Fermentų veikimo molekulinis poveikis. Fermentai. Fermentinės katalizės ypatybės. Fermentų struktūra ir struktūra Fermentinė reakcija pagal „nuoseklių reakcijų“ tipą

Bet kokia katalizinė reakcija apima tiek tiesioginių, tiek atvirkštinių reakcijų greičio pasikeitimą dėl jos energijos sumažėjimo. Jei cheminė reakcija vyksta išleidžiant energiją, ji turi prasidėti savaime. Tačiau taip neatsitinka, nes reakcijos komponentai turi būti perkelti į aktyvuotą (pereinamąją) būseną. Energija, reikalinga reaguojančioms molekulėms paversti aktyvuota būsena, vadinama aktyvacijos energija.

Pereinamoji būsena būdingas nuolatinis cheminių ryšių formavimasis ir nutrūkimas, o tarp pereinamosios ir pagrindinės būsenos yra termodinaminė pusiausvyra. Priekinės reakcijos greitis priklauso nuo temperatūros ir substrato laisvosios energijos verčių skirtumo pereinamojoje ir pagrindinėje būsenose. Šis skirtumas vadinamas laisvoji reakcijos energija.

Pagrindo pereinamąją būseną pasiekti galima dviem būdais:

• dėl energijos pertekliaus perdavimo reaguojančioms molekulėms (pavyzdžiui, dėl temperatūros padidėjimo),
• sumažinant atitinkamos cheminės reakcijos aktyvavimo energiją.

Reaguojančių medžiagų įžeminimo ir pereinamosios būsenos.

Eo, Ek – reakcijos aktyvavimo energija be katalizatoriaus ir jam esant; DG-

laisvosios reakcijos energijos skirtumas.

Fermentai „padeda“ substratams įgyti pereinamąją būseną dėl surišimo energijos formavimosi metu fermento-substrato kompleksas. Aktyvacijos energijos sumažėjimas fermentinės katalizės metu atsiranda dėl padidėjusio cheminio proceso etapų skaičiaus. Daugelio tarpinių reakcijų indukcija lemia tai, kad pradinis aktyvacijos barjeras yra padalintas į keletą žemesnių barjerų, kuriuos reaguojančios molekulės gali įveikti daug greičiau nei pagrindinė.

Fermentinės reakcijos mechanizmą galima pavaizduoti taip:

1. fermento (E) ir substrato (S) ryšys su nestabilaus fermento-substrato komplekso (ES) susidarymu: E + S → E-S;
2. aktyvuotos pereinamosios būsenos formavimas: E-S → (ES)*;
3. reakcijos produktų išsiskyrimas (P) ir fermento (E) regeneracija: (ES)* → P + E.

Siekiant paaiškinti didelį fermento veikimo efektyvumą, buvo pasiūlytos kelios fermentinės katalizės mechanizmo teorijos. Ankstyviausias yra E. Fisherio teorija („šablono“ arba „standžiosios matricos“ teorija“). Pagal šią teoriją fermentas yra standi struktūra, kurios aktyvusis centras yra substrato „liejimas“. Jei substratas priartėja prie aktyvios fermento vietos kaip „raktas į spyną“, įvyks cheminė reakcija. Ši teorija gerai paaiškina dviejų tipų fermentų substrato specifiškumą – absoliutų ir stereospecifiškumą, tačiau pasirodo esanti nepagrįsta paaiškinant fermentų grupinį (santykinį) specifiškumą.

"Stogo" teorija remiantis G. K. Eulerio, tyrinėjusio hidrolizinių fermentų veikimą, idėjomis. Remiantis šia teorija, fermentas jungiasi prie substrato molekulės dviejuose taškuose, o cheminis ryšys ištempiamas, elektronų tankis perskirstomas ir cheminis ryšys nutrūksta, kartu pridedant vandens. Prieš prisijungiant prie fermento, substratas turi „atsipalaidavusią“ konfigūraciją. Prisijungus prie aktyviojo centro, substrato molekulė tempiasi ir deformuojasi (ji yra aktyviajame centre tarsi ant stovo). Kuo ilgesnės cheminės jungtys substrate, tuo lengviau jos nutrūksta ir tuo mažesnė cheminės reakcijos aktyvavimo energija.

