Menggunakan HPLC dan kapiler. Studi farmakokinetik dan bioavailabilitas - jurnal farmakokinetik dan farmakodinamik Kromatografi cair kinerja tinggi

Sebagai naskah

MELNIKOV Igor Olegovich

PERKEMBANGAN METODE MIKRO ANALISIS ASAM AMINO,

PEPTIDA PENDEK DAN OLIGONUKLEOTIDA

MENGGUNAKAN RP HPLC DAN KAPILER

ELEKTROPHORESIS

Keahlian Khusus: 02.00.02 – Kimia analitik

Disertasi untuk gelar calon ilmu kimia

MOSKOW 2006 Pekerjaan disertasi diselesaikan di Departemen Kimia Analitik dari Akademi Teknologi Kimia Halus Negeri Moskow.

M.V. Lomonosov dan dalam kelompok kimia protein analitik dari Institut Kimia Bioorganik dinamai demikian. Akademisi M.M. Shemyakin dan Yu.A. Ovchinnikov dari Akademi Ilmu Pengetahuan Rusia.

Direktur Ilmiah:

Kandidat Ilmu Kimia, Associate Professor Glubokov Yuri Mikhailovich

Lawan resmi:

Doktor Ilmu Kimia, Profesor Makarov Nikolay Vasilievich Kandidat Ilmu Kimia Kirillova Yulia Gennadievna

Organisasi terkemuka:

Institut Fisika Biokimia dinamai demikian. N.M. Emanuel RAS

Pembelaan akan berlangsung pada tanggal 20 Desember 2006 pukul 12:00 pada pertemuan dewan disertasi D 212.120.05 di Akademi Teknologi Kimia Halus Negeri Moskow yang dinamai demikian. M.V. Lomonosov di alamat: 119571, Moskow, Vernadsky Avenue, 86, kamar. M-119.

Disertasi ini dapat ditemukan di perpustakaan Akademi Teknologi Kimia Halus Negeri Moskow yang dinamai demikian. M.V. Lomonosov.

Sekretaris Ilmiah Dewan Disertasi, Calon Ilmu Kimia Yu.A. Efimova Relevansi bekerja. Saat ini, penelitian klinis semakin terfokus pada penggunaan metode mikroanalitik instrumental untuk mendiagnosis penyakit yang paling umum dan berbahaya secara sosial. Sebagian besar metode ini tidak sepenuhnya dan tidak selalu memberikan diagnosis yang tepat waktu dan berkualitas tinggi, yang seringkali tidak memenuhi persyaratan modern untuk memantau status biokimia seseorang.

Asam amino bebas dan peptida pendek yang merupakan bagian dari cairan fisiologis memiliki arti fungsional yang penting. Dalam beberapa kasus, mereka dapat bertindak sebagai penanda molekuler penyakit tertentu.

Perubahan konsentrasinya sering dikaitkan dengan gangguan metabolisme, yang mengindikasikan perkembangan penyakit tertentu. Sebagian besar metode analisis asam amino yang ada tidak cukup sensitif dan selektif untuk mengidentifikasinya, atau memerlukan derivatisasi asam amino, yang secara signifikan mempersulit proses penentuannya. Masalah analisis asam amino bebas yang dikodekan secara genetis secara sederhana dan hemat biaya belum sepenuhnya terselesaikan. Pada saat yang sama, analisis klinis asam amino memerlukan modifikasi sebelum atau sesudah kolom untuk penentuan yang sangat sensitif dan selektif. Perubahan kandungan penanda molekuler dalam cairan fisiologis juga dapat dikaitkan dengan kecenderungan genetik pasien terhadap penyakit tertentu. Oleh karena itu perlunya dilakukan analisis perbandingan fragmen DNA guna meningkatkan keandalan penentuan penyebab penyakit yang diteliti dan terapinya yang lebih efektif.

Sementara itu, peralatan impor yang diperlukan untuk analisis asam amino dan nukleotida biasanya mahal dan tidak dapat diakses oleh sebagian besar laboratorium klinis. Situasi ini semakin diperburuk oleh kenyataan bahwa banyak perangkat yang sangat terspesialisasi untuk setiap jenis penyakit, akibatnya terdapat banyak duplikasi metode diagnostik, baik dalam peralatan maupun metodologi.

Hal ini secara tajam meningkatkan biaya studi klinis dan mempersulit perbandingan.Penulis mengucapkan terima kasih kepada ketua kelompok kimia protein analitik di Institut Kimia Bioorganik Akademi Ilmu Pengetahuan Rusia, peneliti senior, kandidat ilmu kimia. I.V. Nazimov atas bantuan, perhatian, dan diskusi hasilnya yang terus-menerus.

interpretasi hasil analisis yang diperoleh. Dengan demikian, pengembangan metode baru yang memperluas kemungkinan penggunaan peralatan analitik produksi dalam negeri yang tersedia untuk umum untuk penentuan asam amino bebas dan termodifikasi, peptida pendek dan oligonukleotida yang sangat sensitif, cepat dan andal baik untuk analisis struktural biopolimer dan fragmennya, dan untuk tujuan diagnostik klinis merupakan tugas ilmiah yang mendesak.

Tujuan pekerjaan. Tujuan pekerjaan disertasi adalah pengembangan kompleks metode mikro instrumental yang sangat sensitif untuk analisis asam amino bebas dan termodifikasi, peptida pendek dan oligonukleotida menggunakan basis instrumental dalam negeri.

Kebaruan ilmiah.

1. Metode telah dikembangkan untuk penentuan asam α-amino yang dikodekan secara genetik tidak dimodifikasi menggunakan elektroforesis zona kapiler dan kromatografi elektrokinetik misel dengan metode deteksi fotometrik dan refraktometri UV langsung.

2. Metode penentuan gabungan aminotiol molekul rendah dalam plasma darah menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi fase terbalik dan elektroforesis zona kapiler dengan metode fluorimetri dan deteksi fotometri UV langsung telah dikembangkan dan diterapkan dalam praktik klinis.

3. Sebuah metode telah dikembangkan untuk menentukan fragmen gen mutan untuk trombosis vena berdasarkan analisis produk reaksi berantai polimerase spesifik alel menggunakan elektroforesis gel kapiler dengan deteksi fluorimetri.

Signifikansi praktis . Metode analisis asam amino yang dikembangkan memungkinkan untuk menentukan jumlah mikro asam amino yang dikodekan secara genetik tanpa derivatisasi awal, yang secara signifikan menyederhanakan skema analisis yang ada. Serangkaian metode untuk menganalisis penanda molekuler dari kecelakaan vaskular (homosistein, sistein, glutathione), serta fragmen gen mutan untuk trombosis vena, telah dikembangkan dan diusulkan untuk penggunaan praktis. Sebagai hasil dari pekerjaan yang dilakukan, dimungkinkan untuk menunjukkan kemungkinan penggunaan peralatan rumah tangga yang efektif untuk analisis biokimia komponen protein dan nukleat pada perangkat yang sama untuk elektroforesis kapiler. Penentuan asam amino dan peptida yang mengandung sulfur dalam plasma darah menggunakan metode yang dikembangkan dalam penelitian ini digunakan untuk menilai faktor risiko lusinan pasien dengan kondisi infark dan pra-infark yang dapat diandalkan. Hasil pekerjaan yang dilakukan digunakan dalam pembuatan dan pengujian dalam praktik analisis biomedis dari seperangkat instrumen dan metode otomatis yang universal dan ekonomis untuk diagnostik molekuler beberapa penyakit penting secara sosial (serangan jantung, stroke, trombosis), yang dikembangkan di Institut Instrumentasi Analitik dari Akademi Ilmu Pengetahuan Rusia.

Diajukan untuk pembelaan:

metode untuk menentukan asam amino yang dikodekan secara genetik dalam larutan berair tanpa derivatisasi awal menggunakan elektroforesis zona kapiler dan kromatografi elektrokinetik misel;

kondisi yang dioptimalkan untuk derivatisasi aminotiol plasma dengan berat molekul rendah menggunakan reagen fluorogenik (monobromobimane dan 5-iodoacetamidofluorescein);

metode analisis aminotiol dengan berat molekul rendah dalam plasma darah menggunakan RP HPLC dan elektroforesis kapiler;

hasil penentuan kandungan homosistein dalam plasma darah dengan metode RP HPLC dan elektroforesis zona kapiler;

metode untuk menentukan gen mutan untuk trombosis vena menggunakan elektroforesis gel kapiler dalam poli-N,N'dimetilakrilamida linier.

Persetujuan pekerjaan. Hasil utama karya-karyanya dipresentasikan pada Simposium Seluruh Rusia ke-8 tentang Kromatografi Cair Molekuler dan Elektroforesis Kapiler (15-19 Oktober 2001, Moskow, Rusia), Simposium Internasional ke-3 tentang Metode Pemisahan dalam Biosains (13-18 Mei 2003, Moskow, Rusia , ), Konferensi Internasional Mahasiswa Sarjana dan Pascasarjana Ilmu Pengetahuan Dasar "Lomonosov-2005" (Bagian Kimia. 12-15 April 2005, Moskow, Rusia), Konferensi Ilmiah dan Praktis ke-2 "Masalah Terkini Bioteknologi Medis" (12 September -14 2005, Anapa, Rusia), Kongres ke-3 Masyarakat Bioteknologi Rusia dinamai. Yu.A. Ovchinnikov (25-27 Oktober 2005, Moskow, Rusia), konferensi ilmuwan muda pertama di MITHT. M.V. Lomonosov (13-14 Oktober 2005, Moskow, Rusia), Kongres Internasional Ilmu Analitik ICAS-2006 (25-30 Juni 2006, Moskow, Rusia), Kongres Internasional ke-31 Federasi Masyarakat Biokimia Eropa (24-29 Juni , Istanbul, Turki), Simposium Internasional ke-26 tentang Pemisahan Protein, Peptida dan Polinukleotida (16-20 Oktober 2006, Innsbruck, Austria).

Publikasi. Berdasarkan materi disertasi, diterbitkan 12 karya dalam bentuk artikel dan abstrak.

Struktur disertasi. Disertasi terdiri dari pendahuluan, tinjauan pustaka, bagian eksperimen, pembahasan hasil, kesimpulan dan daftar literatur yang dikutip.

Materi disertasi disajikan dalam 147 halaman, berisi 19 tabel dan 42 gambar. Daftar sumber sastra terdiri dari 187 judul.

Dalam pendahuluan alasan topik diberikan, tujuan penelitian dan ketentuan yang diajukan untuk pembelaan dirumuskan, kebaruan ilmiah dan signifikansi praktisnya dicatat. Data diberikan mengenai pengujian dan publikasi hasil penelitian, serta struktur dan ruang lingkup disertasi.

bab pertama. Informasi umum tentang metode yang ada untuk menganalisis senyawa yang diteliti disediakan. Metode kromatografi dan sejumlah metode identifikasi yang diterima secara umum dijelaskan secara lebih rinci. Metode untuk menentukan aminotiol dengan berat molekul rendah dalam plasma darah, serta fragmen DNA, dipertimbangkan. Perbandingan metode yang ada untuk analisis asam amino, peptida pendek dan oligonukleotida telah dilakukan dan relevansi penelitian lebih lanjut di bidang ini dibuktikan.

Bab 2. Data disediakan tentang bahan, reagen, metode pembuatan larutan yang digunakan dan pelaksanaan pekerjaan.

Bagian 3. Hasil dan Diskusi.

Kandungan asam amino bebas (AA) dalam cairan fisiologis merupakan parameter diagnostik sejumlah penyakit. Penelitian yang dilakukan bertujuan untuk mengembangkan teknik yang memungkinkan mereka memisahkan dan mengidentifikasinya dengan cepat dan andal. Analisis campuran AA tersebut dilakukan dengan menggunakan elektroforesis zona kapiler (CZE) dan kromatografi elektrokinetik misel Indeks bias AA dengan metode CZE menggunakan campuran AA dengan metode CZE dengan panjang deteksi refraktometri 90 cm, panjang efektif 75 cm .

A) Buffer: 60 mM natrium borat, pH 11,0. Tegangan: 20 kV. Saat ini: 93 μA. Suhu: 21,0 °C dari komposisi optimal sampel listrik latar belakang Waktu injeksi: 7,0 detik (elektrokinetik, tegangan selama injeksi sampel - 5 kV). Troll yang diperkenalkan. Untuk tujuan ini, jumlah AA yang diuji - 0,1 ng; alanin, tirosin – 0,2 ng.

4 – Prolin; 5 – Alanin; 6 – Tirosin; 7 – Serin; - Asam aspartat; 9 – Metionin.

Sistem buffer CAPS, serta berbagai kombinasinya menggunakan contoh model campuran 8 AA dengan radikal yang sifat dan sifatnya berbeda serta nilai pKa gugus amino yang paling berbeda. Contoh pemisahan campuran tersebut menggunakan elektrolit pendukung borat ditunjukkan pada Gambar 1.

Elektrolit latar belakang yang optimal untuk pemisahan AA bebas dengan metode ini adalah larutan yang mengandung 60 mM buffer borat (pH 11,0).

Dengan menggunakannya, pengaruh berbagai faktor (tegangan, arus, diameter internal dan panjang efektif kapiler, metode pemasukan sampel) terhadap efisiensi pemisahan dipelajari dan ditunjukkan bahwa dalam kondisi eksperimental tidak mungkin untuk memisahkan campuran sepenuhnya. dari semua AA yang dikodekan. Berdasarkan percobaan, AC yang perbedaan waktu migrasinya melebihi 1 menit dapat dipisahkan. Oleh karena itu, metode CZE klasik tidak dapat memisahkan dan mengidentifikasi keberadaan glisin, alanin, valin, leusin, isoleusin, histidin, fenilalanin dan tirosin, serta aspartat, asam glutamat, dan sistein. Koefisien selektivitasnya sangat rendah dan mendekati 1. Arginin, lisin, prolin, serin, asam aspartat, dan metionin mudah diisolasi dan diidentifikasi, mis. AK memiliki waktu migrasi 5,5-10,0, 15 dan 19,5-20,8 menit. Koefisien selektivitas kelompok AK ini berada pada kisaran 1,1 – 1,3. Saat menggunakan elektrolit pendukung fosfat (pH 11,4), pola pemisahan keseluruhan serupa diamati, namun dengan resolusi puncak yang lebih buruk. Studi yang dilakukan menunjukkan bahwa CZE klasik dengan terminasi refraktometri memungkinkan, dalam kasus terbaik, pemisahan lengkap dan identifikasi tidak lebih dari 8 AA dalam larutan air. Dalam hal ini, kandungan AA individu dari yang tidak dapat dipisahkan yang ditunjukkan dalam campuran tersebut tidak boleh melebihi dua.

Efisiensi pemisahan AA meningkat secara nyata dengan menambahkan metanol ke elektrolit latar belakang dengan pH 7. Saat menggunakan 150 mM buffer fosfat (pH 2,0) dengan penambahan 30% vol. metanol, adalah mungkin untuk memisahkan 16 dari 20 AA yang dikodekan secara genetik (Gbr. 2). Sayangnya, diperlukan waktu yang cukup lama untuk memisahkan campuran ini sepenuhnya.

Kapiler: diameter dalam 75 µm, panjang total – 65 cm, panjang efektif – 50 cm.

Suhu: 28,0 oC. Waktu injeksi sampel: 1,5 detik (vakum).

Identifikasi: 1 - lisin, 2 - arginin, 3 - histidin, 4 - glisin, 5 - alanin, 6 - valin, 7 - isoleusin, 8 - leusin, 9 - serin, 10 - treonin, 11 - metionin, 12 - fenilalanin, 13 – asam glutamat, 14 – prolin, 15 – asam aspartat, 16 – tirosin.

Karena penerapan CZE klasik pada pH 7 tidak memberikan kualitas pemisahan yang diperlukan, diputuskan untuk menerapkan metode MEKC dengan deteksi UV langsung pada analisis AA bebas. Natrium dodesil sulfat (SDS) ditambahkan ke larutan buffer sebagai deterjen. Selama pekerjaan, berbagai konsentrasi komponen elektrolit latar belakang digunakan. Hasil terbaik diperoleh dengan menggunakan elektrolit latar yang mengandung 133 mM asam borat, 33 mM natrium borat dan 100 mM SDS, pH 9,5. Penggunaan elektrolit dengan komposisi tertentu secara signifikan meningkatkan jumlah AA yang dianalisis sekaligus menentukannya pada nilai pH elektrolit latar belakang yang terletak di wilayah utama. Pada Gambar. Gambar 3 menunjukkan elektroforogram campuran 14 AA.

Beras. 3. Pemisahan campuran 14 AA bebas dengan kromatografi elektrokinetik misel dengan deteksi UV langsung Kapiler: diameter dalam 50 μm, panjang total 122 cm, panjang efektif 35 cm.

133 mM asam borat, 33 mM natrium tetraborat (pH 9,5) 100 mM natrium dodesil sulfat. Tegangan: 20 kV. Saat ini: 48 μA. Suhu: 27,5 oC. Waktu injeksi sampel: 3,0 detik (vakum).

Jumlah AA yang diberikan adalah 5,0 ng. Alanin, valin, isoleusin dan glisin – 7.0 ng.

