reaksi enzimatik disertai dengan pembentukan warna. Perkembangan warna secara langsung menunjukkan adanya virus atau agen lain yang terdeteksi dalam sampel asli.

Saat ini, dengan menggunakan label “benih”, serta perangkat lunak yang sesuai, hasil PCR dapat langsung “dibaca”. Inilah yang disebut PCR waktu nyata.

Mengapa diagnostik PCR sangat berharga?

Salah satu keuntungan signifikan dari metode PCR adalah sensitivitasnya yang tinggi - dari 95 hingga 100%. Namun, manfaat ini harus didasarkan pada ketaatan pada kondisi berikut:

1. pengumpulan dan pengangkutan bahan biologis yang benar;
2. ketersediaan instrumen steril sekali pakai, laboratorium khusus dan personel terlatih;
3. kepatuhan yang ketat terhadap metodologi dan sterilitas selama analisis

Sensitivitas bervariasi di antara mikroba berbeda yang terdeteksi. Misalnya sensitivitas metode PCR untuk mendeteksi virus hepatitis C adalah 97-98%, sensitivitas untuk mendeteksi ureaplasma adalah 99-100%.

Kemampuan yang melekat pada analisis PCR memungkinkan spesifisitas analitis yang tak tertandingi. Ini berarti mengidentifikasi secara tepat mikroorganisme yang dicari, dan bukan mikroorganisme yang serupa atau berkerabat dekat.
Sensitivitas dan spesifisitas diagnostik metode PCR seringkali melebihi metode kultur, yang disebut “standar emas” untuk mendeteksi penyakit menular. Mengingat durasi budidaya tanaman (dari beberapa hari hingga beberapa minggu), keuntungan metode PCR menjadi jelas.

PCR dalam diagnosis infeksi
Keunggulan metode PCR (sensitivitas dan spesifisitas) menentukan penerapannya yang luas dalam pengobatan modern.
Bidang utama penerapan diagnostik PCR:

1. diagnosis penyakit menular akut dan kronis di berbagai lokalisasi
2. memantau efektivitas terapi
3. klarifikasi jenis patogen

PCR digunakan dalam bidang kebidanan, ginekologi, neonatologi, pediatri, urologi, venereologi, nefrologi, klinik penyakit menular, oftalmologi, neurologi, phthisiopulmonology, dll.

Penggunaan diagnostik PCR dilakukan bersamaan dengan metode penelitian lainnya (ELISA, PIF, RIF, dll). Kombinasi dan kesesuaiannya ditentukan oleh dokter yang merawat.

Agen infeksi terdeteksi oleh PCR

Virus:

1. retrovirus HIV-1 dan HIV-2
2. virus herpetiformis
3. virus herpes simpleks tipe 1 dan 2

Diagnostik PCR - apa itu? Inti dari Reaksi Berantai Polimerase adalah untuk mempelajari bahan biologis, digunakan jenis penanda khusus yang dengan cepat menganalisis DNA agen infeksi. Dalam ginekologi, ada berbagai metode tes PCR untuk wanita, tergantung pada bahan yang diuji (darah, urin, apusan, dll). Setelah pengolahan data, jenis patogen diidentifikasi (ini disebut “analisis kualitatif PCR”) dan/atau konsentrasinya - jenis penelitian ini disebut “analisis kuantitatif PCR.”

Melakukan tes menggunakan metode PCR memungkinkan Anda dengan cepat memeriksa patogen patologi infeksi ketika hal ini tidak memungkinkan untuk dilakukan dengan tes lain (imunologis, bakteriologis, mikroskop). Dalam diagnostik laboratorium modern, PCR adalah cara paling efektif dan terbaik untuk mendeteksi DNA mikroba dan virus. Tes ini memungkinkan dokter kandungan dan dokter klinik lainnya tidak hanya untuk menentukan penyebab penyakit pada wanita dan pria, tetapi juga untuk memantau kemajuan proses dan mengevaluasi hasil terapi dengan benar.