Pastaruoju metu jis tapo plačiai paplitęs D. Koshlando „indukuoto susirašinėjimo“ teorija, kuris leidžia užtikrinti didelį fermento molekulės konformacinį labilumą, aktyvaus centro lankstumą ir mobilumą. Substratas sukelia konformacinius fermento molekulės pokyčius taip, kad aktyvusis centras įgauna erdvinę orientaciją, reikalingą substratui surišti, ty substratas artėja prie aktyvaus centro kaip „ranka prie pirštinės“.

Remiantis sukeltos korespondencijos teorija, fermento ir substrato sąveikos mechanizmas yra toks:

1. Fermentas, remdamasis komplementarumo principu, atpažįsta ir „pagauna“ substrato molekulę. Šiame procese baltymo molekulei padeda jos atomų terminis judėjimas;
2. aktyvaus centro aminorūgščių liekanos pasislenka ir sureguliuojamos substrato atžvilgiu;
3. į aktyviąją vietą kovalentiškai pridedamos cheminės grupės – kovalentinė katalizė.

Fermentinės katalizės įvykių seką galima apibūdinti tokia diagrama. Pirmiausia susidaro substrato-fermento kompleksas. Tokiu atveju pasikeičia fermento molekulės ir substrato molekulės konformacijos, pastaroji fiksuojama aktyviajame centre įtempta konfigūracija. Taip susidaro aktyvuotas kompleksas, arba pereinamoji būsena, yra didelės energijos tarpinė struktūra, kuri yra energetiškai mažiau stabili nei pirminiai junginiai ir produktai. Svarbiausią indėlį į bendrą katalizinį efektą įneša pereinamosios būsenos stabilizavimo procesas – baltymo aminorūgščių liekanų ir substrato sąveika, kuri yra įtemptoje konfigūracijoje. Skirtumas tarp pradinių reagentų laisvosios energijos verčių ir pereinamosios būsenos atitinka laisvąją aktyvacijos energiją (ΔG #). Reakcijos greitis priklauso nuo reikšmės (ΔG #): kuo jis mažesnis, tuo didesnis reakcijos greitis ir atvirkščiai. Iš esmės GD yra „energijos barjeras“, kurį reikia įveikti, kad įvyktų reakcija. Perėjimo būsenos stabilizavimas sumažina šią „barjerą“ arba aktyvacijos energiją. Kitame etape įvyksta pati cheminė reakcija, po kurios susidarę produktai išsiskiria iš fermentų ir produktų komplekso.

Didelio fermentų katalizinio aktyvumo priežastys yra kelios, kurios sumažina reakcijos energijos barjerą.

1. Fermentas gali surišti reaguojančių substratų molekules taip, kad jų reaktyviosios grupės bus išsidėsčiusios arti viena kitos ir nuo fermento katalizinių grupių (poveikis suartėjimas).

2. Susidarius substrato-fermento kompleksui pasiekiamas substrato fiksavimas ir optimali orientacija nutrūkti bei susidaryti cheminiams ryšiams (poveikis orientacija).

3. Substrato surišimas pašalina jo hidratacijos apvalkalą (yra vandenyje ištirpusiose medžiagose).

4. Substrato ir fermento sukeltos korespondencijos poveikis.

5. Pereinamosios būsenos stabilizavimas.

6. Tam tikros grupės fermento molekulėje gali suteikti rūgščių-šarmų katalizė(protonų pernešimas substrate) ir nukleofilinė katalizė(kovalentinių ryšių su substratu susidarymas, dėl kurio susidaro struktūros, kurios yra reaktyvesnės už substratą).