Identifikasi: 1 – Valin, 2 – Alanin, 3 – Isoleusin, 4 – Glisin, 5 – Serin, 6 – Threonine, 7 – Tirosin, 8 – Histidin, 9 – Fenilalanin, 10 – Arginin, 11 – Lisin, 12 – Sistein, 13 – Metionin, 14 – Asam glutamat. * - Puncak sistem.

Nilai waktu migrasi yang diperoleh patut diperhatikan.

Meskipun panjang kapiler efektif lebih kecil, biasanya lebih tinggi dibandingkan dengan CZE klasik, yang cukup sesuai dengan sifat MEKC. Hal ini mungkin juga berhubungan dengan besarnya tegangan yang diberikan per satuan panjang kapiler. Perbedaan waktu migrasi yang diperlukan untuk pemisahan AC jauh lebih kecil dibandingkan dengan kasus CZE. Cukup 0,5 menit saja.

Sebuah studi yang lebih rinci dilakukan pada kondisi pemisahan 14 AA yang dikodekan secara genetik, biasanya terdapat dalam plasma darah donor sehat dalam keadaan bebas. Pengaruh pH dan penambahan berbagai pelarut organik ke elektrolit latar belakang pada tingkat resolusi puncak dipelajari. Dari percobaan berikut bahwa untuk mencapai pemisahan sempurna campuran 14 AA, nilai pH harus berada pada kisaran 9,0-10,0. Pada nilai pH di luar kisaran yang ditentukan, resolusi AK yang diperlukan tidak tersedia. Jelasnya, pada pH 9 hal ini disebabkan oleh perbedaan antara nilai pKa (AA), dan pada pH 10 disebabkan oleh dekomposisi parsial konjugat DDSNAC. Pengaruh penambahan pelarut organik dipelajari menggunakan metanol, 2-propanol dan asetonitril. Data yang diperoleh menunjukkan bahwa penambahan pelarut organik menyebabkan perubahan signifikan pada waktu migrasi dan koefisien selektivitas. Sifat perubahan ditentukan oleh sifat dan konsentrasi bahan tambahan. Metanol dan asetonitril tidak meningkatkan pemisahan AA yang diteliti, hal ini tampaknya disebabkan oleh rendahnya kemampuannya untuk membentuk konjugat campuran AA-SDS-R, di mana R adalah molekul pelarut organik. Penambahan 3-5% 2-propanol secara signifikan meningkatkan derajat resolusi komponen, dengan peningkatan waktu migrasi AA yang relatif kecil. Dengan peningkatan konsentrasi 2-propanol, ada peningkatan nyata dalam waktu migrasi AA, yang menyebabkan penurunan kecepatan penentuan. Penelitian yang dilakukan secara khusus menunjukkan bahwa pemisahan AA terbaik dengan adanya pelarut organik (2-propanol) dalam jumlah efektif terjadi jika elektrolit latar belakang mengandung 50 mM asam borat, 33 mM natrium borat, dan 50 mM SDS. Pada Gambar. Gambar 4 menunjukkan elektroforogram campuran 14 AA.

Data yang disajikan menunjukkan pemisahan efektif 13 dari 14 AA yang dikodekan secara genetik. Total waktu pemisahan tidak melebihi min. Waktu migrasi Sr adalah 0,03. Nilai Sr yang sedikit lebih besar, mendekati 0,06-0,08, diamati untuk alanin, valin, dan histidin.

Beras. 4. Pemisahan campuran 14 AA oleh MEKC dengan deteksi UV langsung Kapiler: diameter dalam 75 μm, panjang total 61 cm, panjang efektif 41 cm.

Buffer: 33 mM natrium tetraborat, 100 mM asam borat, 50 mM SDS, 5% 2-propanol, pH=10,2. Tegangan: 25 kV. Saat ini: 65 μA. Suhu: 29,5 oC. Waktu injeksi sampel: 1,5 detik (vakum). Jumlah AA yang diberikan adalah 0,5 ng.

Identifikasi: 1 -Lisin; 2 - Prolin; 3 - Fenilalanin; 4 - Alanin; 5 - valin; 6 - Glisin;

7 - Histidin; 8 - Tirosin; 9 – Leusin + Isoleusin; 10 - Serin; 11 - Treonin; 12 - Asam glutamat; 13 - Sistein.

Tingkat resolusi yang dicapai memungkinkan dilakukannya studi tentang penentuan kuantitatif AA yang dipertimbangkan. Analisis campuran model 14 AA dengan komposisi yang diketahui telah dilakukan. Penelitian telah menunjukkan bahwa metode MEKC dengan deteksi UV langsung menggunakan larutan buffer borat yang mengandung 3-5% 2-propanol memungkinkan untuk mengukur 14-16 AA yang dikodekan secara genetik dengan kesalahan (Sr) 6-8% dalam waktu kurang dari 30 menit. Keakuratan hasil yang diperoleh juga dilakukan dengan menggunakan metode “entered-found” (Tabel 1) Verifikasi kebenaran penentuan kandungan AA yang dikodekan secara genetik menggunakan metode MEKC (mo(AA) = 0,50 ng; dimasukkan - 1,00 ng) Analisis homosistein dan aminotiol dengan berat molekul rendah lainnya dalam plasma darah Homosistein (Hcy) dan aminotiol (AT) yang menyertainya (asam amino berkode - sistein (Cys), tripeptida glutathione (GSH)) dalam plasma darah adalah penanda molekuler disfungsi sistem kardiovaskular. Tujuan utama dari penelitian ini adalah untuk mengembangkan metode untuk menentukan kandungan homosistein sebagai faktor risiko yang dapat diandalkan untuk penyakit tersebut.

Analisis kuantitatif aminotiol dengan berat molekul rendah dalam plasma darah meliputi reduksi ikatan disulfida, deproteinisasi plasma darah, modifikasi aminotiol dengan reagen yang sesuai, pemisahan dan identifikasi aminotiol yang dimodifikasi dengan RP HPLC atau CE dengan satu atau beberapa metode deteksi. Dalam penelitian ini, aminotiol yang teroksidasi dan terikat protein direduksi dengan trifenilfosfin. Untuk menghilangkan kation logam berat, digunakan aditif EDTA. Teknik reduksi yang diusulkan memberikan reduksi disulfida yang cepat (15 menit) dan lengkap (96%) serta pelepasan gugus sulfhidril pada suhu kamar. Hasil reaksi reduksi ditentukan dengan menggunakan prosedur standar untuk mengukur kandungan AT bebas. Protein plasma dengan berat molekul tinggi diendapkan dengan asam 5-sulfosalisilat.

Konsentrasinya dioptimalkan selama penelitian, yang menghindari hilangnya sensitivitas akibat pengenceran selama tahap netralisasi.

Modifikasi sulfhidril bebas dilakukan dengan monobromobimane (mBrB) atau 5-iodoacetamido-fluorescein (5-IAF). Nilai pH yang diperlukan dipertahankan dengan menggunakan dietanolamina (pK a = 8,9) dan natrium ortofosfat, tergantung pada reagen yang digunakan untuk modifikasi AT. Penggunaan dietanolamina memungkinkan pengendalian langsung pembentukan produk target dengan spektrometri massa. Untuk mengidentifikasi turunan AT, digunakan metode deteksi fotometrik dan fluorimetri. Turunannya dikarakterisasi dengan spektroskopi serapan, fluorimetri dan massa (MALDI-TOF, ESI). Deteksi fotometrik dan fluorimetri dilakukan pada panjang gelombang yang dipilih berdasarkan spektrum serapan (Hcy-MB - 234 nm) dan spektrum fluoresensi turunan Hcy (390 nm (eksitasi) dan 478 nm (fluoresensi)). Dari spektrum fluoresensi konjugat Hcy-AF, selama deteksi fluorimetri, panjang gelombang optimal untuk eksitasi adalah 462 nm, dan untuk fluoresensi, 504 nm.

Untuk menyatukan metode untuk menentukan dan memverifikasi kemungkinan mendasar menggunakan detektor yang sama untuk mengidentifikasi turunan monobimane dan fluorescein, efisiensi eksitasi pada panjang gelombang 390 nm dipelajari. Intensitas fluoresensi yang dihasilkan maksimum, dan sebagai konsekuensinya, sensitivitas deteksi adalah urutan besarnya lebih rendah dibandingkan saat menggunakan radiasi pada panjang gelombang 462 nm untuk eksitasi.

Turunan AT monobromobimane (MB) dan acetamidofluorescein (AF) individu, serta campuran modelnya, dianalisis. Turunan monobromobiman individu Cys, Hcy dan GSH dielusi dengan waktu retensi (min) masing-masing 6,01 ±0,19, 10,76 ±0,17 dan 11,89 ±0,11 (Gbr. 5)1.

Waktu retensi yang sama dipertahankan bila menggunakan campuran aminotiol dengan komposisi yang diketahui. Data eksperimen yang diperoleh memungkinkan untuk menghitung hasil reaksi modifikasi. Jumlahnya tidak kurang dari 97%, yang sesuai dengan data yang diketahui, namun diperoleh dalam kondisi persiapan sampel yang lebih ketat. Turunan yang dihasilkan diisolasi dari campuran dan dikarakterisasi dengan spektrometri massa.

Turunan fluorescein Cys, Hcy dan GSH dielusi dengan waktu retensi (min) 8,49 ± 0,12; 10,46 ±0,15 dan 12,96 ±0,14, masing-masing (Gbr. 6).

Analisis kromatografi dilakukan pada kromatografi cair kinerja tinggi domestik “MiliChrom A-02” (EkoNova, Novosibirsk) Gambar. 5. RP HPLC dari model campuran aminotiol yang dimodifikasi dengan monobromobimane. Cys-MB-50,0 µM, Hcy-MB-25,0 µM, GS-MB-25,0 µM.

Deteksi fluorimetri (exc = 390 nm, exp = 478 nm) Gambar. 6. RP HPLC dari model campuran aminotiol yang dimodifikasi dengan 5-iodoacetamidofluorescein. Cys-AF-100,0 µM, Hcy-AF-150,0 µM, GS-AFµM. Deteksi fluorometri (abs = 390 nm, esp = 478 nm) Saat menggunakan 5-IAF sebagai label, resolusi puncak konjugat tiol-fluoresen yang lebih baik dicapai dibandingkan dengan konjugat tiol-monobimane. Hasil reaksi modifikasi AT 5-IAF, yang ditentukan secara eksperimental dengan mengurangi intensitas puncak label fluoresen, adalah 95%. Semua turunan yang dihasilkan diisolasi dari campuran dan dikarakterisasi dengan spektrometri massa.

Data yang diperoleh menjadi dasar pengembangan metode penentuan kuantitatif homosistein. Untuk membuat kurva kalibrasi, sampel campuran dengan kandungan 2,5 hingga 100 μM digunakan. Interval yang dipilih mencakup kisaran konsentrasi fisiologis Hcy (5-50 μM). mBrB digunakan sebagai label. Ketergantungan kalibrasi yang dihasilkan dari area puncak kromatografi pada kandungan homosistein dalam campuran adalah linier sepanjang rentang konsentrasi yang dipelajari dan dijelaskan dengan persamaan:

Deviasi standar relatif dari hasil penentuan berdasarkan luas puncak tidak melebihi 0,083, dan berdasarkan waktu pemulihan – 0,026. Batas deteksi deteksi fluorimetri turunan MB adalah 1 μM (Gbr. 7).

Beras. 7. Perubahan luas puncak kromatografi tergantung pada konsentrasi Hcy Efektivitas metode ini dikonfirmasi dengan membandingkan kromatogram yang diperoleh untuk zat individu dan untuk sampel plasma darah yang dibuat menggunakan metode yang diusulkan. Studi yang dilakukan memungkinkan untuk mengembangkan metode penentuan kuantitatif homosistein, sistein dan glutathione dalam plasma darah dan berhasil menggunakannya untuk analisis rutin antibodi yang disebutkan di atas dalam bentuk turunan MBnya (Gbr. 8) . Saat mengembangkan metode, pengendalian tambahan dilakukan dengan menggunakan metode “dimasukkan-ditemukan” (Tabel 2).

Beras. 8. RP HPLC plasma darah dari donor sehat. Cys-MB-192,4 µM, HcyMB-10,1 µM, GS-MB-15,7 µM. Deteksi fluorimetri Penentuan Hcy dalam bentuk turunan MB menggunakan mikrokolom HPLC Dengan menggunakan metode yang dikembangkan, lebih dari 50 sampel plasma darah dari pasien sehat dan mereka yang menderita penyakit kardiovaskular dengan tingkat keparahan yang berbeda-beda dianalisis. Untuk pasien sehat, rata-rata kandungan (μM) AT dalam plasma darah yang diperoleh dari vena pada waktu perut kosong di pagi hari adalah:

untuk Hcy 12,75 ±3,21, untuk GSH 9,53 ±1,17 dan untuk Cys 206,34 ±24,61. Nilai konsentrasi yang diperoleh berada dalam kisaran nilai referensi yang diberikan dalam literatur. Untuk pasien yang menderita penyakit kardiovaskular, konsentrasi Hcy yang ditemukan dalam plasma darah bergantung pada tingkat keparahan penyakitnya. Hasilnya berkorelasi dengan kondisi klinis pasien.

Kemungkinan menganalisis AT menggunakan metode deteksi yang lebih murah dan umum seperti fotometrik diselidiki. Percobaan menunjukkan bahwa ia memberikan sensitivitas yang memungkinkan seseorang untuk menentukan tingkat AT yang tinggi secara patologis dalam plasma darah. Saat menggunakan deteksi fotometrik, lebih baik menggunakan 5-IAF sebagai label karena dapat menyelesaikan puncak ke garis dasar (Gbr. 9), sehingga memungkinkan dilakukannya kuantisasi.

Beras. 9. RP HPLC model campuran aminotiol yang dimodifikasi dengan monobromobimane (a) dan 5-iodoacetamidofluorescein (b). A) Cys-MB-50,0 µM, HcyMB-25,0 µM, GS-MB-25,0 µM. B) Cys-AF-50,0 µM, Hcy-AF-75,0 µM, GS-AF- 25,0 µM. Deteksi fotometrik (a = 234 nm, b = 250 dan 300 nm) Dengan demikian, pekerjaan yang dilakukan memungkinkan untuk mengoptimalkan tahap persiapan sampel, melakukannya dalam “kondisi ringan” dengan jaminan hasil kuantitatif dari komponen yang dianalisis. Atas dasar itu, sebuah metode telah dikembangkan yang memungkinkan seseorang dengan cepat dan andal menentukan kandungan antibodi dengan berat molekul rendah dalam plasma darah pasien sehat dan sakit. Kesalahan pengukuran tidak melebihi 8,5%. Batas bawah kisaran konsentrasi yang diukur (2,5 μM) menunjukkan kemungkinan mendasar penggunaan teknik ini untuk menentukan penurunan kandungan Hcy dalam plasma darah. Batas deteksi metode yang dijelaskan adalah 1 µM. Metode yang dikembangkan telah diuji pada sampel nyata plasma darah pasien dan dapat digunakan untuk penggunaan rutin.

Penentuan homosistein dan aminotiol dengan berat molekul rendah lainnya dalam plasma Gambar. 10. CZE campuran model AT, mempunyai waktu migrasi sebesar 6,18 ±0,16; sistein dimodifikasi mBrB Hcy-MB-700.0 µM, Cys-MB-300.0 µM 6.83 ± 0.20 dan glutathione - 8.54 ± 0.17 menit, masing-masing (Gbr. 10). Dibandingkan dengan GS-MB- 700,0 µM. (menyerap = 234 nm).

Kapiler: diameter dalam 50 µm, menggunakan metode HPLC CZE penuh, memungkinkan panjang 82 cm, panjang efektif 62 cm.

Buffer: 50 mM natrium tetraborat pH=11,0. kurangi waktu analisis AT sebanyak 2-3 menit.

Tegangan: 25 kV. Saat ini: 58 μA.

(vakum) deteksi UV langsung tidak cukup untuk menentukan sejumlah kecil Hcy dalam plasma darah. Pada kandungan homocysten 10 µM, rasio sinyal/latar belakang adalah 2,5-3, dan deviasi standar relatif berada pada kisaran 0,3-0,5. Metode ini dapat diterapkan untuk mengontrol kandungan Hcy dalam plasma darah pasien dengan kadar Hcy yang tinggi secara patologis (25 µM). Deviasi standar relatif ketika menentukan konsentrasi ini adalah 0,12 untuk MB-Cys, 0,18 untuk MB-Hcy dan 0,17 untuk MB-GS.

Elektroforesis zonal kapiler dengan deteksi fluorimetri dilakukan pada alat analisa ion kapiler “Nanofor 02” (INP RAS, St. Petersburg) Analisis Hcy berupa turunan MV menggunakan RP HPLC dengan fluorimetri dan CZE dengan deteksi fotometri (n = 5; P = 0,95) Model campuran turunan AF dipelajari dengan metode CZE dengan deteksi fotometrik langsung (Gbr. 11) dan fluorimetri (Gbr. 12) (Tabel 3). Deteksi fotometrik dilakukan pada panjang gelombang 492 nm, yang sesuai dengan panjang gelombang eksitasi 5-IAF. Untuk deteksi fluorimetri, panjang gelombang eksitasi adalah 473 nm dan panjang gelombang emisi 514 nm. Telah ditetapkan bahwa penggunaan 5-IAP memungkinkan untuk meningkatkan sensitivitas penentuan Hcy dengan metode CZE dengan deteksi fluorimetri.