Harga untuk diagnostik PCR

Infeksi	PCR	Harga
Klamidia (Clamidia Trachomatis)	kualitatif	450
Klamidia	kuantitatif	850
Ureaplasma (U.urealiticum / U.parvum)	kualitatif	450
Ureaplasma	kuantitatif	750
Mycoplasma hominis	kualitatif	450
mikoplasma	kuantitatif	750
Genitalium Mikoplasma	kualitatif	450
mikoplasma	kuantitatif	750
Gardnerella (Gardnaerella vaginalis)	kualitatif	450
Trichomonas vaginalis	kualitatif	400
Trichomonas	kuantitatif	850
	kualitatif	500
Gonokokus (Neisseria gohorrhoeae)	kuantitatif	650
Sitomegalovirus (CMV)	kualitatif	400
Agen penyebab penyakit sipilis (Treponema pallidum)	kualitatif	500
Candida (Candida albicans)	kualitatif	450
Candida (Candida albicans / Candida glabrata / Candida crusei)	kualitatif	750
Virus herpes tipe I dan II (HSV)	kualitatif	450
virus Epstein-Barr	kualitatif	500
Virus Varicella-Zoster	kualitatif	350
Virus papiloma manusia

APA YANG DITUNJUKKAN PCR

Analisis PCR kualitatif memberikan indikasi adanya langsung suatu agen penular pada tubuh manusia atau hewan. Anda dapat melakukan pemeriksaan smear di hampir semua lokasi (organ genital, uretra, orofaring, dll.) atau tes darah PCR. Dengan menggunakan apusan atau kerokan di ginekologi, mereka memeriksa klamidia, urea dan mikoplasma, virus herpes, HPV, dan mikroba lainnya. Hasil analisis DNA diberikan kepada pasien dengan kesimpulan laboratorium “terdeteksi” atau “tidak terdeteksi”. Dalam hal tes darah, ini memungkinkan Anda untuk mengidentifikasi HIV, hepatitis, herpes, cytomegalovirus dan mikroorganisme lainnya pada tahap yang sangat awal, dan dalam beberapa kasus, menentukan genotipe dan menunjukkan kuantitasnya.

Tes PCR kuantitatif.
Studi ini memungkinkan tidak hanya untuk dengan cepat mengidentifikasi materi genetik yang diinginkan, tetapi juga untuk menunjukkan konsentrasi DNA mereka (metode PCR kuantitatif). Menentukan jenis dan jumlah patogen penting dalam menentukan pengobatan, terutama jika, misalnya, mikoplasma (kuantifikasi DNA), pengetikan ureaplasma (kuantifikasi DNA) terdeteksi atau, yang paling penting, kuantifikasi genotipe dan viral load dapat dilakukan dalam tes untuk Infeksi HPV.

HASIL PCR

Dari semua yang telah dikatakan sudah jelas apa itu analisis PCR dan apa kelebihan tes ini dalam bidang ginekologi. Nuansa penting lainnya dari diagnosis ini adalah penguraian hasilnya dapat diakses dan nyaman bagi non-profesional. Mengingat banyaknya analisis PCR yang dilakukan di klinik, serta waktu yang dibutuhkan untuk menyiapkan laporan (laboratorium biasanya memberikan informasi dalam 1-2 hari), metode diagnostik ini menjadi pilihan terbaik untuk menentukan semua penyakit ginekologi dan utama. infeksi lainnya.

Dengan menggunakan metode kualitatif pengujian DNA pada apusan perempuan dan laki-laki, laboratorium membuat dua jenis kesimpulan:

1. “PCR negatif” - tidak ada patogen yang terdeteksi pada bahan uji dan
2. “PCR positif” - RNA atau DNA mikroba atau virus ditemukan dalam tes.

PCR dalam ginekologi

Indikasi untuk melakukan tes ini pada wanita adalah sebagai berikut:

• Kecurigaan kemungkinan infeksi IMS;
• Survei anonim;
• Adanya keluarnya cairan dari saluran genital, gatal;
• Nyeri di perut bagian bawah;
• Ketidaknyamanan saat buang air kecil;
• Nyeri saat berhubungan seksual;
• Peningkatan leukosit pada analisis apusan flora;
• Adanya erosi pada leher rahim;
• Perencanaan kehamilan;
• Masalah dalam mengandung dan melahirkan anak;
• Persiapan operasi ginekologi, IVF;
• Untuk tujuan pencegahan.

Di mana tempat terbaik untuk melakukan tes PCR di Moskow?
Jenis diagnostik dalam ginekologi ini termasuk dalam metode modern dan berteknologi tinggi. Tes infeksi dengan metode PCR sebaiknya dilakukan di klinik yang memiliki segala yang diperlukan untuk memperoleh hasil yang lengkap. Di pusat kesehatan kami, pengambilan sampel dilakukan oleh ginekolog yang berkualifikasi dan berpengalaman (bukan rata-rata staf di ruang perawatan), instrumen sekali pakai dan bahan laboratorium khusus digunakan, dan sampel yang diterima dari pasien dikirim untuk bekerja setiap hari. Hal ini memungkinkan Anda tidak hanya memperoleh hasil PCR dengan cepat, tetapi juga memastikan keandalannya. Jika diinginkan, lengkapi anonimitas survei.