Vienas iš rūgščių-šarmų katalizės pavyzdžių yra glikozidinių jungčių hidrolizė mureino molekulėje veikiant lizocimui. Lizocimas yra fermentas, esantis įvairių gyvūnų ir augalų ląstelėse: ašarų skystyje, seilėse, vištienos baltymuose, piene. Vištienos kiaušinių lizocimas yra 14 600 Da molekulinės masės, susideda iš vienos polipeptidinės grandinės (129 aminorūgščių liekanos) ir turi 4 disulfidinius tiltelius, kurie užtikrina aukštą fermento stabilumą. Lizocimo molekulės rentgeno struktūrinė analizė parodė, kad ji susideda iš dviejų domenų, sudarančių „tarpą“, kuriame yra aktyvusis centras. Prie šio „tarpelio“ jungiasi heksosacharidas, o fermentas turi savo vietą kiekvienam iš šešių mureino cukrinių žiedų (A, B, C, D, E ir F) surišti (6.4 pav.).

Mureino molekulė yra laikoma aktyvioje lizocimo vietoje daugiausia dėl vandenilio ryšių ir hidrofobinės sąveikos. Netoli glikozidinės jungties hidrolizės vietos yra 2 aktyvaus centro aminorūgščių liekanos: glutamo rūgštis, užimanti 35 vietą polipeptide, ir asparto rūgštis, kuri yra 52 pozicijoje polipeptide (6.5 pav.). .

Šių likučių šoninės grandinės yra priešinguose „plyšio“ paviršiuose, arti užpultos glikozidinės jungties – maždaug 0,3 nm atstumu. Glutamato liekana yra nepolinėje aplinkoje ir nėra jonizuota, o aspartato liekana yra polinėje aplinkoje; jo karboksilo grupė yra deprotonuota ir dalyvauja kaip vandenilio akceptorius sudėtingame vandenilio jungčių tinkle.

Hidrolizės procesas atliekamas taip. Glu-35 liekanos protonuota karboksilo grupė suteikia savo protoną glikozidiniam deguonies atomui, dėl kurio nutrūksta ryšys tarp šio deguonies atomo ir cukraus žiedo C 1 atomo, esančio D vietoje (bendros rūgšties katalizės etapas). ). Dėl to susidaro produktas, apimantis E ir F regionuose esančius cukrinius žiedus, kurie gali išsiskirti iš komplekso su fermentu. D srityje esančio cukraus žiedo konformacija yra iškraipoma ir įgauna konformaciją puskėdės, kuriame penki iš šešių atomų, sudarančių cukraus žiedą, yra praktiškai toje pačioje plokštumoje. Ši struktūra atitinka pereinamosios būsenos konformaciją. Šiuo atveju C 1 atomas pasirodo esąs teigiamai įkrautas, o tarpinis produktas vadinamas karbonio jonu (karbokacija). Pereinamosios būsenos laisvoji energija mažėja, nes karbonio joną stabilizuoja Asp-52 liekanos deprotonuota karboksilo grupė (6.5 pav.).

Kitame etape vandens molekulė patenka į reakciją ir pakeičia disacharido likučius, difunduojančius iš aktyvaus centro srities. Vandens molekulės protonas patenka į Glu-35, o hidroksilo jonas (OH -) į karbonio jono C 1 atomą (bendros bazinės katalizės etapas). Dėl to antrasis suskilusio polisacharido fragmentas tampa reakcijos produktu (kėdės konformacija) ir palieka aktyvų centro sritį, o fermentas grįžta į pradinę būseną ir yra pasirengęs atlikti kitą disacharido skilimo reakciją (6.5 pav.). .

Fermentų savybės

Apibūdindami fermentų savybes pirmiausia naudojame sąvoką „aktyvumas“. Fermento aktyvumas suprantamas kaip fermento kiekis, katalizuojantis tam tikro substrato kiekio virsmą per laiko vienetą. Fermentinių preparatų aktyvumui išreikšti naudojami du alternatyvūs vienetai: tarptautinis (E) ir „catal“ (kat). Tarptautinis fermento aktyvumo vienetas yra fermento kiekis, kuris katalizuoja 1 µmol substrato pavertimą produktu per 1 minutę standartinėmis sąlygomis (paprastai optimaliomis). Vienas katalas reiškia fermento kiekį, kuris katalizuoja 1 molio substrato konversiją per 1 s. 1 katė = 6 * 10 7 E.