Absorbansi, 492 nm Gambar. Gambar 11. CZE model campuran AT, mo- Gambar. 12. CZE dari campuran model AT yang dimodifikasi dengan 5-iodoacetamidofluorescein termodifikasi 5-iodoacetamidofluorescein dengan fluorescein UV langsung dengan fluorimetri Hcy-AF-100.0 µM, Cys-AF-300.0 µM, GS-AF-Hcy-AF-15, 0 µM, Cys-AF-15.0 µM, GS-AFµM. (abs = 473 nm, exp = 514 nm) 700,0 µM. (menyerap = 492 nm).

Kapiler: diameter dalam 50 µm, total Kapiler: diameter dalam 50 µm, panjang total 68 cm, panjang efektif 53 cm, panjang 65 cm, panjang efektif 57 cm.

Buffer: 25 mM natrium tetraborat, 25 mM fosfat Buffer: 25 mM natrium tetraborat, 25 mM natrium fosfat pH = 11,2. Tegangan: 20 kV. Kekuatan saat ini: natrium pH = 11,2. Tegangan: 20 kV. Kekuatan saat ini:

22 μA. Suhu: 25,0 oC. Waktu masukannya adalah 18 μA. Suhu: 25,0 oC. Waktu injeksi sampel: 5 s (elektrokinetik, tegangan pada: 5 s (elektrokinetik, tegangan pada) Metode yang dikembangkan untuk menentukan kandungan homosistein dalam plasma darah menggunakan RP HPLC dan elektroforesis kapiler telah diperkenalkan ke dalam praktik analisis biomedis oleh JSC Teknologi Medis, Ltd.

menggunakan elektroforesis gel kapiler. Perubahan kandungan penanda molekuler dalam cairan fisiologis mungkin juga disebabkan oleh kecenderungan genetik pasien terhadap penyakit tertentu. Oleh karena itu perlunya dilakukan analisis perbandingan fragmen DNA guna meningkatkan keandalan penentuan penyebab penyakit yang diteliti dan terapinya yang lebih efektif.

Dalam karya ini, kami menyelidiki kemungkinan menggunakan peralatan CE domestik yang tersedia untuk menentukan mutasi pada molekul DNA menggunakan contoh fragmen gen mutan untuk trombosis vena, menggunakan PCR spesifik alel. Nukleotida dipisahkan dengan elektroforesis gel kapiler (CGE) menggunakan kapiler kaca kuarsa yang tidak dimodifikasi dengan diameter 25 hingga 100 μm. Poli-N,N-dimetilakrilamida linier (pDMA) produksi dalam negeri digunakan sebagai matriks pemisahan. Pemilihan polimer ini terkait dengan kemungkinan penggunaannya pada CGE versi chip. pDMA disintesis di Synthol JSC dari monomer dimetilakrilamida melalui polimerisasi radikal. Panjang rantai dikontrol dengan mengubah suhu atau menambahkan pemulung radikal. Polimer yang mengandung 5-8% monomer pDMA digunakan. 0,1 M TBE (0,1 M TRIS, 0,1 M asam borat, dan 2,5 mM EDTA; pH = 8,3) dan 0,1 M TAPS (N-tris(hidroksimetil)metil) digunakan sebagai elektrolit latar belakang.asam 3-aminopropanesulfonat; pH = 8,3) Semua polimer yang diteliti memiliki tingkat fluoresensi asli yang rendah (0,5 AU). Polimer yang dibuat menggunakan TAPS 0,1M memungkinkan hingga 5 pemisahan tanpa mengisi ulang kapiler dengan gel, sedangkan polimer yang mengandung TBE diperbolehkan tidak lebih dari 3. Polimer ini memberikan resolusi yang sebanding dengan polimer Barat, tetapi juga lebih terjangkau.

Studi tentang campuran polinukleotida berlabel fluoresen dengan panjang 5-15 nukleotida. masing-masing, dengan kandungan masing-masing 10-9 M, dimungkinkan untuk menentukan komposisi polimer optimal untuk memisahkan oligonukleotida dengan panjang rantai hingga 100 nt. (Gbr. 13). Ini adalah gel berbasis pDMA yang mengandung 6% monomer, urea 7M, dan TAPS 0,1M.

Beras. 13. Pemisahan campuran polinukleotida dengan panjang Kapiler: diameter dalam - 50 m, panjang total - 45 cm, panjang efektif - 38,5 cm Polimer: monomer pDMA 6%, TAPS 0,1M, urea 7M. Elektrolit yang berfungsi: 0,1M TAPS. tegangan:

10 persegi panjang. Arus: 4,3 µA. Suhu: 25,0 oC. Waktu injeksi sampel adalah 10 detik (elektrokinetik, tegangan pengumpulan sampel 10 kV).

Optimalisasi kondisi pemisahan (tegangan, arus, panjang efektif, dan diameter kapiler) memungkinkan tercapainya pemisahan oligonukleotida ke garis dasar dengan panjang total kurang dari 100 nt. dan selisih panjang 1 n.o. (Gbr. 14.).

Beras. 14. Pemisahan campuran polinukleotida dengan selisih panjang 1 bp.

Kapiler: diameter dalam - 50 m, panjang total - 65 cm, panjang efektif - 57,5 ​​cm Polimer: monomer pDMA 6%, TAPS 0,1M, urea 7M. Elektrolit yang berfungsi: 0,1M TAPS. tegangan:

11 persegi panjang. Saat ini: 5,1 μA. Suhu: 25,0 oC. Waktu injeksi sampel adalah 10 detik (elektrokinetik, tegangan pengumpulan sampel 10 kV).

Data yang diperoleh menjadi dasar untuk pengembangan sistem diagnosis gen mutan trombosis vena yang cepat dan efektif (gen Leiden faktor V sistem pembekuan darah manusia).

Untuk membuktikan kemungkinan penentuan bersama produk tipe liar dan mutan (selisih 5 bp), dilakukan PCR berikut: 1.

DNA tipe liar (tidak ada mutasi) + primer tipe liar; 2. DNA tipe liar (tanpa mutasi) + primer FV Leiden; 3. DNA dengan mutasi heterozigot FV Leiden + primer FV Leiden; 4. Primer FV Leiden tanpa DNA. Produk reaksi, setelah perlakuan dengan formamida dan pengenceran dengan air, dianalisis dengan CGE dengan deteksi fluorimetri. Analisis sampel 1 dan 3 menunjukkan adanya produk dalam campuran setelah PCR, dan sampel 2 dan 4 menunjukkan tidak adanya produk. Untuk memastikan pola ini, kami menganalisis campuran primer mutan/produk mutan dan sampel primer tipe liar/produk tipe liar dengan perbandingan 1:1 (Gbr. 15).

Beras. 15. Penentuan gabungan produk PCR mutan dan non-mutan Kapiler: diameter dalam – 50 µm, panjang total – 45 cm, panjang efektif – 38,5 cm Polimer 6% monomer pDMA, TAPS 0,1 M, urea 7 M. Elektrolit yang berfungsi: 0,1M TAPS. Tegangan: 12 kV.

Arus: 6,5 µA. Suhu: 25,0 oC. Waktu pengumpulan sampel: 10 detik (elektrokinetik, tegangan pengumpulan sampel – 10 kV).

Data yang diperoleh menunjukkan kemungkinan penentuan bersama produk PCR spesifik alel dari mutasi FV Leiden dan tipe liar. Pendekatan yang diusulkan, yaitu pemilihan dan sintesis primer spesifik alel dengan panjang berbeda dan primer penghitung umum, diikuti dengan analisis CGE dengan deteksi fluorimetri, dapat diperluas untuk mendiagnosis penyakit lain yang ditentukan secara genetik. Perlu juga dicatat bahwa analisis oligonukleotida dapat dilakukan menggunakan peralatan standar dalam negeri yang digunakan untuk analisis asam amino dan peptida pendek.

1. Metode telah dikembangkan untuk analisis asam amino yang dikodekan secara genetik tanpa derivatisasi awal menggunakan kromatografi elektrokinetik misel dan elektroforesis zona kapiler dengan refraktometri dan deteksi UV langsung. Pengaruh komposisi dan nilai pH elektrolit latar, serta penambahan pelarut organik, terhadap efisiensi pemisahan dipelajari.

2. Dengan menggunakan metode kromatografi elektrokinetik misel dengan deteksi UV langsung, dilakukan penentuan kuantitatif campuran model 14 asam amino bebas yang dikodekan secara genetik.

3. Sebuah metode telah dikembangkan untuk penentuan kandungan aminotiol dengan berat molekul rendah dalam plasma darah pasien sehat dan sakit dengan cepat dan andal menggunakan HPLC fase terbalik dengan deteksi fluorimetri. Kemungkinan mendasar penggunaan teknik ini untuk menentukan rendahnya kadar homosistein dalam plasma darah ditunjukkan. Metode yang dikembangkan diuji pada sampel nyata plasma darah pasien.

4. Kemungkinan untuk menentukan konsentrasi homosistein yang tinggi secara patologis dalam plasma darah dengan elektroforesis zona kapiler dengan deteksi fotometrik telah dibuktikan. Metode yang dikembangkan diuji pada sampel nyata plasma darah pasien. Kemungkinan penggunaan 5-iodoacetamidofluorescein sebagai label penyerap dan fluorogenik dipelajari.

5. Sebuah metode telah dikembangkan untuk penentuan selektif fragmen gen mutan untuk trombosis vena (mutasi FV Leiden) dengan elektroforesis gel kapiler dengan deteksi fluorimetri. Kemungkinan menganalisis nukleotida dengan panjang rantai hingga 100 nukleotida telah dibuktikan. dan dengan selisih panjang 1 n.o.

Materi pokok disertasi disajikan dalam karya-karya berikut:

1. Melnikov I.O., Nazimov I.V., Stukacheva E.A., Glubokov Yu.M. Penentuan kandungan homosistein dan aminotiol dengan berat molekul rendah lainnya dalam plasma darah. // J.Anal. kimia. -2006. -T. 61. -No.11.-S. 1185-1191.

2. Melnikov I.O., Glubokov Yu.M., Nazimov I.V. Elektroforesis kapiler asam amino bebas dengan refraktometri dan deteksi UV langsung. // Inf.-anal. buletin "Catatan Ilmiah MITHT." M.:

MITHT. -2004. Jil. 11.-S. 54-57.

3. Melnikov I.O., Glubokov Yu.M., Nazimov I.V. Analisis aminotiol dengan berat molekul rendah dengan elektroforesis kapiler dan RP HPLC dengan deteksi UV fluoresen dan langsung. // J. “Teknologi teknologi tinggi modern.” M.: Akademi Ilmu Pengetahuan Alam, -2005. -Nomor 3. -Hal.40-41.

4. Melnikov I.O., Nazimov I.V., Stukacheva E.A., Glubokov Yu.M. Penentuan homosistein melalui HPLC dan HPCE sebagai kriteria vaskular faktor risiko penyakit. // FEBS J.-2006. -V. 273.-S.1. -P. 256.

5. Melnikov I.O., Nazimov I.V., Lobazov A.F., Popkovich G.V. Elektroforesis kapiler asam amino yang tidak dimodifikasi. // Abstrak. laporan Simposium Seluruh Rusia ke-8 tentang Kromatografi Cair Molekuler dan Elektroforesis Kapiler, Moskow, Oktober 2001, hal.23.

6. Melnikov I.O., Nazimov I.V., Lobazov A.F., Popkovich G.B. Elektroforesis Kapiler Asam Amino Nonmodifikasi Berkode Dengan Refraktometri Deteksi. // Simposium Internasional ke-3 tentang Pemisahan dalam BioSciences, Moskow, Mei 2003, P. 263.

7. Melnikov I.O., Stukacheva E.A., Glubokov Yu.M., Nazimov I.V. Penentuan homosistein dan aminotiol dengan berat molekul rendah lainnya dalam plasma darah dengan metode CEF dan RP HPLC. // Materi Konferensi Internasional Mahasiswa dan Mahasiswa Pascasarjana Ilmu Pengetahuan Dasar “Lomonosov-2005”.

M.: MSU, 2005. Bagian Kimia. -T. 1.-S. 31.

8. Nazimov I.V., Melnikov I.O., Glubokov Yu.M., Sivoplyasova E.A. Metode mikro instrumental untuk menentukan homosistein sebagai faktor risiko penyakit kardiovaskular. // Materi konferensi ilmiah dan praktis ke-2 “Masalah terkini bioteknologi medis”, Anapa, September 2005, -S. 15-16.

9. Melnikov I.O., Nazimov I.V., Sivoplyasova E.A., Glubokov Yu.M.Metode mikro untuk penentuan kuantitatif homosistein dalam plasma darah. // Materi Kongres ke-3 Masyarakat Bioteknologi Rusia dinamai. Yu.A. Ovchinnikova, Moskow, Oktober 2005, -S. 61.

10. Melnikov I.O., Sivoplyasova E.A., Glubokov Yu.M., Nazimov I.V. Penentuan faktor risiko penyakit kardiovaskular menggunakan metode analisis kromatografi. // Materi konferensi pertama ilmuwan muda MITHT im. M.V. Lomonosov, Moskow, Oktober 2005, -S. 31.

11. Melnikov I.O., Nazimov I.V., Stukacheva E.A., Glubokov Yu.M. Pemisahan dan identifikasi aminotiol dengan berat molekul rendah dalam darah dengan kromatografi cair kinerja tinggi fase terbalik dan elektroforesis kapiler. // Kongres Internasional Ilmu Analisis ICAS-2006, Moskow, Juni 2006, -P. 204.

12. Melnikov I.O., Nazimov I.V., Patrushev L.I., Alekseev Ya.I., Glubokov Yu.M., Mosina A.G. Penentuan mutasi gen leiden manusia dengan cara elektroforesis gel kapiler kinerja tinggi. // Simposium Internasional ke-26 tentang Pemisahan Protein, Peptida dan Polinukleotida, LMP, Innsbruck, Austria, Oktober 2006, -P. 24.

Karya serupa:

“Dmitry Sergeevich KOPCHUK FUNGSIONALISASI 5-ARYL-2,2'-BIPIRIDIIN DAN KOMPLEKS PENCAHAYAANNYA DENGAN LANTANIDA(III) 02.00.03. – Abstrak kimia organik disertasi untuk gelar ilmiah Calon Ilmu Kimia Ekaterinburg 2010 Pekerjaan dilakukan di Departemen Kimia Organik Lembaga Pendidikan Negara Pendidikan Profesi Tinggi USTU-UPI yang dinamai Presiden pertama Rusia B.N. PENGAWAS PENELITIAN Yeltsin: Doktor Ilmu Kimia Kozhevnikov Dmitry Nikolaevich PELUANG RESMI: Doktor Ilmu Kimia…”

“Venv Sergey Valerievich e Kajian teoritis pengaruh interaksi elektrostatis dan struktur primer makromolekul terhadap pengorganisasian dirinya 02.00.06 – Senyawa bermolekul tinggi ABSTRAK disertasi untuk gelar calon ilmu fisika dan matematika Moskow - 2011 The pekerjaan dilakukan di Departemen Fisika Polimer dan Kristal Fakultas Fisika Universitas Negeri Moskow dinamai M.V. Lomonosov. Pembimbing ilmiah: dokter…”

“NIKOLAEV ANDREY ALEXANDROVICH STUDI TEORITIS DAN EKSPERIMENTAL INTERAKSI KOMPLEKS PADA LOGAM 6 DAN 1 0 G R U P Y S D A L K I L F O S F I T A M I ​​​​02.00.08 – Kimia senyawa organoelemen ABSTRAK Disertasi Gelar Ilmiah Calon Ilmu Kimia Kazan - 2008 Karya yang telah dilaksanakan di departemen senyawa molekul tinggi dan organoelemen dari Institut Kimia dinamai. Negara Bagian A.M. Butlerov..."

“Vilesov Alexander Sergeevich SINTESIS RADIASI-KIMIA BENTUK POLIMER FOSFOR DI LINGKUNGAN BERBEDA 02.00.01. – Kimia anorganik ABSTRAK disertasi untuk gelar ilmiah Kandidat Ilmu Kimia Moskow 2009 Pekerjaan itu dilakukan di Institut Kimia dan Masalah Pembangunan Berkelanjutan Universitas Teknologi Kimia Rusia dinamai D.I. Mendeleeva Pembimbing Ilmiah: Anggota Koresponden dari Akademi Ilmu Pengetahuan Rusia, Doktor Ilmu Kimia, Profesor Natalia Pavlovna Tarasova Resmi..."

“Slovokhotov Yuri Leonidovich STRUKTUR ATOM DAN FITUR KIMIA KRISTAL DERIVATIF FULLEREN BARU 02.00.03 – kimia organik 02.00.04 – kimia fisika ABSTRAK disertasi untuk gelar Doktor Ilmu Kimia Moskow - 2007 Pekerjaan dilakukan di Institut Senyawa Organoelemen yang dinamai A.N. Nesmeyanov Akademi Ilmu Pengetahuan Rusia, Doktor Ilmu Kimia, Resmi..."