Berapa biaya PCR?
Layanan ini disediakan oleh banyak institusi medis di ibu kota. Biaya dipengaruhi oleh banyak faktor, mulai dari lokasi hingga kebijakan penetapan harga internal. Namun, ada faktor obyektif yang menentukan angka rata-rata minimum, di bawahnya layanan berkualitas tinggi dan dapat diandalkan tidak dapat diberikan karena faktor-faktor tersebut. Harga rata-rata diagnostik PCR di klinik Moskow untuk beberapa infeksi adalah sebagai berikut:

• analisis smear PCR kualitatif - 400 - 500 rubel;
• analisis kuantitatif smear PCR - dari 600 rubel (1 unit);
• Diagnostik RNA dari kerokan - dari 1.000 rubel (1 unit);
• Tes darah PCR kualitatif (misalnya, untuk herpes, HPV, virus Epstein-Barr, cytomegalovirus) - 450 - 550 rubel, kuantitatif - dari 2.000 rubel;
• DNA HIV kualitatif (sanggahan/konfirmasi keberadaan HIV pada periode praklinis) - dari 2.000 rubel, RNA kuantitatif - dari 7.000 rubel, resistensi - dari 14.000 rubel.

Persiapan PCR

Untuk mendapatkan hasil penelitian yang benar dan dapat diandalkan, anak perempuan dan perempuan harus mematuhi aturan tertentu sebelum melakukan tes infeksi:

1-2 hari sebelum kunjungan Anda ke klinik untuk pemeriksaan, jangan melakukan hubungan seksual;
- menahan diri untuk tidak buang air kecil 1,5 - 2 jam sebelum apusan;
- melakukan kebersihan alat kelamin bagian luar dengan air biasa, tanpa deterjen, hindari douching;
- kecualikan penggunaan tablet vagina, supositoria;
- jangan melakukan tes PCR saat menstruasi;
- jika Anda masih perawan, peringatkan dokter kandungan tentang hal ini terlebih dahulu sebelum pemeriksaan.

Cara mengikuti tes PCR

Cara melakukan tes PCR di klinik kami, termasuk secara anonim, cukup sederhana. Selanjutnya akan kami jelaskan bagaimana PCR diambil dari perempuan dan laki-laki dan di mana, dari tempat mana penelitian ini paling informatif.

Dalam kasus seorang wanita, analisis dilakukan oleh dokter kandungan. Hal ini biasanya terjadi pada pertemuan awal dengan dokter atau ketika muncul hanya untuk menjalani tes infeksi, tanpa konsultasi sebelumnya. Semuanya sesuai keinginan Anda. Anda menyatakan keinginan Anda, infeksi apa yang ingin Anda uji, dan setelah itu prosedur pengumpulan materi dimulai. Pasien membuka pakaian di bawah pinggang dan duduk di kursi. Setelah menyebarkan labia minora, dokter memasukkan spekulum ginekologi dengan ukuran yang sesuai ke dalam vagina. Ginekolog mengambil PCR dari wanita, biasanya dari leher rahim, dan juga uretra. Dalam kasus terakhir, sebelum memasukkan probe, pijatan singkat pada uretra dilakukan dengan jari dimasukkan ke dalam vagina. Jika tes PCR dilakukan oleh remaja putri atau perawan, maka tidak digunakan cermin, dan sampel sekret diambil melalui lubang pada selaput dara atau area ruang depan vagina. Bahan yang dihasilkan ditempatkan dalam tabung tertutup dengan media khusus dan dikirim ke laboratorium.

Mengambil analisis ini dari laki-laki tidak menimbulkan kesulitan khusus. Probe dimasukkan ke dalam uretra pada kedalaman 3-4 cm dan diputar searah jarum jam dan berlawanan arah jarum jam beberapa kali. Bahan tersebut juga ditempatkan dalam tabung reaksi untuk diagnosis selanjutnya.