Dažnai fermentų preparatai pasižymi specifiniu aktyvumu, kuris atspindi fermento gryninimo laipsnį. Specifinis aktyvumas – tai fermento aktyvumo vienetų skaičius 1 mg baltymo.

Fermentų aktyvumas labai priklauso nuo išorinių sąlygų, tarp kurių svarbiausia yra aplinkos temperatūra ir pH. Temperatūros padidėjimas 0–50 ° C diapazone paprastai sukelia sklandų fermentinio aktyvumo padidėjimą, kuris yra susijęs su substrato-fermento komplekso susidarymo pagreitėjimu ir visais vėlesniais kataliziniais įvykiais. Tačiau toliau didėjant temperatūrai dažniausiai didėja inaktyvuoto fermento kiekis dėl jo baltyminės dalies denatūravimo, kuris išreiškiamas aktyvumo sumažėjimu. Kiekvienas fermentas apibūdinamas optimali temperatūra- temperatūros vertė, kuriai esant užregistruojamas didžiausias jo aktyvumas. Dažniau augalinės kilmės fermentams optimali temperatūra yra 50–60 °C, o gyvulinių – 40–50 °C. Termofilinių bakterijų fermentams būdingas labai aukštas temperatūros optimalumas.

Fermentų aktyvumo priklausomybė nuo aplinkos pH verčių taip pat yra sudėtinga. Kiekvienas fermentas apibūdinamas optimalus pH aplinka, kurioje jis demonstruoja didžiausią aktyvumą. Nutolstant nuo šio optimalumo viena ar kita kryptimi, fermentinis aktyvumas mažėja. Tai paaiškinama fermento aktyvaus centro būsenos pasikeitimu (funkcinių grupių jonizacijos sumažėjimu arba padidėjimu), taip pat visos baltymo molekulės tretine struktūra, kuri priklauso nuo katijoninių ir anijonų santykio. jame esantys centrai. Daugumos fermentų pH optimalus yra neutralus. Tačiau yra fermentų, kurių didžiausias aktyvumas yra 1,5 (pepsinas) arba 9,5 (arginazė).

Fermentų aktyvumas labai svyruoja, priklausomai nuo poveikio inhibitoriai(aktyvumą mažinančios medžiagos) ir aktyvatoriai(aktyvumą didinančios medžiagos). Inhibitorių ir aktyvatorių vaidmenį gali atlikti metalų katijonai, kai kurie anijonai, fosfatų grupių nešikliai, redukuojantys ekvivalentai, specifiniai baltymai, tarpiniai ir galutiniai metabolizmo produktai ir kt. Šios medžiagos gali patekti į ląstelę iš išorės arba pasigaminti joje. . Pastaruoju atveju kalbama apie fermentų aktyvumo reguliavimą – neatskiriamą bendro metabolizmo reguliavimo grandį.

Medžiagos, turinčios įtakos fermento aktyvumui, gali jungtis prie aktyvių ir alosterinių fermento centrų, taip pat už šių centrų ribų. Konkretūs tokių reiškinių pavyzdžiai bus aptarti 7-19 skyriuose.. Norint apibendrinti kai kuriuos fermentų aktyvumo slopinimo modelius, reikia pažymėti, kad šie reiškiniai dažniausiai būna dviejų tipų – grįžtamieji ir negrįžtamieji. Per grįžtamasis slopinimas po jos disociacijos su inhibitoriumi fermento molekulėje nepakeičiama. Pavyzdys yra veiksmas substrato analogai, kuris gali prisijungti prie aktyvios fermento vietos, neleidžiant fermentui sąveikauti su tikruoju substratu. Tačiau padidėjus substrato koncentracijai, inhibitorius „išstumiamas“ iš aktyvios vietos, o katalizuojamos reakcijos greitis atsistato ( konkurencinis slopinimas). Kitas grįžtamojo slopinimo atvejis yra inhibitoriaus prisijungimas prie fermento protezinės grupės arba apofermentas, už aktyvaus centro ribų. Pavyzdžiui, fermentų sąveika su sunkiųjų metalų jonais, kurie prisijungia prie fermento aminorūgščių liekanų sulfhidrilo grupių, baltymų ir baltymų sąveika arba kovalentinė fermento modifikacija. Šis veiklos slopinimas vadinamas nekonkurencingas.