“Varnavskaya Olga Alekseevna KARAKTERISTIK FISIK-KIMIA KOMPLEKSASI NEODYMIUM (III) DAN EUROPIUM (III) DENGAN 2,2-DIPIRIDILINE DALAM LINGKUNGAN ORGANIK POLARITAS BERBEDA 02.00.04 - kimia fisika Abstrak disertasi untuk gelar ilmiah calon ilmu kimia Tomsk - 2010 Pekerjaan yang dilakukan di Universitas Negeri Altai, Barnaul Pembimbing Ilmiah: calon ilmu kimia, profesor madya Smagin Vladimir Petrovich Lawan resmi: dokter…”

“Krasnova Tatyana Aleksandrovna Spektrometri massa dengan desorpsi/ionisasi laser teraktivasi matriks (permukaan) dalam identifikasi dan penentuan oligomer polisulfonat, asam polikarboksilat dan antibiotik 02.00.02 - kimia analitik ABSTRAK disertasi gelar ilmiah Calon Ilmu Kimia Saratov - 2013 Pekerjaan itu dilakukan di departemen kimia Universitas Negeri Vladimir dinamai Alexander Grigorievich dan Nikolai Grigorievich..."

"Khusus ANALISIS 02.00.02 - kimia analitik ABSTRAK disertasi untuk gelar kandidat ilmu kimia Tomsk - 2012 www.sp-department.ru Pekerjaan itu dilakukan di Lembaga Pendidikan Anggaran Negara Federal Penelitian Nasional Pendidikan Profesi Tinggi. .."

“SMIRNOV Aleksey Aleksandrovich PROSES FISIK DAN KIMIA PADA PLASMA SUHU RENDAH NONEQUILIBRIUM HBr DAN CAMPURANNYA DENGAN ARGON, HELIUM DAN HIDROGEN 02.00.04 – Kimia fisika Abstrak disertasi untuk gelar ilmiah calon ilmu fisika dan matematika Ivanovo 2010 Pekerjaan yang dilakukan di Institusi Pendidikan Negeri Pendidikan Profesi Tinggi Universitas Teknologi Kimia Negeri Ivanovo . Pembimbing ilmiah: Doktor Ilmu Kimia, Profesor Efremov Alexander Mikhailovich Lawan resmi:..."

“VASYUTIN Oleg Alekseevich PENELITIAN PENGARUH KONDISI SINTESIS TERHADAP SIFAT ADSORPSI FERROSPINEL DAN SIFAT PERMUKAAN YTTRIUM FERROGARNET DENGAN METODE POTENSIOMETRI DAN Pembasahan Khusus 02.00.11 – Kimia Koloid ABSTRAK Disertasi Gelar Ilmiah Calon Ilmu Kimia St. .Petersburg 2012 Pekerjaan itu dilakukan di Departemen Kimia Koloid Fakultas Kimia St.-Negara Bagian Petersburg..."

“Melnikova Tatyana Igorevna PERKEMBANGAN KERANGKA TEORITIS DAN EKSPERIMENTAL UNTUK MENENTUKAN KOMPOSISI DAN FITUR STRUKTUR BISMUTH BORAT DAN SILLENITES Kekhususan 02.00.21 Solid State Chemistry ABSTRAK disertasi untuk gelar ilmiah Calon Ilmu Kimia Moskow 2011 Pekerjaan selesai dan di Departemen Fisika dan Kimia Benda Padat, Universitas Ilmu Pengetahuan Alam Moskow teknologi kimia dinamai M.V. Lomonosov Pembimbing Ilmiah: Dokter…”

“Starostina Irina Alekseevna INTERAKSI ASAM-BASE POLIMER DAN LOGAM DALAM SENYAWA PEREKAT 02.00.06 – Senyawa bermolekul tinggi ABSTRAK disertasi untuk gelar Doktor Ilmu Kimia Kazan - 2011 1 www.sp-department.ru Pekerjaan telah dilakukan keluar di Institusi Pendidikan Anggaran Negara Federal Nasional Kazan dari Pendidikan Profesional Tinggi universitas teknologi riset Konsultan ilmiah Doktor Ilmu Teknik, Profesor Oleg Vladislavovich Stoyanov Lawan resmi Dokter…”

“VASILIEV Vladimir Petrovich SPECTRAL - STUDI LUMINESCENCE INTERAKSI INTERMOLEKULER pada KOMPLEKS METALLOCENE Zr dan Hf dalam LARUTAN 02.00.04. - kimia fisik Abstrak disertasi untuk gelar Kandidat Ilmu Kimia Chernogolovka - 2008 Pekerjaan itu dilakukan di Institut Masalah Fisika Kimia dari Akademi Ilmu Pengetahuan Rusia dan Institut Pedagogis Universitas Federal Selatan Pembimbing Ilmiah: Kandidat Ilmu Kimia LUKOVA Galina Viktorovna Resmi..."

“SPANCHENKO Olga Valerievna TOPOGRAFI FUNGSIONAL MASALAH TRANSPORTASI RNA 02.00.10 - kimia bioorganik ABSTRAK disertasi untuk gelar Doktor Ilmu Kimia Moskow - 2010 2 Pekerjaan dilaksanakan di Jurusan Kimia Senyawa Alam Fakultas Kimia dari Negara Bagian Moskow…”

“KOSHELEV Ekaterina Valentinovna ELEKTROLIT PADAT DALAM SISTEM CaY2S4-Yb2S3 dan CaYb2S4-Y2S3 Keahlian : 02.00.05 – Elektrokimia ABSTRAK Disertasi untuk Gelar Ilmiah Calon Ilmu Kimia Ekaterinburg - 2014 2 Pekerjaan telah selesai di Jurusan Anorganik dan Fisika Kimia Lembaga Pendidikan Anggaran Negara Federal V PA Universitas Negeri Vyatka, Kirov Kalinina Lyudmila Alekseevna, Pembimbing Ilmiah: Kandidat Ilmu Kimia, Associate Professor Universitas Negeri Vyatka,...

“Ekaterina Konstantinovna Lavrentyeva Templating dalam sistem yang mengandung tanah liat sebagai metode untuk mengendalikan sifat-sifat sorben polimer-komposit dan elektrokatalis platina Keahlian: 02.00.06 – senyawa dengan berat molekul tinggi 02.00.05 – elektrokimia ABSTRAK disertasi untuk gelar ilmiah calon mahasiswa ilmu fisika dan matematika Moskow – 2009 Pekerjaan dilakukan di Departemen Fisika…”

“Evgenia Viktorovna Korchagina AGGREGASI KITOSAN DAN TURUNANNYA DALAM LARUTAN BERAIR DILUTUSI 02.00.06 – senyawa bermolekul tinggi, ilmu fisika dan matematika serta Abstrak disertasi untuk gelar ilmiah calon ilmu fisika dan matematika Moskow - 2012 Pekerjaan itu dilakukan keluar di Departemen Fisika Polimer dan Kristal Fakultas Fisika dan Universitas Negeri Moskow..."

“Vorobeva Ekaterina Georgievna KOMPLEKS KIRAL PALLADIUM BERBASIS TURUNAN YANG MENGANDUNG NITROGEN DARI MONOTERPENOID ALAMI 02.00.03 – Kimia organik ABSTRAK Disertasi untuk Gelar Ilmiah Kandidat Ilmu Kimia Perm - 2011 Pekerjaan itu dilakukan di Institusi Rusia Akademi Ilmu Pengetahuan Institut Kimia Pusat Ilmiah Komi Cabang Ural Akademi Ilmu Pengetahuan Rusia dan di Departemen Kimia FSBEI HPE Universitas Negeri Syktyvkar. Pembimbing ilmiah: Olga Zalevskaya…”

“Rykunov Alexei Aleksandrovich PORTABILITAS DESKRIPTOR ATOM DAN OBLIGASI TOPOLOGI KUANTUM DALAM BERBAGAI KEkhususan HIDROPIRIMIDIN PENGGANTI 02.00.04 - Kimia Fisika ABSTRAK Disertasi Gelar Ilmiah Calon Ilmu Kimia Moskow - 2011 Pekerjaan selesai di Departemen Kimia Kuantum, Fakultas Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Teknologi Kimia Rusia. . DI. Mendeleev Pembimbing Ilmiah: Doktor Ilmu Fisika dan Matematika, Profesor..."

“KORSHUN Vladimir Arkadievich MODIFIKASI NUKLEOSIDA PIRIDIN DAN REAKSI NON-NUKLEOSIDA PADA SINTESIS KONJUGAT OLIGONUKLEOTIDA, SIFAT DAN APLIKASINYA 02.00.10 – Kimia bioorganik ABSTRAK disertasi untuk gelar ilmiah doktor ilmu kimia Moskow - 2012 Pekerjaan dilakukan pada tahun Kelompok Rekayasa Genetika Interleukin, Laboratorium Mekanisme Ekspresi Gen, Laboratorium Kimia Asam Nukleat, Laboratorium Sintesis Organik dan Kelompok…”

Salinan

1 UNIVERSITAS NEGERI NOVOSIBIRSK Fakultas Ilmu Pengetahuan Alam Jurusan Kimia Analitik Tugas kuliah Prediksi volume retensi dan spektrum UV peptida pada HPLC fase terbalik Diselesaikan oleh: Kuchkina A.Yu., gr. 147 Pembimbing ilmiah: Ph.D. Azarova I.N. Novosibirsk-2005

2 DAFTAR ISI 1. Pendahuluan Tinjauan Pustaka 2.1. Peptida. Asam amino peptida HPLC Prediksi volume retensi dan spektrum UV peptida dalam RP HPLC Bagian percobaan Hasil dan pembahasannya 4.1. Memantau stabilitas sistem kromatografi Perhitungan volume retensi peptida Model “retensi komposisi” linier Model “retensi komposisi” nonlinier Perhitungan spektrum UV peptida Kesimpulan Lampiran Literatur

3 1. PENDAHULUAN Identifikasi protein yang berfungsi dalam sel hidup berdasarkan informasi yang diketahui tentang struktur genom, proteomik, dianggap sebagai salah satu tugas terpenting biologi molekuler modern. Masalah ini muncul setelah penguraian lengkap genom beberapa organisme dalam beberapa tahun terakhir. Ternyata genom mengkodekan lebih banyak protein daripada yang diproduksi tubuh. Identifikasi protein yang diinginkan dalam jumlah semua protein adalah tugas metodologis yang kompleks, yang, sebagai suatu peraturan, tidak dapat diselesaikan dengan metode langsung. Salah satu pendekatan untuk memecahkan masalah semacam ini, yang disebut peptidomik, adalah bahwa jumlah protein dihidrolisis dengan protease tertentu, dan jumlah peptida yang dihasilkan dipisahkan dengan elektroforesis kapiler atau kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC). Tujuan utamanya adalah untuk mendeteksi peptida (peptida) dari struktur yang diketahui, yang secara apriori merupakan fragmen protein yang dikodekan oleh genom organisme yang diteliti. Jika peptida tersebut terdeteksi dalam sampel, disimpulkan bahwa protein tersebut diproduksi oleh tubuh. Masalah metodologis yang timbul ketika menyelesaikan masalah semacam ini dapat dibagi menjadi 2 kelompok. Masalah pertama adalah memisahkan campuran, biasanya terdiri dari beberapa ribu peptida. Yang kedua adalah penentuan struktur peptida individu yang diisolasi. Masalah pemisahan diselesaikan dengan fraksinasi campuran primer, diikuti dengan pemisahan fraksi-fraksi yang terpisah menjadi komponen-komponen individual. Masalah kedua diselesaikan terutama dengan metode spektrometri massa, yang pada akhirnya memungkinkan untuk menentukan massa molekul komponen individu (peptida). Jika suatu peptida memiliki struktur yang cukup “unik” (sekumpulan asam amino) - biasanya mencakup peptida yang panjang (lebih dari residu asam amino) - maka berat molekulnya juga akan “unik”, dan kemungkinan kesalahan identifikasi menjadi dapat diabaikan. . Karena prosedur pemisahan peptida ditujukan untuk mengisolasi peptida dengan kumpulan asam amino yang diketahui, timbul pertanyaan: apakah mungkin untuk memprediksi waktu pelepasan peptida tersebut dari kolom HPLC, dengan mengetahui komposisi asam aminonya? Pendekatan ini pertama kali ditunjukkan pada awal tahun 80an. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengembangkan metode untuk memprediksi volume retensi peptida pada kromatografi Milichrom A-02 dalam mode HPLC fase terbalik (RP HPLC) menggunakan fase gerak yang sesuai untuk injeksi langsung ke dalam spektrometer massa. 3

4 2. TINJAUAN PUSTAKA 2.1. Peptida. Asam amino Peptida adalah biopolimer yang dibangun dari residu asam α-amino yang dihubungkan satu sama lain melalui ikatan peptida (-NH-CO-). Rumus umum suatu peptida dapat disajikan sebagai berikut: NH 2 CH CO NH CH CO... NH CH R 1 R 2 Rn Tidak ada batas yang jelas antara protein dan peptida; biasanya, peptida mencakup biopolimer yang mengandung tidak lebih dari 100 residu asam amino. Asam amino adalah asam organik apa pun yang molekulnya mencakup gugus amino; nama ini sering kali berarti asam α-amino, karena mereka memiliki signifikansi biologis yang penting. Molekul sebagian besar asam amino alami yang menyusun protein memiliki rumus umum H 2 NCH R Seperti dapat dilihat dari rumus strukturnya, asam amino (kecuali prolin) berbeda satu sama lain hanya pada struktur rantai samping R Asam amino merupakan senyawa amfoter karena molekulnya mengandung gugus karboksil yang bersifat asam dan gugus amino basa. Dalam lingkungan asam kuat, gugus karboksil sebagian besar tidak terdisosiasi, dan gugus amino terprotonasi. Dalam lingkungan basa kuat, gugus amino berbentuk basa bebas, dan gugus karboksil berbentuk anion karboksilat. Dalam keadaan kristal, asam amino ada dalam bentuk zwitterion, di mana proton dari gugus karboksil ditransfer ke gugus amino. Hanya 20 asam amino yang terlibat dalam biosintesis peptida dan protein alami. Asam amino dan sifat-sifatnya diberikan pada tabel 1. Tabel 1. Asam amino dan sifat-sifatnya. Nama Asam Amino Kode Struktur p a - -NH 2 -R Glisin G H 2,35 9,78 Alanin A H 3 C 2,35 9,87 Valin V H 3 C CH CH 3 2,29 9,74 4

5 Nama asam amino Kode Struktur pa - -NH 2 -R Leusin L H 3 C CH CH 3 2,33 9,74 Isoleusin I H 3 C * CH CH 3 2,32 9,76 H 2 C Prolin P HC NH 1,95 10,64 Fenilalanin F 2,20 9,31 Triptofan W N H CH NH 2 2,46 9,41 Tirosin Y HO CH NH 2 2,20 9,21 10,46 Serin S H O 2,19 9,21 Threonine T H O * CH CH 3 2,09 9,10 Sistein C HS 1,92 10,70 8,37 Asam aspartat D HOOC 1,99 9,90 3,36 Glu asam tamic E HOOC 2.10 10.47 4.07 Asparagine N H 2 N C O 2,14 8,72 Glutamin Q H 2 N C O 2,17 9,13 Lisin K H 2 N 2,16 9,06 10,54 Arginin R H 2 N C NH 1,82 8,99 12,48 NH Histidin H N NH 1, 80 9,33 6,04 Metionin M H 3 C S 2.13 9.28 5

6 Tergantung pada sifat rantai sampingnya, asam amino dibagi menjadi dua kelompok: asam amino dengan gugus R alifatik atau aromatik non-polar (hidrofobik); asam amino dengan gugus R polar (hidrofilik). Kelompok pertama mencakup 8 asam amino: alanin, valin, leusin, isoleusin, metionin, prolin, fenilalanin, triptofan. Tujuh asam amino mengandung gugus dalam rantai samping yang dapat membawa muatan negatif atau positif: asam aspartat dan glutamat bermuatan negatif pada pH 7,0; lisin, arginin, histidin adalah asam amino basa yang rantai sampingnya bermuatan positif; dalam kondisi basa, gugus samping tirosin dan sistein dari peptida HPLC dapat bermuatan negatif.Pemisahan campuran peptida adalah tugas yang sangat sulit. Saat ini, RP HPLC adalah metode terpenting untuk memisahkan peptida. Peptida adalah zat polar, yang mencegah interaksinya dengan permukaan hidrofobik fase diam dan menyebabkan interaksi dengan sisa gugus silanol. Untuk mengurangi interaksi dengan gugus silanol, ditambahkan asam atau garam kuat ke dalam eluen. Untuk mengurangi polaritas peptida, kromatografi harus dilakukan pada nilai pH rendah (di bawah 3). Jika prinsip-prinsip ini diikuti, HPLC terbukti menjadi metode yang sangat fleksibel untuk memisahkan peptida. Hal ini disebabkan oleh fakta bahwa metode ini dicirikan oleh kecepatan pemisahan yang tinggi, reproduktifitas hasil, dan kemampuan menganalisis zat dalam jumlah mikrogram. Keuntungan lain dari RP HPLC adalah kemampuannya untuk mengumpulkan fraksi dalam sejumlah kecil pelarut yang mudah menguap, yang menyederhanakan analisis spektrometri massa lebih lanjut. Biasanya, 0,1% asam trifluoroasetat dan asam format digunakan sebagai pelarut yang mudah menguap. Asam trifluoroasetat transparan di wilayah UV hingga 205 nm, yang merupakan keuntungan besar dalam kromatografi campuran kompleks. Selain itu, peptida sangat larut dalam asam trifluoroasetat. Elusi peptida dari fase terbalik biasanya dilakukan dalam mode gradien dengan penambahan pengubah organik. Pengubah organik yang paling umum adalah asetonitril. Ini transparan di wilayah UV hingga 200 nm dan memiliki selektivitas yang baik. 6