Di akhir artikel, lihat
Reaksi berantai polimerase (PCR) ditemukan pada tahun 1983 oleh Kary Mullis (ilmuwan Amerika). Dia kemudian menerima Hadiah Nobel untuk penemuan ini. Saat ini, diagnostik PCR merupakan salah satu metode paling akurat dan sensitif untuk mendiagnosis penyakit menular.
Reaksi berantai polimerase (PCR)- metode eksperimental biologi molekuler, suatu metode untuk secara signifikan meningkatkan konsentrasi kecil fragmen asam nukleat (DNA) tertentu dalam bahan biologis (sampel).
Metode PCR didasarkan pada penggandaan berulang bagian DNA tertentu menggunakan enzim dalam kondisi buatan (in vitro). Hasilnya, jumlah DNA yang cukup untuk deteksi visual dihasilkan. Dalam hal ini, hanya bagian yang memenuhi kondisi yang ditentukan yang disalin, dan hanya jika bagian tersebut ada dalam sampel yang diteliti.
Selain hanya meningkatkan jumlah salinan DNA (proses ini disebut amplifikasi), PCR memungkinkan banyak manipulasi lain dengan materi genetik (memasukkan mutasi, penyambungan fragmen DNA), dan banyak digunakan dalam praktik biologi dan medis, misalnya , untuk mendiagnosis penyakit (keturunan, menular), untuk menetapkan ayah, untuk mengkloning gen, memperkenalkan mutasi, dan mengisolasi gen baru.

Kekhususan dan Aplikasi

Melaksanakan PCR

Untuk melakukan PCR dalam kasus yang paling sederhana, diperlukan komponen-komponen berikut:

• Templat DNA berisi bagian DNA yang perlu diamplifikasi;
• dua primer yang melengkapi ujung fragmen yang diinginkan;
• DNA polimerase termostabil;
• deoksinukleotida trifosfat (A, G, C, T);
• Ion Mg2+ diperlukan untuk pengoperasian polimerase;
• larutan penyangga.

PCR dilakukan dalam thermal cycler - perangkat yang menyediakan pendinginan dan pemanasan berkala pada tabung reaksi, biasanya dengan akurasi minimal 0,1°C. Untuk menghindari penguapan campuran reaksi, tambahkan minyak dengan titik didih tinggi, seperti Vaseline, ke dalam tabung reaksi. Penambahan enzim spesifik dapat meningkatkan hasil reaksi PCR.
Kemajuan reaksi

Biasanya PCR melakukan 20 – 35 siklus yang masing-masing terdiri dari tiga tahap. Templat DNA beruntai ganda dipanaskan hingga 94 - 96°C (atau 98°C jika digunakan polimerase termostabil khusus) selama 0,5 - 2 menit untuk memisahkan untaian DNA. Tahap ini disebut denaturasi - ikatan hidrogen antara dua rantai hancur. Kadang-kadang, sebelum siklus pertama, campuran reaksi dipanaskan terlebih dahulu selama 2 - 5 menit untuk mendenaturasi matriks dan primer sepenuhnya.
Setelah untaian terpisah, suhu diturunkan agar primer dapat berikatan dengan templat untai tunggal. Tahap ini disebut anil. Suhu anil bergantung pada primer dan biasanya dipilih 4 - 5°C di bawah suhu lelehnya. Waktu panggung adalah 0,5 - 2 menit.

DNA polimerase mereplikasi untai cetakan menggunakan primer sebagai primer. Ini adalah tahap pemanjangan. Suhu perpanjangan tergantung pada polimerase. Polimerase yang umum digunakan paling aktif pada suhu 72°C. Waktu pemanjangan bergantung pada jenis DNA polimerase dan panjang fragmen yang diamplifikasi. Biasanya, waktu perpanjangan diambil satu menit per seribu pasangan basa. Setelah semua siklus selesai, langkah pemanjangan akhir tambahan sering dilakukan untuk menyelesaikan semua fragmen beruntai tunggal. Tahap ini berlangsung 10 - 15 menit.
Mempersiapkan bahan untuk penelitian dan mengangkutnya ke laboratorium

Agar analisis berhasil, penting untuk mengumpulkan materi dari pasien dengan benar dan mempersiapkannya dengan benar. Diketahui bahwa dalam diagnostik laboratorium, sebagian besar kesalahan (hingga 70%) terjadi tepat pada tahap persiapan sampel. Untuk pengambilan darah di laboratorium INVITRO, saat ini digunakan sistem vakum, yang di satu sisi meminimalkan cedera pada pasien, dan di sisi lain, memungkinkan bahan dikumpulkan sedemikian rupa sehingga tidak bersentuhan dengan darah. baik personel maupun lingkungan. Hal ini menghindari terjadinya kontaminasi (kontaminasi) pada bahan dan menjamin objektivitas analisis PCR.

DNA – asam deoksiribonukleat – adalah polimer biologis, salah satu dari dua jenis asam nukleat yang menjamin penyimpanan, transmisi dari generasi ke generasi, dan implementasi program genetik untuk pengembangan dan fungsi organisme hidup. Peran utama DNA dalam sel adalah penyimpanan informasi jangka panjang tentang struktur RNA dan protein.