Negrįžtamas slopinimas daugeliu atvejų jis grindžiamas vadinamųjų „ savižudybės substratai» su aktyviomis fermentų vietomis. Tokiu atveju tarp substrato ir fermento susidaro kovalentiniai ryšiai, kurie suyra labai lėtai ir fermentas ilgą laiką negali atlikti savo funkcijos. „Savižudiško substrato“ pavyzdys yra antibiotikas penicilinas (18 skyrius, 18.1 pav.).

Kadangi fermentams būdingas veikimo specifiškumas, jie klasifikuojami pagal katalizuojamos reakcijos tipą. Pagal šiuo metu priimtą klasifikaciją fermentai skirstomi į 6 klases:

1. Oksidoreduktazės (redokso reakcijos).

2. Transferazės (funkcinių grupių perkėlimo tarp substratų reakcijos).

3. Hidrolazės (hidrolizės reakcijos, perkeltos grupės akceptorius yra vandens molekulė).

4. Liazės (grupių pašalinimo nehidroliziniu būdu reakcijos).

5. Izomerazės (izomerizacijos reakcijos).

6. Ligazės, arba sintetazės (sintezės reakcijos dėl nukleozidų trifosfatų, dažniausiai ATP, skilimo energijos).

Atitinkamos fermentų klasės numeris fiksuojamas jos kodų numeracijoje (šifre). Fermento kodas susideda iš keturių skaičių, atskirtų taškais, nurodančių fermento klasę, poklasį, poklasį ir poklasio serijos numerį.

FERMENTŲ KATALIZĖS ŽINGSNIAI

1. Fermento-substrato komplekso susidarymas

Fermentai pasižymi dideliu specifiškumu ir tai leido iškelti hipotezę, pagal kurią fermento aktyvusis centras yra komplementarus substratui, t.y. atitinka jį kaip „raktą nuo spynos“. Po to, kai „rakto“ substratas sąveikauja su „užrakto“ aktyviuoju centru, įvyksta substrato cheminės transformacijos į gaminį.

Vėliau buvo pasiūlyta kita šios hipotezės versija – aktyvusis centras yra lanksti struktūra substrato atžvilgiu. Substratas, sąveikaudamas su aktyviuoju fermento centru, sukelia jo konformacijos pasikeitimą, dėl kurio susidaro fermento-substrato kompleksas. Tuo pačiu metu substratas keičia ir savo konformaciją, o tai užtikrina didesnį fermentinės reakcijos efektyvumą.

2. Fermentinės katalizės įvykių seka

A. priartėjimo prie substrato ir jo orientavimo aktyvaus fermento centro atžvilgiu stadija

b. fermento-substrato komplekso susidarymas

V. substrato deformacija ir nestabilaus fermento-produkto komplekso susidarymas

d) fermento ir produkto komplekso skilimas, kai iš aktyvaus fermento centro išsiskiria reakcijos produktai ir fermentas

3. Aktyvios vietos vaidmuo fermentinėje katalizėje

Tik nedidelė fermento dalis liečiasi su substratu, nuo 5 iki 10 aminorūgščių liekanų, kurios sudaro aktyvųjį fermento centrą. Likusios aminorūgščių liekanos užtikrina teisingą fermento molekulės konformaciją optimalioms cheminėms reakcijoms. Fermento aktyviojoje vietoje substratai išsidėsto taip, kad reakcijoje dalyvaujančių substratų funkcinės grupės būtų labai arti viena kitos. Toks substratų išdėstymas sumažina aktyvacijos energiją, kuri lemia fermentų katalizinį efektyvumą.