7 Faktor lain yang mendorong meluasnya penggunaan RP HPLC untuk analisis peptida adalah kemampuan untuk memprediksi perilaku kromatografinya. Prediksi volume retensi dan spektrum UV peptida dalam RP HPLC. Gagasan bahwa perilaku kromatografi peptida yang mengandung kurang dari 25 residu asam amino dapat diprediksi dengan mengetahui komposisi asam aminonya, pertama kali dikemukakan oleh J. Meek. Retensi peptida dalam fase terbalik ditentukan oleh hidrofobisitas residu asam amino yang menyusun komposisinya. Asam amino dengan rantai aromatik atau alifatik besar merupakan kontributor utama retensi. Berdasarkan hal di atas, Meek mengusulkan penghitungan volume retensi peptida pada fase terbalik sebagai jumlah kontribusi residu asam amino yang membentuk peptida. Dia mengusulkan model “retensi komposisi” linier (aditif): VR = V 0 + Z N* + Z C* + Z i (1) di mana V R volume retensi peptida, v 0 adalah volume bebas kolom; Z N* dan Z C* masing-masing merupakan kontribusi dari -NH 2 bebas dan - atau gugus terminal termodifikasi dari peptida; Z i adalah kontribusi asam amino ke-i (konstanta retensi). Meek mengkromatografi 25 peptida dalam kondisi gradien RP HPLC dan, memecahkan masalah kebalikannya, menghitung konstanta retensi asam amino. Koefisien korelasi ketergantungan VR (kalkulasi)=f(v R (exp.)) adalah 0,997 (pada ph 2.1) dan 0,999 (pada ph 7.4). Meskipun koefisien korelasinya tinggi, model ini bertentangan dengan arti fisiknya, karena konstanta retensi asam amino yang diperoleh dengan cara ini tidak mencerminkan perbedaan nyata dalam hidrofobisitasnya dan beberapa kontribusi memiliki nilai negatif. Selain itu, ada banyak fakta yang menyatakan bahwa, dengan peningkatan jumlah residu asam amino dalam peptida, permukaan kontak hidrofobiknya dengan fase sebaliknya, yang menentukan retensi, meningkat secara nonlinier. Penulis penelitian ini juga membuat asumsi bahwa volume retensi peptida dihitung dari jumlah kontribusi residu asam amino. Untuk menghitung volume retensi peptida, mereka mengusulkan model berikut: VR = A* ln (1+ Z j * n j) + B (2) 7

8 dimana Z j adalah parameter retensi empiris, yang dihitung berdasarkan hidrofobisitas asam amino; konstanta A dan B; n j adalah jumlah residu asam amino j dalam peptida. Model ini memberikan korelasi yang baik antara volume retensi peptida yang dihitung dan eksperimental. Kerugian dari model ini adalah model ini hanya valid untuk sistem kromatografi tertentu (gradien linier dengan kemiringan tertentu, laju aliran tetap, fase gerak dan fase diam). Oleh karena itu, penerapan model ini sangat terbatas. Oleh karena itu, penulis penelitian yang sedang ditinjau mengusulkan model lain berdasarkan teori elusi gradien, yang memungkinkan seseorang menghitung volume retensi peptida untuk sistem kromatografi yang lebih luas. Mengingat bahwa area kontak hidrofobik yang tersedia antara peptida dengan fase diam bervariasi sebanding dengan berat molekulnya hingga pangkat 2/3, penulis memilih fungsi untuk menghitung volume retensi peptida: VR = f (3 ) di mana a, b, c adalah konstanta yang bergantung pada sifat sistem kromatografi tertentu yang ditentukan secara eksperimental dari data kromatografi 15 peptida yang dipilih untuk tujuan ini. Koefisien korelasi ketergantungan VR (kalkulasi)=f(v R (exp.)) adalah 0,98. Kelemahan signifikan yang membatasi penggunaan metode ini adalah kebutuhan untuk menghitung konstanta a, b dan c untuk sistem kromatografi tertentu dari percobaan awal dengan model peptida, yang merupakan prosedur yang sangat memakan waktu. Penelitian ini menghitung volume retensi dan spektrum UV peptida dengan urutan asam amino yang diketahui, setelah sebelumnya menentukan kontribusi asam amino terhadap parameter di atas. Nilai kontribusi ini ditemukan secara eksperimental dari kromatogram larutan asam amino individu yang diperoleh dengan deteksi fotometrik multi-panjang gelombang di bawah kondisi yang sama di mana peptida dikromatografi. Penulis karya tersebut mengusulkan persamaan berikut untuk menghitung volume retensi peptida: VR = 209 [(Z i) + Z C*+N* + V 0 ] 1/3 990 (4) di mana Z i adalah koefisien retensi asam amino “i”; V 0 volume bebas kolom; Z C*+N* adalah konstanta retensi total gugus terminal peptida. Saat menghitung spektrum UV peptida, spektrum peptida dianggap sebagai jumlah spektrum semua elemen strukturalnya. Untuk menguji metode yang diusulkan ada 8

9, 30 peptida dikromatografi, dan koefisien korelasi antara volume retensi yang dihitung dan ditemukan secara eksperimental adalah 0,95. Metode yang diusulkan untuk menghitung spektrum UV peptida juga memiliki kekuatan prediksi yang memuaskan. Dalam karya ini, asetonitril dan larutan litium perklorat (0,2 M LiCLO M HClO 4), yang merupakan zat non-volatil, digunakan sebagai eluen, yang membuat identifikasi peptida spektrometri massa selanjutnya menjadi sangat sulit. Oleh karena itu, tampaknya tepat bagi kami untuk mengembangkan metode menggunakan fase gerak dari komposisi asetonitril - asam trifluoroasetat, yang semua komponennya merupakan zat yang mudah menguap dan tidak mengganggu analisis spektrometri massa. 9

10 3. EKSPERIMENTAL HPLC dilakukan pada kromatografi Milichrome A-02 pada kolom 2x75 mm dengan fasa ProntoSIL C 18 AQ (Bischoff Analysentechnik und Geräte GmbH, Jerman) dengan kondisi sebagai berikut: eluen A: asam trifluoroasetat 0,01 M; eluen B: asetonitril; gradien linier: 40 menit dari 5 hingga 100% B; laju aliran: 100 μl/menit; suhu kolom: 40 C; deteksi: pada 210, 220, 230, 240, 250, 260, 280 dan 300 nm, τ = 0,18 detik; volume sampel: 4 μl. Solusi untuk pengujian sistem kromatografi: KBr - 0,2 mg/ml; uridin - 0,2 mg/ml; kafein-1 mg/ml; m-nitroanilin - 0,1 mg/ml; o-nitroanilin-0,1 mg/ml; pelarut 2% asetonitril dalam air. Semua reagen dengan fraksi massa bahan utama minimal 98%. Asam amino (Serva, Jerman), asetonitril “Grade 0” (NPF “Kriochrome”, St. Petersburg), dan asam trifluoroasetat anhidrat (ICN Biomedicals, USA) digunakan dalam penelitian ini. Sampel peptida disediakan oleh V.V. Samukov (NPO “Vektor”, Novosibirsk) dan I.V. Nazimov (IBCh RAS, Moskow). Konsentrasi asam amino dalam larutan yang dikromatografi adalah 0,2 1 mg/ml, peptida 0,1 2 mg/ml. Kromatogram diproses menggunakan program Multichrome (Ampersend JSC, Moskow). Untuk menghitung VR, area puncak kromatografi ketika terdeteksi pada 8 panjang gelombang (S λ) dan representasi grafis kromatogram peptida, program “CHROM P” (Institut Kromatografi JSC “EkoNova”, Novosibirsk) digunakan. Linearisasi kurva yang ditunjukkan pada Gambar 1 dilakukan dengan menggunakan program Microsoft Excel (Microsoft Corporation). 10

11 4. HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1. Pemantauan stabilitas sistem kromatografi Stabilitas sistem kromatografi dipantau menggunakan prosedur yang diatur oleh metodologi. Larutan uji dikromatografi dan 14 parameter dihitung dari kromatogram yang dihasilkan, yang masing-masing mengontrol indikator tertentu dari sistem kromatografi: volume kolom bebas ion VR bromida; rasio spektral S 280 /S 250 uridin, akurasi penyetelan detektor dalam kisaran 250 hingga 280 nm; rasio spektral S 260 /S 280 kafein rentang linier detektor; rasio spektral S 260 /S 230 m - kesesuaian nitroanilin untuk eluen A. Puncak o-nitroanilin digunakan untuk mengontrol: penyimpangan V R gradien dari bentuk tertentu, rasio spektral, akurasi penyetelan detektor dalam kisaran 210 hingga 300 nm, asimetri puncak Pelanggaran 10% dalam pengepakan kolom, akurasi dosis sampel S 210. Pengukuran berkala parameter kromatografi dan spektral larutan model memungkinkan kami memverifikasi reproduktifitas pengoperasian sistem kromatografi yang digunakan. Hasil pengujian ditunjukkan pada Tabel 2. Tabel 2. Hasil pengujian sistem kromatografi, n = 8. Zat Parameter 11 Nilai rata-rata parameter S r (%) Bromida VR R, µl 148 1.0 Uridine S 280 /S 250 0.53 1.3 Kafein S 260 /S 280 0,73 0,6 m-nitroanilin S 260 /S 230 0,80 1,0 o-nitroanilin VR R, µl,6 S 220 /S 210 1,71 0,5 S 230 /S 210 1,76 0,7 S 240 /S 210 1,11 0,6 S 260 /Dtk 210 0,58 0,9 S 250 /S 210 0,40 1,4 S 280 /S 210 0,59 0,9 S 300 /S 210 0,32 1,2 A 10% 1,05 1,1 Sinyal keluaran (area puncak) S 210, e.p.p. μl 25,00 1,4

12 Nilai S r yang diperoleh memungkinkan kita untuk menarik kesimpulan tentang stabilitas sistem kromatografi yang dijelaskan. Perhitungan volume retensi peptida Data kromatografi awal yang diperlukan untuk menghitung koefisien retensi asam amino diperoleh dari kromatogram asam amino ini dan peptida GG dan GGG pada kondisi yang ditentukan pada bagian 3. Koefisien retensi asam amino dihitung menggunakan persamaan: Z i = V Ri V 0 Z C*+N* (5) dengan V Ri adalah volume retensi asam amino “i”; V 0 volume bebas kolom (volume retensi Br -, dalam sistem kromatografi ini adalah 148 μl); Z C+N adalah konstanta retensi total gugus terminal peptida. Z C+N dihitung menggunakan persamaan: Z C*+N* = V R (G) V 0 ((6) dengan V R (G) adalah volume retensi glisin, μL; VR (GGG) dan v R (GG) adalah volume retensi peptida GGG dan GG , µl Jumlah koefisien retensi gugus akhir [(-NH 2) + (-CONH 2)] dianggap sama dengan jumlah koefisien retensi gugus [(- NH 2) + (-)].Data kromatografi dan perhitungan konstanta retensi elemen struktur peptida diberikan pada tabel 3. Tabel 3. Volume retensi asam amino dan peptida GG dan GGG Konstanta retensi elemen struktur peptida Kode VR , μl Z i, μl Kode V R, μl Z i, μl N P S V G M Q Y D I H L T F E W K GG C GGG A (C*+N*) akhir - 25 R

13 Model linier “retensi komposisi” Untuk memprediksi volume retensi peptida dalam kerangka model linier yang diusulkan dalam penelitian ini, kami menghitung volume retensi 28 peptida (Tabel 4) dan membandingkan data yang diperoleh dengan data yang ditemukan secara eksperimental (Gambar 1). Tabel 4. Volume retensi peptida yang ditemukan dan dihitung secara eksperimental (model linier). Peptida V R (exp.), µl VR R (kals.), µl 1 GG GGG SEBAGAI GRGDS TKPR WAGGDASGE GL MY KPVGKKRRPVKVYP W-D-YGGDASGE W-D-AGGDA NCMLDY SYSMEHFRWG W-D-VGGDASGE YGGFLRKYPK RPPGFSPFR MEHFRWG RVYIHPF YGGFLRRIRP KLK YGGFM DRVYIHPF QATVGDINTERPGMLDFTGK ELYENKRPRRPYIL DRVYIHPFHL YD-AGFL RPKPQQFFGLM -NH PQQFFGLM-NH GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ-NH

14 V VR R(kalkulasi), µl VR(exp.), R µl Gambar. 1. Perbandingan volume retensi peptida yang ditemukan secara eksperimental dan dihitung. Perhitungan nilai VR dilakukan sesuai persamaan (1). Terlihat dari data yang diperoleh, model linier memberikan hasil yang memuaskan hanya untuk peptida yang relatif hidrofilik; untuk peptida hidrofobik, nilai yang dihitung jauh lebih tinggi daripada nilai eksperimental. Hasil serupa diperoleh dalam karya model “retensi komposisi” nonlinier Linearisasi kurva yang ditunjukkan pada Gambar. 1 memberikan persamaan: VR = 173 [(n Z i) + V 0 ] 1/3 785 (7) Perbandingan nilai yang dihitung dan volume retensi yang ditemukan secara eksperimental untuk 28 peptida ditunjukkan pada Tabel 5 dan Gambar.

15 VR R (kalkulasi), µl VR VR (exp.), µl VR R Gambar. 2. Perbandingan volume retensi peptida yang ditemukan secara eksperimental dan dihitung. Perhitungan nilai VR dilakukan sesuai persamaan (7). 15

16 Tabel 5. Volume retensi peptida yang ditemukan dan dihitung secara eksperimental (model nonlinier). Peptida V R (exp.), µl VR R (kals.), µl 1 GG GGG SEBAGAI GRGDS TKPR WAGGDASGE GL MY KPVGKKRRPVKVYP W-D-YGGDASGE W-D-AGGDA NCMLDY SYSMEHFRWG W-D-VGGDASGE YGGFLRKYPK RPPGFSPFR MEHFRWG RVYIHPF YGGFLRRIRP KLK YGGFM DRVYIHPF QATVGDINTERPGMLDFTGK ELYENKRPRRPYIL DRVYIHPFHL YD-AGFL RPKPQQFFGLM -NH PQQFFGLM-NH GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ-NH Koefisien korelasi ketergantungan VR (kalkulasi)=f(v R (exp.)) adalah 0,96. Lampiran menunjukkan kromatogram eksperimental dan terhitung dari campuran model 11 peptida. 16

17 4.3. Perhitungan spektrum UV peptida Koefisien spektral spesifik elemen struktural peptida diambil dari pekerjaan, karena Dalam sistem kromatografi yang kami gunakan, penghitungan rasio spektral yang benar terhambat oleh puncak sistemik, serta buruknya retensi asam amino hidrofilik dan peptida pendek. Nilai koefisien spektral spesifik diberikan pada Tabel 6. Tabel 6. Koefisien spektral elemen struktur peptida penyerap UV sebagai luas puncak kromatografi pada C = 1 mm dan volume sampel 4 μl, ( eop μl). λ, nm W F Y H C M R Q N E D N*+C* PS di mana S C*+N* koefisien spektral dari jumlah gugus (-NH+ -) peptida, S PS serapan ikatan peptida. Karakteristik spektral peptida sebagai luas puncak kromatografinya pada C = 1 mM dan volume sampel 4 μl dihitung menggunakan persamaan: a λ peptida = a λ N*+C* + (m-1) a λ λ PS + a i (9) di mana m adalah jumlah total residu asam amino dalam peptida, a λ N*+C* adalah area puncak bersyarat dari gugus terminal peptida, dan λ PS adalah spesifik penyerapan ikatan peptida pada panjang gelombang λ λ, dan i adalah karakteristik spektral residu asam amino untuk panjang gelombang λ. Besaran yang termasuk dalam persamaan (9) diperoleh sebagai berikut. Karakteristik spektral spesifik elemen struktural peptida pada panjang gelombang =210 nm (a 210 i) dihitung sebagai luas puncak kromatografinya untuk larutan dengan konsentrasi 1 mM dan volume sampel 4 μl menurut persamaan: a 210 i = a 210 AA a 210 N*+C *, (10) dimana 210 AA adalah luas puncak asam amino; a 210 N*+C* adalah area puncak konvensional dari gugus terminal peptida. Nilai 210 N*+C* diambil sama dengan 210 Leu, karena gugus NH 2 adalah satu-satunya kromofor Leu dalam rentang panjang gelombang nm. 17