Asam RNA-ribonukleat adalah polimer biologis yang struktur kimianya mirip dengan DNA. Molekul RNA dibangun dari unit monomer yang sama - nukleotida - seperti DNA. Di alam, RNA biasanya berbentuk untai tunggal. Pada beberapa virus, RNA adalah pembawa informasi genetik. Di dalam sel ia berperan penting dalam transfer informasi dari DNA ke protein. RNA disintesis pada cetakan DNA. Proses ini disebut transkripsi. Ada area dalam DNA yang berisi informasi yang bertanggung jawab untuk sintesis tiga jenis RNA, yang berbeda dalam fungsinya: messenger atau messenger RNA (mRNA), RNA ribosom (rRNA) dan transport RNA (tRNA). Ketiga jenis RNA terlibat dalam sintesis protein dalam satu atau lain cara. Namun informasi sintesis protein hanya terdapat pada mRNA.

Nukleotida adalah unit berulang dasar dalam molekul asam nukleat, produk dari kombinasi kimia basa nitrogen, gula lima karbon (pentosa) dan satu atau lebih gugus fosfat. Nukleotida yang ada dalam asam nukleat mengandung satu gugus fosfat. Mereka diberi nama sesuai dengan basa nitrogen yang dikandungnya - adenin (A), mengandung adenin, guanin (G) - guanin, sitosin (C) - sitosin, timin (T) - timin, urasil (U) - urasil. DNA mengandung 4 jenis nukleotida - A, T, G, C, RNA juga mengandung 4 jenis - A, U, G, C. Gula di semua nukleotida DNA adalah deoksiribosa, RNA - ribosa. Ketika asam nukleat terbentuk, nukleotida berikatan untuk membentuk tulang punggung molekul gula-fosfat, di satu sisinya terdapat basa.

Primer adalah DNA pendek yang digunakan untuk mereplikasi untai cetakan. Masing-masing primer saling melengkapi dengan salah satu helai templat beruntai ganda, membingkai awal dan akhir wilayah yang diamplifikasi.

literatur

1. Glick B., Pasternak J. Bioteknologi molekuler. Prinsip dan Penerapan. Per. dari bahasa Inggris - M.: Mir, 2002. - 589 hal., ilus. ISBN 5-03-003328-9
2. Shchelkunov S.N. Rekayasa genetika - Novosibirsk: Sibirsk. Universitas. penerbit, 2004. - 496 hal.; sakit. ISBN 5-94087-098-8
3. Patrushev L.I. Sistem Genetika Buatan - M.: Nauka, 2005 - Dalam 2 volume - ISBN 5-02-033278-X

PENTING!

Informasi di bagian ini tidak dapat digunakan untuk diagnosis mandiri dan pengobatan mandiri. Jika terjadi nyeri atau eksaserbasi penyakit lainnya, tes diagnostik hanya boleh ditentukan oleh dokter yang merawat. Untuk membuat diagnosis dan meresepkan pengobatan dengan benar, Anda harus menghubungi dokter Anda.

Pasal 00516

Satu blok tes untuk mendiagnosis infeksi genital (urogenital, laten) menggunakan metode PCR

Blok analisis ini meliputi:

• Gardnerella vaginalis (Gardnerella) (penentuan bahan dengan PCR)
• Candida albicans (candida) (penentuan materi dengan PCR)
• HPV, HPV (Human Papillomavirus, human papillomavirus), jenis: risiko onkogenik rendah (6.11) menunjukkan jenisnya; risiko onkogenik tinggi (16,18,31,33,35,39,45,51,52) tanpa menyebutkan jenisnya (penentuan bahan dengan PCR) (penentuan bahan bertemu
• Mycoplasma hominis (human mycoplasma) (penentuan bahan dengan PCR)
• Mycoplasma genitalium (genital mycoplasma) (penentuan bahan dengan PCR)
• Neisseria gonorrhoeae (gonococci) (penentuan bahan dengan PCR)
• Trichomonas vaginalis (Trichomonas) (penentuan bahan dengan PCR)

Untuk apa ini?

Unit optimal untuk mendiagnosis infeksi menular seksual (PMS, IMS), serta penyakit inflamasi pada sistem genitourinari pada pria dan wanita.

Vagina bukanlah lingkungan yang steril. Di vagina, juga di usus dan di kulit, terdapat banyak mikroorganisme berbeda...