18 Serapan spesifik ikatan peptida (a 210 PS) dihitung sebagai perbedaan antara serapan spesifik peptida GGG dan GG: a 210 PS = a GGG a GG (11) Karakteristik spektral untuk panjang gelombang λ dihitung menggunakan persamaan : a λ i = a 210 i (S λ /S 210), (12) dimana S λ /S 210 adalah rasio spektral asam amino dan peptida GG dan GGG, yang merupakan rasio area puncak pada panjang gelombang λ terhadap luas puncak pada λ = 210 nm. Tabel 7 menunjukkan perbandingan rasio spektral yang dihitung S λ /S 210 untuk 28 peptida dengan yang diperoleh secara eksperimental. Rasio spektral peptida yang diperoleh secara eksperimental dan dihitung cukup sesuai satu sama lain. Dalam kebanyakan kasus, perbedaannya tidak lebih dari 0,06. Untuk beberapa peptida (5, 9, 12, 16, 18, 22, 23, 26, 27), perbedaan yang lebih mencolok dalam rasio spektral prediksi dan eksperimental diamati. Alasan perbedaan ini memerlukan penelitian tambahan. Tabel 7. Perbandingan nilai rasio spektral peptida eksperimental dan perhitungan. Nilai Peptida Rasio spektral S λ /S 210 untuk panjang gelombang λ(nm): Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp

19 Nilai Peptida Rasio spektral S λ /S 210 untuk panjang gelombang λ(nm): Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Calc Exp Calc Exp

20 Nilai Peptida Rasio spektral S λ /S 210 untuk panjang gelombang λ(nm): Vt Exp V V Exp Dari data yang diperoleh jelas bahwa metode yang dijelaskan untuk menghitung volume retensi peptida dengan komposisi yang diketahui dan spektrum UVnya dalam kondisi gradien RP HPLC memiliki daya prediksi yang memuaskan dan mungkin berguna dalam penelitian yang melibatkan pemisahan campuran peptida. 20

21 5. KESIMPULAN 1. Sebuah metode telah dikembangkan yang memungkinkan seseorang untuk memprediksi volume retensi peptida dengan komposisi yang diketahui dalam mode gradien RP HPLC pada kromatografi Milichrome A-02 menggunakan fase gerak yang mudah menguap yang cocok untuk memasukkan langsung fraksi terisolasi ke dalam spektrometer massa. 2. Suatu metode telah dikembangkan untuk menghitung serapan optik peptida pada panjang gelombang 210, 220, 230, 240, 250, 260, 280 dan 300 nm langsung dalam fase gerak yang digunakan untuk memisahkan peptida. 3. Metode yang dikembangkan diuji untuk 28 model peptida. Koefisien korelasi volume retensi yang dihitung dengan nilai eksperimen yang sesuai adalah 0,96. Perbedaan antara rasio spektral yang dihitung dan diperoleh secara eksperimental S λ / S 210 tidak lebih dari 0, REFERENSI 1. Reznikov V.A., Shteingarts V.D. Asam amino. Novosibirsk: NSU, S. Dawson R., Elliott D., Elliott W., Jones K. Buku Pegangan seorang ahli biokimia. Moskow: Mir, hal. 3. Ovchinnikov Yu.A. Kimia bioorganik. Moskow: Pencerahan, hal. 4. Kromatografi cair kinerja tinggi dalam biokimia (diedit oleh Henschen A.). Moskow: Mir, hal. 5. Lemah lembut J.L. // Proses. Natal. Akademik. Sains. AMERIKA SERIKAT. 1980, V.77.No.3. P Sakamoto Y., Kawakami N., Sasagawa T. // J. Chromatogr V P Sasagawa T., Okuyama T., Teller D.C. // J. Chromatogr V P Browne C.A., Bennet H.P.J., Solomon S. // Anal. Biokimia V.124. P Meek J.L., Rossetti Z.L. // J. Chromatogr V P Azarova I.N., Baram G.I., Goldberg E.L. // Kimia bioorganik. Dalam tekanan. 11. Konsentrasi massa zat penyerap UV. Metodologi untuk melakukan pengukuran menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi. FR Irkutsk

22 7. Lampiran Kromatogram eksperimental (A) dan terhitung (B) dari campuran 11 peptida. Nomor peptida sesuai Tabel A 0,5 e.o.p nm B nm Volume, µl

KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN ILMU PENGETAHUAN BADAN FEDERAL FEDERAL RUSIA UNTUK PENDIDIKAN UNIVERSITAS NEGERI NOVOSIBIRSK Fakultas Ilmu Pengetahuan Alam Jurusan: Tesis Kimia Analitik

Kuliah 1: Struktur primer protein - asam amino 1 Keanekaragaman protein Banyak fungsi biologis tubuh yang dilakukan oleh protein. Fungsi tersebut meliputi pengangkutan dan penyimpanan oksigen (hemoglobin

273 UDC 543.544 PEMISAHAN ENANTIOMER TURUNAN ASAM AMINO PADA AMINED β-siklodekstrin DENGAN METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI I. A. Ananyeva, E. N. Shapovalova, S. A. Lopatin, O.

1. Ikatan kovalen pada protein dan enzim. Berikan contoh. TIKET 1 2. Apa dasar pemisahan protein dengan fraksinasi dengan adanya perbedaan konsentrasi garam. Kotoran apa yang dihilangkan dengan metode ini?

Topik 23. Amina. Asam amino dan peptida Isi topik: Amina, klasifikasi dan tata nama. Metode pembuatan dan sifat kimia amina. Anilin, struktur elektroniknya. Ketergantungan sifat dasar

T.P. Vavilova A.E. Medvedev Kimia biologi Biokimia rongga mulut Buku Teks Kementerian Pendidikan dan Ilmu Pengetahuan Federasi Rusia Direkomendasikan oleh Lembaga Pendidikan Anggaran Negara Pendidikan Profesional Tinggi "Universitas Kedokteran Negeri Moskow Pertama dinamai

Institut Fisika dan Teknologi Moskow (Universitas Negeri) Departemen Fisika Molekuler dan Biologi Metode penelitian fisik Kuliah 9 Kromatografi cair Metode dan teknologi

KEMENTERIAN KESEHATAN FEDERASI RUSIA PASAL FARMAKOPOEIAL Indapamide FS.2.1.0017.15 Indapamide Indapamidum Menggantikan FS 42-0303-08 N-[(2RS)-2-Methyl-2,3-dihydro-1H-indol-1-yl]- 3-sulfamoil -4-klorobenzamid

ASAM AMINO. PEPTIDA. PROTEIN Asam amino adalah asam karboksilat yang satu atau lebih atom hidrogennya digantikan oleh gugus amino pada radikal hidrokarbon. Tergantung pada posisi relatifnya

BIOKIMIA Diedit oleh Anggota Koresponden dari Akademi Ilmu Pengetahuan Rusia, Profesor E.S. SEVERINA Edisi ke-5, direvisi dan diperluas Buku Teks Direkomendasikan oleh Asosiasi Pendidikan dan Metodologi untuk Medis dan Farmasi

1 Asam amino dan protein Struktur, sifat Spiral ditemukan di banyak bidang: dalam arsitektur, dalam makromolekul protein, asam nukleat dan bahkan dalam polisakarida (Loretto hapel, Santa Fe, NM/ Sarbo)

KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN ILMU PENGETAHUAN Institusi Pendidikan Tinggi Otonomi Negara Federal RUSIA "UNVERSITAS NEGARA PENELITIAN NASIONAL NOVOSIBIRSK" Fakultas Ilmu Pengetahuan Alam

APP CATATAN-16/2016LC Kemampuan analisis kromatografi cair MaestroHPLC dengan detektor hamburan cahaya evaporatif suhu rendah MAESTRO ELSD menggunakan contoh penentuan asam amino dalam hidrolisat

8. Pertanyaan 1. Pengertian kromatografi. 2. Ciri-ciri kromatografi apa yang memungkinkan pemisahan zat yang memiliki sifat serupa lebih baik dibandingkan dengan metode pemisahan lainnya. 3. Daftar

KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN ILMU PENGETAHUAN LEMBAGA PENDIDIKAN ANGGARAN NEGARA FEDERAL RF LEMBAGA PENDIDIKAN PROFESIONAL TINGGI “UNVERSITAS TEKNIK NEGARA NIZHNY NOVGOROD dinamai R.E.

1 Ciri-ciri struktur, reaktivitas dan metode sintesis asam amino. Protein Senyawa yang mengandung gugus fungsi asam dan gugus amino adalah asam amino. Asam basa

Manfaat dari Kolom Kromatografi Pengecualian Ukuran Agilent AdvanceBio SEC untuk Analisis Biofarmasi Bandingkan Kolom dari Berbagai Produsen untuk Peningkatan Kualitas Data Tinjauan Teknis

“Laboratorium pabrik. Diagnostik bahan" 4. 2007. Volume 73 23 UDC 543.544 PENENTUAN ASAM AMINO DALAM OBAT DENGAN HPLC FASE TERBALIK DENGAN DETEKSI AMPEROMETRIK M.G.

UDC 615.22.074: 543.544.5.068.7.062 VALIDASI METODE PENENTUAN KUANTITATIF TRIMETAZIDINE DIHYDROCHLORIDE DALAM TABLET 0,02 g E. V. Kompantseva, G. A. Martirosova, M. G. Tsybulina Pyatigorsk State

KROMATOGRAFI FLASH PERSIAPAN MODERN Bagian 2* A. Abolin, Ph.D., "GalaKhim" [dilindungi email] P.-F. Icarus, Interchim (Prancis) Kami terus menerbitkan materi tentang metode persiapan modern

Lampiran Sertifikat 44071 Lembar 1 Persetujuan Jenis Alat Ukur DESKRIPSI JENIS ALAT PENGUKURAN Kromatografi cair kinerja tinggi “Milichrome A-02”, “Alphachrom A-02” (“Alphachrom A-02”)

STANDAR NEGARA LEMBAGA PENELITIAN SIBERIAN TIMUR RUSIA PENGUKURAN FISIK-TEKNIS DAN RADIO-TEKNIS Sertifikasi SERTIFIKAT MVI 02-2002 Metodologi untuk melakukan pengukuran konsentrasi massa

BAGIAN 1 PENENTUAN JARAK EVOLUSI DAN LAJU EVOLUSI URUTAN ASAM AMINO 1.1. DASAR TEORITIS Jarak evolusi antara urutan asam amino (p, d) rata-rata

01/2016:20255 2.2.55. PEMETAAN PEPTIDA Pemetaan peptida merupakan suatu metode untuk mengidentifikasi protein, terutama yang dihasilkan oleh DNA rekombinan. Metodenya meliputi kimia atau enzimatis

Kementerian Pendidikan dan Ilmu Pengetahuan Federasi Rusia LEMBAGA PENDIDIKAN ANGGARAN NEGARA FEDERAL LEMBAGA PENDIDIKAN TINGGI “UNVERSITAS NEGARA PENELITIAN NASIONAL SARATOV”

Konformasi protein: prinsip pembentukan 1. Ikatan yang menentukan konformasi molekul protein Ikatan kovalen: peptida disulfida interaksi non-kovalen: interaksi ionik ikatan hidrogen

BADAN FEDERAL UNTUK PENDIDIKAN Institusi pendidikan negeri pendidikan profesi tinggi “Universitas Negeri Ural dinamai. SAYA. Gorky" IONC "Ekologi dan Pengelolaan Alam"

KEMENTERIAN KESEHATAN PASAL FARMAKOPOEIAL FEDERASI RUSIA Ketorolac trometamol FS.2.1.0022.15 Ketorolac trometamol Ketorolacum trometamolum Menggantikan GF XII, bagian 1, FS 42-0242-07 (1RS)-5-Benzoyl-2,3-dihydrogen o-1H- pirolisin-1 -karboksilat

Institut Fisika dan Teknologi Moskow (Universitas Negeri) Departemen Fisika Molekuler dan Biologi Metode penelitian fisik Kuliah 8 Detektor dalam kromatografi Kromatografi cair

KEMENTERIAN KESEHATAN PASAL FARMAKOPOE FEDERASI RUSIA Meloxicam FS.2.1.0025.15 Meloxicam Meloxicamum Pengganti GF XII, part 1, FS 42-0254-07 4-Hydroxy-2-methyl--(5-methyl-1,3-thiazol -2- yl)-1,1-dioxo-1λ

AKADEMI ILMU NASIONAL BELARUS RUE "PUSAT PENELITIAN DAN PRAKTIS AKADEMI ILMU NASIONAL BELARUS PANGAN" TEKNOLOGI INOVATIF DALAM INDUSTRI MAKANAN Materi Ilmiah dan Praktik Internasional XI

KARAKTERISTIK UMUM PEKERJAAN Relevansi pekerjaan Saat ini metode kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) banyak digunakan untuk mengidentifikasi dan menentukan kandungan zat organik kompleks

Validasi metode analisis: aplikasi praktis. Pisarev V.V., Ph.D., MBA, Wakil Direktur Jenderal Perusahaan Kesatuan Negara Federal "Pusat Ilmiah Negara untuk Antibiotik", Moskow (www.pisarev.ru) Pendahuluan

2.2.29. KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI Kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) adalah metode pemisahan berdasarkan distribusi diferensial zat antara dua zat yang tidak dapat bercampur.

KEMENTERIAN PENDIDIKAN DAN PENGETAHUAN PENELITIAN NASIONAL RUSIA UNIVERSITAS NEGERI TOMSK FAKULTAS KIMIA Program kerja disiplin disiplin Metode analisis kromatografi Arah pelatihan yang dianotasi

Menggunakan Produk Agilent Bond Elut Plexa untuk Mengurangi Penekanan Ion dan Meningkatkan Pedoman Sensitivitas Kromatografi Cair-Spektrometri Massa (LC-MS) Farmasi

KEMENTERIAN KESEHATAN PASAL FARMAKOPOE FEDERASI RUSIA Carbamazepine FS.2.1.0020.15 Carbamazepine Menggantikan FS 42-2803-96; Carbamazepinum sebagai pengganti GF XII, bagian 1, FS 42-0240-07 5H-Dibenzazepine-5-carboxamide

Kuliah 22 Asam amino. Tupai Bekerja adalah cara terbaik untuk menikmati hidup. I. Kant Tata nama asam amino. Asam amino alami. Kiralitas asam amino yang membentuk protein. Sifat asam basa,

APP CATATAN-10/2016LC Kemampuan analisis kromatografi cair MaestroHPLC dengan detektor susunan dioda dan detektor fotometrik dengan panjang gelombang tetap (LED) menggunakan contoh determinasi

Kuliah Kimia 3 Asam α-amino, peptida, protein. Kuliah disampaikan oleh Prof. Belavin Ivan Yuryevich 2. Asam α-amino, peptida, protein Asam α-amino protein bioregulator sumber energi Asam α-amino heterofungsional

Praktikum 11. MEKANISME PROSES DASAR GENETIK MOLEKULER Tujuan pembelajaran : mengenal susunan DNA dan RNA, proses replikasi, transkripsi dan translasi dengan menggunakan contoh penyelesaian tipikal

APP CATATAN-34/2018LC Kemampuan analisis kromatografi cair Maestro HPLC dengan detektor susunan dioda menggunakan contoh penentuan kandungan senyawa fenolik dan furan dalam cognac menurut

Uji obat kombinasi dosis tetap untuk mengetahui adanya kotoran menggunakan solusi Agilent 129 Infinity II HDR-DAD Impurity Analyzer

APP CATATAN-18/2017LC Kemampuan analisis kromatografi cair MaestroHPLC dengan detektor amperometri menggunakan contoh penentuan katekolamin dalam plasma darah Yashin A. Ya. Sc., Insinyur Terkemuka

GOST R 51435-99 Jus apel, jus apel pekat dan minuman yang mengandung jus apel. Metode penentuan kadar patulin menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi. Oke 67.160.20

TINJAUAN PELAWAN RESMI tentang disertasi Mikhail Vadimovich Shashkov “Studi fase cair stasioner yang sangat polar berdasarkan cairan ionik untuk kromatografi gas kapiler” untuk kompetisi

PEPTIDA, alami atau sintetis. senyawa yang molekulnya tersusun dari residu asam a-amino yang dihubungkan satu sama lain melalui ikatan peptida (amida) C(O) NH. Molekul tersebut juga dapat mengandung komponen non-asam amino (misalnya, residu karbohidrat). Berdasarkan jumlah residu asam amino yang termasuk dalam molekul peptida, di-peptida, tripeptida, tetrapeptida, dll dibedakan. Peptida yang mengandung hingga 10 residu asam amino disebut. oligopeptida yang mengandung lebih dari 10 residu asam amino polipeptida Pri polipeptida dengan mol. m.lebih dari 6 ribu nama. protein

Referensi sejarah. Untuk pertama kalinya, peptida diisolasi dari hidrolisat protein enzimatik. Istilah "peptida" dikemukakan oleh E. Fischer. Peptida sintetik pertama diperoleh oleh T. Curtius pada tahun 1881. E. Fischer pada tahun 1905 mengembangkan metode umum pertama untuk sintesis peptida dan mensintesis sejumlah oligopeptida. bangunan. Makhluk Siswa E. Fischer E. Abdergalden, G. Leike dan M. Bergman berkontribusi pada pengembangan kimia peptida. Pada tahun 1932, M. Bergman dan L. Zerwas menggunakan gugus benziloksikarbonil (gugus karbobenzoksi) dalam sintesis peptida untuk melindungi gugus a-amino asam amino, yang menandai tahap baru dalam pengembangan sintesis peptida. Asam amino terlindung N yang dihasilkan (asam N-karbobenzoksiamino) banyak digunakan untuk memperoleh berbagai peptida, yang berhasil digunakan untuk mempelajari sejumlah masalah utama dalam kimia dan biokimia B-B ini, misalnya, untuk mempelajari spesifisitas substrat dari proteolitik. enzim. Peptida alami (glutathione, carnosine, dll.) pertama kali disintesis menggunakan asam N-carbobenzoxyamino. Sebuah pencapaian penting di bidang ini berkembang pada awalnya. 50an P. Vaughan dkk sintesis peptida menggunakan metode anhidrida campuran (metode sintesis peptida dibahas secara rinci di bawah). Pada tahun 1953, V. Du Vigneault mensintesis hormon peptida pertama, oksitosin. Berdasarkan konsep sintesis peptida fase padat yang dikembangkan oleh P. Merrifield pada tahun 1963, diciptakanlah sintesis peptida otomatis. penyintesis peptida. Metode sintesis peptida enzimatik terkontrol telah dikembangkan secara intensif. Penggunaan metode baru memungkinkan untuk mensintesis hormon insulin, dll.

Keberhasilan sintetis kimia peptida disiapkan melalui kemajuan dalam pengembangan metode pemisahan, pemurnian dan analisis peptida, seperti kromatografi penukar ion, elektroforesis dekomposisi. media, filtrasi gel, kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC), imunokimia. analisis, dll. Metode untuk menganalisis kelompok akhir dan metode pembelahan peptida bertahap juga telah mengalami perkembangan pesat. Secara khusus, sistem otomatis diciptakan. penganalisis asam amino dan otomatis perangkat untuk menentukan struktur utama peptida - yang disebut. sequencer.

Tata nama peptida. Residu asam amino peptida membawa bebas. gugus a-amino, disebut N-terminal, dan operatornya gratis. gugus a-karboksil - terminal-C. Gambar nama peptidaberasal dari namanya. residu asam amino yang termasuk dalam komposisinya, dicantumkan secara berurutan, dimulai dari terminal-N. Dalam hal ini, nama-nama sepele digunakan. asam amino, yang akhirannya “in” diganti dengan “sil”; pengecualian residu terminal-C, disebut yang sesuai dengan namanya. asam amino yang sesuai. Semua residu asam amino yang termasuk dalam peptida diberi nomor mulai dari ujung-N. Untuk mencatat struktur utama peptida (urutan asam amino), sebutan tiga huruf dan satu huruf untuk residu asam amino banyak digunakan (misalnya, Ala Ser -Asp Phe -GIy alanyl-seryl-asparagyl-phenylalanyl-glisin).

Struktur. Ikatan peptida mempunyai sifat ikatan rangkap sebagian. Hal ini diwujudkan dengan berkurangnya panjang ikatan ini (0,132 nm) dibandingkan dengan panjang ikatan C N sederhana (0,147 nm). Sifat ikatan peptida yang sebagian terhubung ganda membuatnya tidak mungkin terjadi secara bebas rotasi substituen di sekitarnya. oleh karena itu, gugus peptida berbentuk planar dan biasanya memiliki konfigurasi trans (f-la I). Jadi, tulang punggung rantai peptida adalah serangkaian bidang kaku dengan sambungan (“engsel”) yang dapat digerakkan di tempat bagian asimetris berada. atom C (pada fase I ditandai dengan tanda bintang).

Dalam larutan peptida, pembentukan konformer tertentu yang dominan diamati. Ketika rantai memanjang, elemen-elemen terurut dari struktur sekunder (struktur-a-heliks dan b) memperoleh stabilitas yang lebih nyata (mirip dengan protein). Pembentukan struktur sekunder merupakan ciri khas peptida biasa, khususnya asam poliamino.

Properti. Oligopeptida memiliki sifat yang mirip dengan asam amino; polipeptida mirip dengan protein. Oligopeptida biasanya berbentuk kristal. zat yang terurai bila dipanaskan. hingga 200 300 0 C. Mereka larut dengan baik. dalam air, dil. to-takh dan basa, hampir tidak ada sol. di organisasi. r-pengecer. Pengecualian: Oligopeptida yang dibuat dari residu asam amino hidrofobik.

Oligopeptida memiliki sifat amfoter dan, bergantung pada keasaman lingkungan, dapat berbentuk kation, anion, atau zwitterion. Dasar pita serapan pada spektrum IR untuk gugus NH adalah 3300 dan 3080 cm -1, untuk gugus C=O 1660 cm -1. Pada spektrum UV, pita serapan gugus peptida berada pada kisaran 180-230 nm. Isoelektrik titik (pI) peptida sangat bervariasi dan bergantung pada komposisi residu asam amino dalam molekul. Nilai pK a dari peptida adalah kira-kira. 3, untuk -N H 2 kira-kira. 8.

kimia. Sifat oligopeptida ditentukan oleh fungsi yang dikandungnya. kelompok, serta ciri-ciri ikatan peptida. Kimia mereka. transformasi menjadi sarana. setidaknya serupa dengan rasio asam amino yang sesuai. Mereka memberikannya padaku. reaksi biuret dan reaksi ninhidrin. Dipeptida dan turunannya (terutama ester) mudah bersiklus membentuk diketopiperazin. Di bawah pengaruh 5,7 n.

peptida asam klorida dihidrolisis menjadi asam amino dalam waktu 24 jam pada 105 0 C.

Perpaduan. kimia. sintesis peptida melibatkan pembuatan ikatan peptida antara gugus COOH dari satu asam amino dan NH2 dari asam amino atau peptida lain. Sesuai dengan ini, komponen karboksil dan amina dari proses sintesis peptida dibedakan. Untuk melakukan sintesis peptida yang ditargetkan dan terkontrol, perlu dilakukan terlebih dahulu. perlindungan sementara dari semua (atau beberapa) fungsi. kelompok yang tidak berpartisipasi dalam pembentukan ikatan peptida, dan juga sebelumnya. aktivasi salah satu komponen sintesis peptida. Setelah sintesis selesai, gugus pelindung dihilangkan. Saat memperoleh peptida yang aktif secara biologis, kondisi yang diperlukan adalah pencegahan rasemisasi asam amino pada semua tahap sintesis peptida.

Naib. cara penting untuk membentuk ikatan peptida saat melakukan r-tion dalam pengaktifan metode r-re. eter, karbodiimida, metode anhidrida campuran dan azida.

Metode ester teraktivasi didasarkan pada pra- pembentukan turunan ester dari komponen karboksil dengan memasukkan ke dalamnya residu alkohol yang mengandung substituen penarik elektron yang kuat. Akibatnya, ester yang sangat reaktif terbentuk, yang mudah mengalami aminolisis di bawah pengaruh komponen amino dari sintesis peptida. Sebagai aktivator ester dalam sintesis peptida, penta-fluoro-, pentachlor-, trikloro- dan n-nitrofenil dan sejumlah ester lain dari asam amino dan peptida terlindungi banyak digunakan.

Metode pembentukan ikatan peptida karbodiimida melibatkan penggunaan dekomp. karbodiimida tersubstitusi. Dicyclohexyl-carbodiimide terutama banyak digunakan dalam sintesis peptida:

X dan Y-resp. Gugus pelindung N dan C Dengan reagen kondensasi ini, dimungkinkan untuk mensintesis peptida dalam media berair, karena laju hidrolisis dan aminolisis O-asil isourea (II) yang terbentuk antara berbeda secara signifikan. Berbagai senyawa juga digunakan dalam sintesis peptida. karbodiimida yang larut dalam air (misalnya, N-dimetilaminopropil-N"-etilkarbodiimida).

Metode campuran anhidrida didasarkan pada pra-perawatan. aktivasi komponen karboksilat dari sintesis peptida dengan pembentukan anhidrida campuran dengan karboksilat atau inorg. WHO. Naib. alkil ester dari senyawa kloroform (karbonat klorida) sering digunakan, terutama etil dan isobutil eter, misalnya:

B - amina tersier

Saat mensintesis peptida menggunakan metode ini, campuran anhidrida asam amino N-asil dan asam pivalat (trimetilasetat) sangat efektif. Berkat put yang kuat. Karena efek induktif gugus tert-butil, elektrofilisitas atom karboksil C dalam residu asam pivalin berkurang secara signifikan, dan ini, bersama dengan sterik. hambatan, menekan yang tidak diinginkan pembentukan jaminan uretan dan bebas. Asam N-asilamino, tepinya dilakukan sesuai dengan skema:

Dalam salah satu varian metode anhidrida campuran, 1-etoksikarbonil-2-etoksi-1,2-dihidrokuinolin digunakan sebagai zat kondensasi. Inilah hubungannya. dengan mudah membentuk zat antara dengan komponen karboksil sintesis peptida. campuran anhidrida, yang dengan cepat masuk ke dalam larutan kondensasi, dan zat yang tidak diinginkan dihilangkan sepenuhnya. distribusi samping.

Kasus khusus dari metode anhidrida campuran adalah metode simetris. anhidrida, yang menggunakan anhidrida asam amino 2 O. Penggunaannya menghilangkan kemungkinan disproporsionasi atau aminolisis yang tidak tepat.

Metode sintesis azida melibatkan aktivasi komponen karboksil dengan mengubahnya menjadi azida dari asam amino atau peptida tersubstitusi N:

Karena ketidakstabilan azida, mereka bebas. bentuk dari solusi, sebagai suatu peraturan, tidak terisolasi. Jika, alih-alih nitrit logam alkali, alkil eter senyawa nitrogen (misalnya, tert-butil nitrit) digunakan untuk larutan dengan hidrazida, maka kondensasi azida dapat dilakukan di org. r-ritele; HN 3 yang dihasilkan terikat dengan amina tersier. Kondensasi azida seringkali dipersulit oleh komplikasi yang tidak diinginkan. reaksi samping (mengubah hidrazida bukan menjadi azida, tetapi menjadi urea; larutanhidrazida dengan azida, mengarah pada pembentukan 1,2-diasil-hidrazin; berselang pembentukan isosianat, yang akibat penataan ulang Curtius dapat menghasilkan turunan urea atau uretan yang sesuai, dll.). Keuntungan metode azida adalah tingkat rasemisasi yang rendah, kemungkinan penggunaan serin dan treonin tanpa melindungi gugus hidroksil.

Untuk mengubah peptida yang dilindungi diubah menjadi peptida bebas menggunakan khusus metode deblocking, yang didasarkan pada solusi yang memastikan pelepasan dekomposisi. kelompok pelindung yang menjamin pelestarian semua ikatan peptida dalam molekul. Contoh deblocking: penghilangan gugus benzil oksikarbonil dari katalitik. hidrogenolisis pada atm. tekanan dan suhu kamar, eliminasi gugus tert-butiloksikarbonil dengan cara asidolisis ringan, serta hidrolitik. pembelahan gugus trifluoroasetil di bawah aksi encer. solusi pondasi.

Saat mensintesis peptida yang aktif secara biologis, penting agar rasemisasi tidak terjadi; tepian dapat terjadi sebagai akibat dari eliminasi H + yang dapat dibalik dari a -atom C dari asam amino atau peptida N-asil. Rasemisasi didorong oleh basa dan senyawa, suhu tinggi, dan senyawa polar. Peran yang menentukan dimainkan oleh rasemisasi, yang dikatalisis oleh basa, yang dapat terjadi melalui apa yang disebut. mekanisme azlakton atau melalui enolisasi menurut skema berikut:

Naib. cara penting untuk menghindari rasemisasi: 1) perpanjangan rantai peptida searah dari ujung C ke ujung Nmenggunakan kelompok pelindung N seperti ROC(O). 2) Aktivasi fragmen peptida yang dilindungi N dengan prolin terminal-C atau residu glisin. 3) Penggunaan metode azida (dengan tidak adanya basa tersier berlebih dan pemeliharaan suhu rendah dalam media reaksi). 4) Aplikasi aktif. ester asam amino, aminolisis yang berlangsung melalui keadaan transisi, penstabil. jembatan hidrogen (misalnya, ester yang dibentuk dengan N-hydroxypiperidine dan 8-hydroxyquinoline). 5) Menggunakan metode karbodiimida dengan bahan tambahan senyawa N-hidroksi. atau kantor Lewis.

Seiring dengan sintesis peptida dalam larutan, sintesis peptida menggunakan pembawa yang tidak larut juga penting. Ini mencakup sintesis peptida fase padat (metode atau metode Maryfield) dan sintesis peptida menggunakan reagen polimer.

Strategi sintesis peptida fase padat melibatkan fiksasi sementara rantai peptida yang disintesis pada pembawa polimer yang tidak larut dan dilakukan sesuai dengan skema berikut:

Berkat metode ini, dimungkinkan untuk menggantikan prosedur pemisahan dan pemurnian zat antara yang sangat rumit dan memakan waktu. peptida dengan operasi pencucian dan penyaringan sederhana, serta mengurangi proses sintesis peptida ke urutan standar prosedur berulang secara berkala yang dapat dengan mudah diotomatisasi. Metode Merrifield memungkinkan untuk mempercepat proses sintesis peptida secara signifikan. Berdasarkan metodologi ini, berbagai jenis jenis otomatis penyintesis peptida.

Koneksinya sangat produktif. sintesis peptida fase padat dengan kemampuan pemisahan HPLC preparatif memberikan akses ke tingkat kimia yang baru secara kualitatif. sintesis peptida, yang, pada gilirannya, memiliki efek menguntungkan pada pengembangan berbagai peptida. bidang biokimia, kata mereka. biologi, rekayasa genetika, bioteknologi, farmakologi dan kedokteran.

Strategi sintesis peptida menggunakan reagen polimer melibatkan pengikatan sementara pada berat molekul tinggi. operator diaktifkan komponen karboksil atau zat kondensasi sintesis peptida. Keuntungan dari metode ini adalah bahwa reagen yang melekat pada polimer dapat dimasukkan secara berlebihan, dan pemisahan peptida yang disintesis dari polimer yang tidak larut tidaklah sulit.

Contoh sintesis semacam itu adalah melewatkan komponen amino dalam urutan tertentu melalui beberapa komponen. kolom, masing-masing berisi ikatan polimer

Ringkasan

Tinjauan ini berfokus pada studi farmakokinetik dan bioavailabilitas dalam pembuatan obat asli baru dengan struktur peptida. Banyak perhatian diberikan pada metode penentuan kuantitatif senyawa peptida dalam biomaterial, studi tentang karakteristik farmakokinetiknya, faktor-faktor yang mempengaruhi bioavailabilitas zat ini, dan beberapa data farmakokinetik obat dengan struktur peptida yang diperkenalkan ke dalam praktik medis juga disediakan.

Kata kunci: farmakokinetik, peptida pendek, bioavailabilitas, eksipien

Perkenalan

Gangguan kecemasan adalah gangguan mental yang ditandai dengan kecemasan umum yang terus-menerus, ketakutan patologis, ketegangan, dan kegugupan. Saat ini, prevalensi penyakit yang berhubungan dengan gangguan kecemasan berkisar antara 13,6 hingga 28,8% di negara-negara Barat dan terus meningkat karena tingginya laju kehidupan, ketegangan lingkungan dan sosial.

Karena peningkatan signifikan penyakit yang berhubungan dengan kecemasan dan gangguan depresi, pengembangan dan penerapan obat ansiolitik baru menjadi relevan. Saat ini, obat-obatan yang memiliki efek farmakologis terutama diwakili oleh sekelompok senyawa benzodiazepin, yang ditandai dengan kelelahan, kantuk, gangguan memori, ketergantungan obat mental dan fisik, dan sindrom penarikan, yang mengurangi kualitas hidup pasien. Salah satu obat ansiolitik yang tidak memiliki efek samping ini adalah obat afobazole. Hal di atas menegaskan perlunya mencari obat lain yang sangat efektif yang bebas dari efek samping benzodiazepin. Sains menaruh perhatian besar pada peptida endogen. Sampai saat ini, peran penting kolesistokinin neuropeptida endogen dalam patogenesis gangguan kecemasan telah diketahui. Diketahui bahwa kolesistokinin, yang bekerja pada reseptor CCK-B yang terletak di sistem saraf pusat, menunjukkan aktivitas ansiogenik - menginduksi serangan panik, berinteraksi dengan sistem opiat dan dengan demikian dapat memiliki efek anti-analgesik. Ada kemungkinan juga bahwa kolesistokinin berperan dalam patogenesis depresi dan skizofrenia.

Karena neuropeptida endogen memiliki stabilitas enzimatik yang rendah, mengalami hidrolisis di saluran pencernaan, dan hanya aktif setelah penetrasi melalui BBB, ada kebutuhan untuk mencari potensi anxiolytics (antagonis reseptor kolesistokinin) dengan struktur yang lebih kompak dan terlindungi yaitu efektif bila diberikan secara sistemik.