Blok ini untuk Anda jika:

• belum pernah diperiksa atau diperiksa lebih dari setahun yang lalu;
• melakukan hubungan seksual tanpa pengaman sejak pemeriksaan terakhir;
• merencanakan kehamilan (kedua pasangan sedang hamil);
• ada keluhan yang muncul misalnya rasa tidak nyaman, gatal, perih, keputihan, bau vagina, rasa iritasi.

Perlu diketahui bahwa banyak infeksi tidak menunjukkan gejala (disebut infeksi laten), jadi Anda sebaiknya melakukan tes PCR tidak hanya jika Anda memiliki keluhan.

Blok ini mencakup indikator berikut:

• Chlamydia trachomatis (klamidia) (agen penyebab klamidia)
• Mycoplasma hominis (mikoplasma manusia)
• Mycoplasma genitalium (mycoplasma genital) (agen penyebab infeksi mikoplasma)
• Ureaplasma parvum (ureaplasma parvum)
• Ureaplasma urealyticum (ureaplasma urealyticum, nama sebelumnya Biovar "T-960")
• Neisseria gonorrhoeae (gonococcus, agen penyebab gonore)
• HPV (Human Papillomavirus, human papillomavirus), jenis risiko onkogenik tinggi: 16,18 dengan tipe terindikasi, 16, 18,31,33,35,39,45,52,67,58,59 tanpa tipe terindikasi
• HPV (Human Papillomavirus, human papillomavirus), jenis risiko onkogenik rendah: 6.11 menunjukkan jenisnya
• HPV (Human Papillomavirus, human papillomavirus), tipe risiko onkogenik tinggi dan rendah: 16,18 dengan tipe terindikasi, 16,18,31,33,35,39,45,52,67,58,59 tanpa tipe terindikasi, 6 , 11 dengan indikasi tipe
• Trichomonas vaginalis (Trichomonas, agen penyebab trikomoniasis)
• Gardnerella vaginalis (Gardnerella)
• Candida albicans (Candida) (agen penyebab kandidiasis)

Gejala utama infeksi ini termasuk gejala penyakit menular seksual

Metode penelitian: PCR.

PCR - reaksi berantai polimerase (PCR) adalah metode diagnostik yang memungkinkan Anda mendeteksi sejumlah kecil materi genetik tertentu dalam materi klinis, memperbanyak dan mengidentifikasinya.

Bahan biologis untuk analisis PCR dipilih tergantung pada lokasi patogen. Namun, untuk memperoleh hasil analisis yang andal, jenis bahan biologis yang direkomendasikan untuk mendeteksi infeksi saluran urogenital adalah noda dari keputihan dan saluran serviks pada wanita dan uretra pada pria.

Jenis bahan biologis untuk diagnostik PCR

• Urin untuk mengisolasi infeksi
• Kerokan dan apusan (serviks, vagina, uretra) untuk infeksi
• Sperma, sekresi prostat
• Darah dan komponennya (serum, plasma, leukosit, dll)
• Kotoran
• Air liur, dahak dan bilasan
• ASI dan sekresi payudara
• Dan sebagainya.

Nilai tes

Hasil untuk setiap patogen: negatif positif

Kondisi untuk mengambil analisis

Tes dapat dilakukan di klinik CIR mana pun selama hari dan jam buka.

Juga ditanya:

• Pemeriksaan bakteriologis sekret saluran serviks dengan penentuan sensitivitas terhadap antibiotik, tanpa sensitivitas terhadap antimikotik

Bagaimana cara menjalani tes di Laboratorium CIR?

Untuk menghemat waktu, lakukan pemesanan untuk analisis di Toko online! Membayar pesanan Anda secara online, Anda mendapat diskon 10% untuk seluruh pesanan yang dilakukan!

Materi terkait

Chlamydia dan Chlamydophila

Klasifikasi modern dari keluarga Chlamydiaceae (chlamydia, chlamydophila)

PCR – reaksi berantai polimerase (PCR, Reaksi Berantai Polimerase)

PCR adalah metode diagnostik DNA yang memungkinkan Anda mengisolasi materi genetik tertentu dalam jumlah yang dapat diabaikan dalam materi klinis, memperbanyak dan mengidentifikasinya.

Klamidia

Klamidia- penyakit bakteri yang disebabkan oleh Klamidia trachomatis.

Mikroflora vagina

Vagina bukanlah lingkungan yang steril. Di vagina, juga di usus dan di kulit, terdapat banyak mikroorganisme berbeda. Dasar mikroflora adalah bakteri asam laktat.