Berdasarkan hipotesis yang dikembangkan oleh Gudasheva T.A. kembali pada tahun 1985, tentang kemungkinan simulasi struktur prototipe non-peptida dengan aktivitas neurotropik tertentu, serta fragmen aktif dari peptida asli dengan aktivitas serupa, dipeptida ansiolitik GB-115 baru (N-fenil-N -hexanoyl-L-glisil-L amide) disintesis -triptofan) adalah retroanalog dari kolesistokinin-4. Aktivitas farmakologis senyawa tersebut telah ditetapkan: telah dibuktikan secara eksperimental bahwa GB-115 menunjukkan sifat ansiolitik, anti-alkohol, antidepresan, dan analgesik. Ketika diberikan secara oral, GB-115 menunjukkan aktivitas ansiolitik maksimumnya pada dosis 0,1 mg/kg. Obat menghentikan reaksi ansiogenik yang disebabkan oleh penarikan etanol dengan dosis 0,2 mg/kg, p.o. Aktivitas analgesik maksimum diwujudkan pada dosis 10 mg/kg, dan efek antidepresan pada dosis 0,025-0,05 mg/kg, i.p.

Melakukan studi farmakokinetik eksperimental suatu obat merupakan langkah penting untuk promosi lebih lanjut ke dalam praktik medis. Peningkatan parameter farmakokinetik memungkinkan terciptanya bentuk sediaan optimal yang akan dibedakan berdasarkan derajat dan laju penyerapan yang sesuai, karakteristik distribusi, jalur metabolisme dan ekskresi. Penilaian bioavailabilitas relatif memungkinkan seseorang untuk memilih bentuk sediaan dengan parameter farmakokinetik terbaik untuk senyawa yang diteliti.

Farmakokinetik adalah ilmu pengetahuan modern yang berkembang pesat yang mempelajari karakteristik penetrasi obat ke dalam tubuh, distribusi, biotransformasi dan eliminasi. Studi tentang proses ini, termasuk penilaian kuantitatifnya, adalah tujuan utama farmakokinetik.

Studi farmakokinetik zat aktif farmakologis baru dalam percobaan merupakan langkah wajib dalam penelitian, pengembangan dan penerapannya ke dalam praktik medis. Efektivitas obat secara langsung tergantung pada proses penyerapan, distribusi dan ekskresi obat dari tubuh.

Data farmakokinetik memungkinkan untuk menentukan rute dan metode pemberian, tempat penetrasi obat, perkiraan rejimen dosis, serta jalur utama eliminasi obat.

Penyerapan, distribusi, metabolisme dan ekskresi suatu senyawa obat merupakan proses yang saling berhubungan. Semuanya dipengaruhi oleh banyak faktor: laju absorpsi tergantung pada bentuk sediaan obat, konsentrasi zat aktif, pH medium tempat zat dilarutkan, motilitas usus dan keadaan permukaan absorpsi. daerah. Indikator distribusi dan biotransformasi suatu obat dipengaruhi oleh jenis kelamin, usia, keadaan somatik tubuh pasien, serta keadaan sistem enzimatik tubuh, yang seringkali disebabkan oleh perbedaan individu. Dengan demikian, laju metabolisme beberapa obat psikotropika dapat bervariasi dari 6 hingga 30 jam pada pasien yang berbeda. Pengeluaran metabolit dari dalam tubuh dapat dipengaruhi oleh penyakit penyerta, serta pengaruh obat lain.

Untuk menilai berbagai proses farmakokinetik obat dalam tubuh hewan dan manusia, parameter farmakokinetik yang sesuai dihitung, termasuk bioavailabilitas (F, %) - bagian dari dosis obat yang mencapai aliran darah sistemik setelah pemberian ekstravaskular.

Penting untuk memperhatikan kondisi untuk melakukan percobaan farmakokinetik dalam uji praklinis senyawa aktif farmakologis baru.

Agen farmakologi yang diteliti dianggap sebagai objek penelitian, yang dalam praktek praklinis dilakukan pada hewan sehat: tikus, mencit, kelinci, anjing, monyet dan lain-lain, yang beratnya tidak boleh berbeda dari standar untuk setiap spesies. lebih dari 10%.

Jenis bahan biologis utama adalah plasma serum darah, darah utuh, berbagai organ dan jaringan, urin, feses.

Rute pemberian ditentukan oleh bentuk obat, direkomendasikan berdasarkan studi farmakokinetik untuk studi farmakologi lebih lanjut. Metode pemberiannya bisa berbeda: intravena, intraperitoneal, intramuskular, subkutan, oral, dll. Obat ini diberikan secara oral kepada hewan menggunakan tabung faring atau duodenum pada waktu perut kosong untuk menghindari interaksi obat dengan makanan.

Administrasi dapat diulang atau tunggal. Dengan pemberian tunggal, perlu dipelajari farmakokinetik zat aktif dengan menggunakan setidaknya tiga tingkat dosis. Hal ini diperlukan untuk memverifikasi linearitas farmakokinetik.

Durasi percobaan harus sesuai dengan waktu 5 kali lebih lama dari waktu paruh.

Jumlah hewan per titik (nilai konsentrasi yang sesuai) harus minimal 5 jika hanya satu sampel yang diambil dari setiap hewan dari sampel (dalam percobaan pada tikus dalam kasus pemenggalan kepala: satu hewan - satu poin).

Salah satu tahapan penting dalam studi farmakokinetik dan biofarmasi senyawa aktif farmakologis baru adalah studi tentang bioavailabilitas absolut dan relatif (lihat bagian “Ketersediaan Hayati Obat”).

• Metode analisis untuk penentuan peptida dan turunannya

Ada berbagai metode untuk penentuan kualitatif dan kuantitatif asam amino, peptida dan turunannya. Dan penting untuk memilih metode optimal secara wajar untuk menganalisis obat potensial dengan struktur peptida. Hal ini akan memungkinkan kita mencapai analisis yang sensitif dan memperoleh hasil yang akurat dan dapat direproduksi yang akan menunjukkan farmakokinetik senyawa tertentu.

Klasifikasi:

• Metode kromatografi cair:

Kromatografi cair lapis tipis

Kromatografi cair kinerja tinggi

• Kromatografi gas
• Metode analisis imunokimia
• Elektroforesis kapiler

1.2 Kromatografi asam amino dan peptida

Kromatografi adalah metode fisikokimia untuk memisahkan komponen-komponen campuran yang dianalisis, berdasarkan perbedaan koefisien distribusinya antara dua fase: diam dan bergerak. Metode kromatografi yang paling menjanjikan adalah: kromatografi gas (GC) dan kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) yang dikombinasikan dengan detektor spektrometri massa - GC-MS dan HPLC-MS. Metode-metode ini berkembang dengan pesat, yang dikaitkan dengan pertumbuhan tugas-tugas yang muncul dalam beberapa tahun terakhir: proteomik, metabolomik, analisis biofuel, penentuan biomarker penyakit, pembuatan dan pengendalian mutu obat-obatan, pengendalian mutu dan keamanan pangan. , serta terorisme (penentuan zat beracun, zat berbahaya dan kombatan) dan penentuan cepat konsekuensi dari situasi darurat.

1.2.1 Metode kromatografi cair

1.2.1.1. Kromatografi cair kinerja tinggi

HPLC adalah metode fisikokimia untuk memisahkan komponen-komponen suatu campuran zat, berdasarkan perbedaan distribusinya antara dua fase yang tidak dapat bercampur, yang satu bersifat bergerak dan yang lainnya tidak bergerak. Tergantung pada polaritas fase gerak dan fase diam, HPLC biasanya dibagi menjadi fase normal (fasa diam lebih polar daripada fase gerak) dan fase balik (fasa diam kurang polar dibandingkan fase gerak).

HPLC fase terbalik sering digunakan untuk memisahkan asam amino dan peptida karena fakta bahwa sebagian besar analit sangat larut dalam fase gerak berair dan memiliki kelarutan terbatas dalam sebagian besar pelarut non-polar. Namun, HPLC fase normal digunakan untuk kromatografi turunan asam amino rantai pendek dan peptida dengan hidrofobisitas rendah, yang tidak ditahan oleh fase diam dalam HPLC fase terbalik. HPLC fase terbalik adalah standar emas untuk pemisahan dan pemurnian peptida sebelum penerapan spektrometri massa di bidang ini. RP-HPLC memiliki keunggulan sebagai berikut dibandingkan metode analisis kromatografi lainnya: reproduktifitas hasil, daya pemisahan yang tinggi, selektivitas (kemampuan untuk membedakan peptida dengan perbedaan satu asam amino), sensitivitas, kecepatan eksekusi yang tinggi, dan penggunaan a sejumlah kecil pelarut yang mudah menguap.

Selektivitas dan kualitas analisis peptida pada HPLC fase terbalik bergantung pada pilihan fase yang tepat: fase bergerak dan stasioner.

Sebagai fasa diam digunakan adsorben berupa silika gel yang dimodifikasi dengan berbagai turunan klorosilan. Fase ini memiliki kekuatan yang tinggi dan ketidakpedulian terhadap pelarut organik. Fase sebaliknya dibedakan berdasarkan karakteristik matriks - silika gel dan struktur radikal cangkok, yang berbeda dalam komposisi dan struktur fragmen karbon. Saat kromatografi peptida, pilihan fase balik ditentukan oleh ukuran dan hidrofobisitas peptida: untuk peptida dengan rantai pendek, peptida hidrofilik, fase C8 (n-oktil) dan C18 (n-oktadesil) digunakan, untuk yang besar dan yang hidrofobik - fase C3 (trimetil- atau dimetilpropil), C4 (n-butil), C6 (fenil).

Untuk memilih fase gerak yang tepat, perlu memperhitungkan pH, komposisi dan konsentrasi pelarut organik:

Untuk mengurangi polaritas peptida dan memastikan retensi yang lebih baik oleh adsorben, pH eluen harus berada pada kisaran 2-3. Selain itu, untuk meningkatkan waktu retensi peptida, apa yang disebut pengubah atau reagen pasangan ion (counterion), yang mampu membentuk pasangan ion dengan gugus peptida bermuatan positif, dimasukkan ke dalam fase gerak. Pengubah ionik utama dalam RP HPLC adalah asam trifluoroasetat. Ia mudah dihilangkan dari eluat melalui penguapan, melarutkan peptida dengan baik, dan transparan UV di wilayah panjang gelombang pendek, yang tidak menimbulkan puncak tambahan selama deteksi. Asam format juga digunakan sebagai pengubah dan memberikan pemisahan yang baik, namun penggunaannya dibatasi oleh penyerapan yang kuat di wilayah UV.

Pengaruh pelarut organik terhadap kemampuan elusi fase gerak sangat besar. Jadi, kekuatan elusi pelarut meningkat dengan urutan sebagai berikut: air - metanol - asetonitril - etanol - dioksan - tetrahidrofuran - 2-propanol - 1-propanol. Urutan ini disebabkan oleh penurunan polaritas zat organik pada seri ini. Asetonitril paling sering digunakan sebagai komponen organik fase gerak, karena transparan di wilayah UV hingga 200 nm, memiliki viskositas rendah, sangat mudah menguap, sehingga, jika perlu, mudah dihilangkan dari eluat yang dikumpulkan. fraksi, dan ditandai dengan selektivitas yang baik.

Pemisahan senyawa peptida dapat dilakukan dalam kondisi isokratik, dimana konsentrasi pelarut organik konstan, atau dengan elusi gradien, dalam hal ini konsentrasi pelarut organik meningkat seiring waktu. Zat uji dielusi dalam rangka meningkatkan hidrofobisitas.

1.2.1.2. Metode untuk mendeteksi peptida dalam kromatografi cair kinerja tinggi: deteksi UV, spektrometri massa.

Untuk melakukan analisis kualitatif dan kuantitatif secara akurat setelah pemisahan bahan obat dengan HPLC, perlu menggunakan peralatan untuk mendeteksinya, yang pada gilirannya memiliki persyaratan sebagai berikut: detektor harus memiliki sensitivitas tinggi (sinyal bagus, tidak berisik), kecepatan, rentang dinamis linier yang lebar, stabilitas, kurangnya interaksi dengan fase gerak.

Salah satu metode deteksi yang paling umum dalam kromatografi cair kinerja tinggi adalah ultraviolet, yang dijelaskan oleh sensitivitas analisis yang tinggi, kesederhanaan, dan keterjangkauan dari sudut pandang ekonomi. Namun, deteksi UV adalah metode yang kurang sensitif dibandingkan spektrometri massa. Detektor UV saat ini diwakili oleh empat jenis utama:

• dengan panjang gelombang tetap;
• dengan monokromator yang memungkinkan Anda mengubah panjang gelombang dalam jangkauannya;
• dengan monokromator yang dapat disetel secara otomatis yang memungkinkan deteksi multi-panjang gelombang dan multi-saluran;
• detektor dioda-matriks yang memungkinkan memperoleh informasi spektral penuh dalam rentang tertentu.

Karena adanya beberapa kromofor dalam komposisi asam amino, serta ikatan peptida itu sendiri, senyawa peptida dapat dideteksi menggunakan radiasi UV menggunakan salah satu dari empat jenis peralatan yang tercantum di atas.

Senyawa peptida mampu menyerap radiasi UV di tiga area:

Di atas 250 nm (λ=280 nm), hal ini disebabkan oleh adanya asam amino aromatik dalam senyawa yang dianalisis - triptofan (λ=278 nm), tirosin (λ=275 nm) dan fenilalanin.

Pada 210-250 nm, sinyal seperti itu dapat diberikan oleh asam amino lain yang memiliki ikatan hidrogen intra dan antarmolekul dalam molekul protein.

Pada 190 nm, hal ini dijelaskan oleh adanya ikatan peptida.

Namun deteksi senyawa yang diteliti tidak dilakukan pada panjang gelombang di bawah 210 nm karena pengaruh pelarut yang digunakan dalam HPLC yang mempunyai serapan sendiri pada panjang gelombang kurang dari 210 nm, serta karena adanya pengotor. Oleh karena itu, ketika mendeteksi zat peptida, rentang panjang gelombang di atas 250 nm sering digunakan. Jika senyawa tersebut tidak mengandung kromofor yang dapat menyerap radiasi UV di wilayah tersebut, maka senyawa tersebut menggunakan metode derivatisasi.

Derivatisasi adalah modifikasi kimia suatu analit untuk menghasilkan senyawa turunan yang memiliki sifat analitis yang lebih baik. Saat bekerja dengan HPLC-UV melalui derivatisasi, perlu diperoleh senyawa yang terdaftar dalam spektrum UV di wilayah yang sesuai untuk analisis bahan biologis. Jadi dalam karya Rudenko A.O. Saat menentukan asam amino terpenting dalam matriks biologis kompleks, metode derivatisasi 16 asam amino digunakan. O-phthalaldehyde digunakan sebagai agen derivatisasi.

Metode deteksi spektrometri massa terdiri dari tiga tahap: ionisasi, pemisahan massa-ke-muatan, dan deteksi selanjutnya menggunakan penganalisis massa. Untuk analisis senyawa obat, teknik ionisasi “lunak” digunakan: ionisasi elektrospray, serta desorpsi laser berbantuan matriks (MALDI). Metode ini mewakili mode ionisasi lembut, yang sangat penting untuk biomolekul yang tidak stabil secara termal. Namun, jenis ionisasi ini tidak cukup informatif, sehingga sering kali menggunakan spektrometri massa tandem (MS/MS), suatu metode untuk merekam fragmen analit. Untuk lebih tepatnya, metode ini terdiri dari beberapa tahap: pertama, senyawa yang dianalisis terionisasi lembut, melewati penganalisis pertama, kemudian energinya ditingkatkan, sehingga molekul yang diteliti terfragmentasi dan penganalisis kedua mencatat massa yang dihasilkan. spektrum.

Untuk penentuan kuantitatif senyawa obat baru, jenis penganalisis massa berikut digunakan:

Quadrupole (penganalisis massa berdasarkan tiga kuadrupol), yang merupakan “standar emas” dalam studi senyawa obat baru;

Time-of-flight (TOF), bila digunakan, mencapai sensitivitas yang lebih rendah dibandingkan saat menggunakan penganalisis triple quadrupole.

Resonansi ion siklotron dan perangkap ion orbital, yang merupakan penganalisis massa resolusi tinggi dan sejauh ini jarang digunakan karena tingginya biaya dan kompleksitas perangkat tersebut.

Penggunaan deteksi spektrometri massa yang dikombinasikan dengan HPLC telah memungkinkan pencapaian tingkat analisis yang tinggi, meningkatkan batas deteksi senyawa obat, dan secara signifikan meningkatkan stabilitas dan akurasi penelitian.

• Kromatografi lapis tipis

Saat ini, KLT digunakan pada tingkat yang lebih rendah karena metode pemisahan peptida berteknologi tinggi telah tersedia, seperti HPLC, kromatografi kolom cair, kromatografi penukar ion, elektroforesis gel protein poliakrilamida, dan elektroforesis kapiler. Namun, TLC terbukti merupakan metode kuantitatif, berteknologi tinggi, relatif murah dan mudah direproduksi pada masanya. Kromatografi lapis tipis populer di tahun 80an - asam amino diisolasi dari tumbuhan, hewan, dan berbagai cairan biologis.