Berbagai program pemeriksaan kesehatan

Pemeriksaan apa saja yang termasuk dalam pemeriksaan kesehatan tahunan? Mengapa penting untuk menjalani pemeriksaan lengkap?

imunoblot

noda(dari bahasa Inggris blot - spot) - metode untuk mengidentifikasi protein, yang disediakan dengan menerapkan molekul terpisah (misalnya, antigen) ke pembawa apa pun.

Diagnostik PCR infeksi pada sperma (ejakulasi)

Analisis PCR saat ini adalah salah satu metode diagnostik molekuler berteknologi tinggi, terjangkau dan efektif, yang digunakan dalam berbagai bidang kedokteran. Paling sering digunakan untuk diagnosis laboratorium penyakit menular pada manusia, termasuk infeksi menular seksual (IMS), dan identifikasi patogen infeksi urogenital yang dapat menyebabkan berbagai penyakit inflamasi pada sistem genitourinari pada pria dan wanita.

Dalam pengobatan modern, teknik penelitian laboratorium presisi tinggi berdasarkan Reaksi Berantai Polimerase lebih penting. Berkat penggunaan teknologi PCR, analisis pada tingkat genetik molekuler dan identifikasi bentuk penyakit keturunan dan infeksi akut dan kronis pada pasien dapat dilakukan jauh sebelum timbulnya gejala klinis.

Apa itu diagnostik PCR

Metode ini dikembangkan oleh ahli biokimia Amerika dan peraih Nobel Carrie Mullis pada tahun 1984.

Banyak spesialis yang berkualifikasi menghadapi pengujian PCR setiap hari dan tidak dapat membayangkan secara akurat mendiagnosis sebagian besar bentuk patologi aktif tanpa hasilnya dalam kasus di mana metode imunologi dan mikrobiologi tidak berhasil. Seringkali virus yang berbeda dapat menyebabkan gejala klinis yang sama, Analisis PCR akan memungkinkan Anda mengidentifikasi patogen pada konsentrasi terendah dalam biomaterial dan mengidentifikasi bahkan sel tunggal virus atau basil.

Tentang diagnostik PCR di video

Dasar diagnostik PCR adalah dalam kondisi laboratorium khusus, amplifikasi berulang (perkalian) bagian DNA tertentu (asam deoksiribonukleat) - materi genetik manusia.

Seluruh proses teknologi penyalinan terdiri dari beberapa tahap:

1. Denaturasi – persiapan sampel, dengan meningkatkan suhu biomaterial (hingga 95 °C), DNA untai 2 dipecah menjadi dua untai terpisah.
2. anil — biomaterial yang diteliti didinginkan dan primer nitrogen (reagen) ditambahkan ke dalamnya, yang memiliki kemampuan untuk secara spesifik mengenali urutan dalam molekul DNA yang hanya merupakan karakteristik agen patogen dan bergabung dengannya.
3. Pemanjangan – reaksi polimerase itu sendiri, penyelesaian situs genetik molekuler yang unik terjadi, di setiap ikatan dengan primer, untai DNA baru terbentuk, yang secara struktural melengkapi untai DNA anak.

Seluruh siklus diulangi 20 - 30 kali. Pada akhirnya, jumlah untai DNA komplementer yang terbentuk cukup untuk analisis visual dan perbandingan hasil dengan data yang tersedia mengenai struktur seluler berbagai patogen. Virus, sifat kemunculannya ditentukan, kekuatan pengaruhnya terhadap tubuh dan jumlah basil yang ada ditentukan. Informasi ini sangat berharga bagi dokter yang merawat ketika meresepkan metode terapi yang efektif dan memilih obat.

Metode diagnostik PCR berbeda dari metode laboratorium lainnya sebagai berikut:

• penentuan langsung keberadaan patogen;
• sensitivitas, spesifisitas, dan keserbagunaan yang tinggi dari prosedur deteksi virus;
• kecepatan analisis;
• kemampuan untuk mendiagnosis patologi tanpa gejala.

Hasil penelitian dapat difoto atau dimasukkan ke dalam media informasi sehingga dapat dinilai oleh ahli yang independen.

Bagaimana cara mempersiapkan diri untuk mengikuti tes PCR dengan benar?

Berbagai biomaterial digunakan untuk penelitian:

• darah;
• lendir;
• air liur;
• air seni;
• dahak;
• kerokan epitel;
• jus prostat;
• kerokan selaput lendir;
• air ketuban;
• jaringan plasenta;
• cairan serebrospinal, sendi atau pleura;
• sekret alat kelamin.

Peralatan laboratorium modern dan profesionalisme dokter laboratorium menjamin pasien yang menjalani analisis PCR mendapatkan hasil yang dapat diandalkan. Namun keakuratan penelitian bergantung pada persiapan pengujian yang tepat dan kepatuhan terhadap semua rekomendasi untuk pemilihan biomaterial.

Mempersiapkan analisis dengan benar tidaklah sulit, penting untuk mengikuti semua aturan yang ada:

1. Sehari sebelum tes, jangan melakukan hubungan seksual.
2. Batalkan kelas olahraga.
3. Jangan mengunjungi pemandian atau sauna sebelum pemeriksaan.
4. Makan malam sebaiknya dilakukan pada malam sebelumnya paling lambat pukul 20.00, jangan makan makanan pedas dan berlemak, dan jangan minum minuman beralkohol.
5. Darah vena harus didonorkan pada pagi hari, sebelum prosedur jangan makan, minum atau merokok.

Bagaimana wanita dan pria menjalani tes PCR - ciri-ciri prosedurnya

Persyaratan umum utama untuk pemilihan biomaterial adalah memperoleh konsentrasi maksimum mikroorganisme dalam sampel dan tidak adanya pengotor yang tidak diinginkan - lendir, darah atau nanah.

Selama pemeriksaan infeksi yang ditularkan melalui hubungan seksual (ureaplasmosis, gardnerellosis, klamidia, mikoplasmosis, trikomoniasis), sekret dari alat kelamin dikumpulkan:

• pada pria, apusan atau kerokan diambil dari saluran kemih (uretra);
• pada wanita - noda atau kerokan dari vagina, saluran serviks.

Saat mengambil bahan dari saluran urogenital, penting untuk menghindari kontaminasi. Untuk tujuan ini, kerokan diambil dari pria tidak lebih awal dari 2 jam setelah buang air kecil terakhir, dari wanita - dengan mempertimbangkan hari-hari siklus menstruasi. Lendir atau nanah berlebih dihilangkan dengan kapas steril, biomaterial dikumpulkan menggunakan probe plastik khusus - ini mengurangi kemungkinan masuknya darah ke dalam sampel.

Prosedur pengambilan kerokan urogenital cukup menyakitkan bagi pria , itulah sebabnya bagian pertama urin setelah retensi semalaman, yang mengandung jumlah epitel terbesar, sering digunakan untuk analisis. Urine ditampung dalam wadah steril dengan penutup yang rapat dan dikirim ke laboratorium selambat-lambatnya dua jam setelah pengumpulan. Di laboratorium, sedimen seluler urin diperoleh untuk pekerjaan selanjutnya dengan sentrifugasi.

Infeksi apa saja yang termasuk dalam kompleks PCR-12?

Diagnostik PCR secara aktif digunakan oleh spesialis berpengalaman. Yang paling diminati adalah diagnosis virus dan infeksi.

Apa saja 12 infeksi yang dapat dideteksi menggunakan diagnostik PCR?	Apa yang terungkap
infeksi HIV	Virus imunodefisiensi manusia tipe 1/2
Hepatitis A, B, C, G	Virus hepatitis HAV, HBV, HCV, HGV
Mononukleosis	virus Epstein-Barr
Infeksi sitomegalovirus	Agen penyebabnya adalah Sitomegalovirus
Infeksi herpes	Virus herpes simpleks tipe 1/2
IMS adalah infeksi yang ditularkan secara seksual	Mikroba patogen - ureaplasma, gardnellera, klamidia, mikoplasma, trichomonas
TBC	Mycobacterium tuberkulosis
Virus onkogenik	Human papillomavirus - Human papillomavirus dan spesies onkogeniknya (14 jenis)
borreliosis	Agen penyebab ensefalitis tick-borne
Listeriosis	Agen penyebabnya adalah Listeria monocytogenes
Kandidiasis	Jamur dari keluarga Candida
Infeksi Helicobacter pylori	Agen penyebabnya adalah Helicobacter pylori

Saat ini, teknik reaksi berantai polimerase memperluas kemungkinan melakukan penelitian - pengenalan genotipe dan penyambungan fragmen DNA jaringan telah tersebar luas di berbagai bidang pengobatan modern:

• ginekologi;
• urologi;
• pulmonologi;
• gastroenterologi;
• hematologi;
• onkologi.

Di mana saya bisa menjalani tes dengan biaya murah di Distrik Federal Ural?

Metode diagnostik PCR modern terus berkembang. Tekniknya sendiri sedang ditingkatkan, jenis PCR baru dan sistem pengujian baru yang digunakan untuk reaksi berantai bermunculan. Inovasi-inovasi ini membuat biaya tes ini lebih terjangkau bagi pasien.