Yra 2 pagrindiniai fermentinės katalizės mechanizmai:

1. rūgščių-šarmų katalizė

2. kovalentinė katalizė

Rūgščių-šarmų katalizės samprata fermentinį aktyvumą paaiškina rūgščių grupių (protonų donorų) ir (arba) bazinių grupių (protonų akceptorių) dalyvavimu cheminėje reakcijoje. Aminorūgščių liekanos, sudarančios aktyvųjį centrą, turi funkcines grupes, kurios pasižymi ir rūgščių, ir bazių savybėmis. Tai cisteinas, tirozinas, serinas, lizinas, glutamo rūgštis, asparto rūgštis ir histidinas.

Rūgščių-šarmų katalizės pavyzdys yra alkoholio oksidacija naudojant fermentą alkoholio dehidrogenazę.

Kovalentinė katalizė pagrįsta fermento aktyvaus centro „-“ ir „+“ grupių ataka substrato molekulėmis, susidarant kovalentiniam ryšiui tarp substrato ir kofermento. Pavyzdys yra serino proteazių (pripsino, chemotripsino) poveikis peptidinių jungčių hidrolizei baltymų virškinimo metu. Kovalentinis ryšys susidaro tarp substrato ir fermento aktyvios vietos serino aminorūgšties liekanos.

Katalizė yra cheminės reakcijos pagreitinimo procesas, veikiant katalizatoriams, kurie joje aktyviai dalyvauja, tačiau reakcijos pabaigoje lieka chemiškai nepakitę. Katalizatorius pagreitina cheminės pusiausvyros tarp pradinių medžiagų ir reakcijos produktų sukūrimą. Energija, reikalinga cheminei reakcijai pradėti, vadinama aktyvacijos energija. Tai būtina, kad reakcijoje dalyvaujančios molekulės galėtų patekti į reaktyviąją (aktyviąją) būseną. Fermento veikimo mechanizmas yra skirtas aktyvacijos energijos mažinimui. Tai pasiekiama padalijant reakciją į atskirus etapus arba etapus dalyvaujant pačiam fermentui. Kiekvienas naujas etapas turi mažesnę aktyvinimo energiją. Reakcijos padalijimas į etapus tampa įmanomas dėl to, kad susidaro fermento kompleksas su pradinėmis medžiagomis, vadinamaisiais substratais. S). Toks kompleksas vadinamas fermento-substrato kompleksu ( ES). Tada šis kompleksas suskaidomas, kad susidarytų reakcijos produktas (P) ir nepakitęs fermentas ( E).

E + SESE + P

Taigi fermentas yra biokatalizatorius, kuris, sudarydamas fermento-substrato kompleksą, suskaido reakciją į atskiras stadijas su mažesne aktyvacijos energija ir taip smarkiai padidina reakcijos greitį.

4. Fermentų savybės.

Visi fermentai yra baltyminio pobūdžio.

Fermentai turi didelę molekulinę masę.

Jie gerai tirpsta vandenyje ir, ištirpę, sudaro koloidinius tirpalus.

Visi fermentai yra termolabūs, t.y. optimalus veikimas 35 – 45 o C

Pagal savo chemines savybes jie yra amfoteriniai elektrolitai.

Fermentai yra labai specifiniai substratų atžvilgiu.

Fermentų veikimui reikalinga griežtai apibrėžta pH vertė (pepsinas 1,5–2,5).

Fermentai pasižymi dideliu kataliziniu aktyvumu (paspartina reakcijos greitį 10 6 – 10 11 kartų).

Visi fermentai gali denatūruotis veikiami stiprių rūgščių, šarmų, alkoholių ir sunkiųjų metalų druskų.

Fermento veikimo specifiškumas:

Pagal veikimo specifiškumą fermentai skirstomi į dvi grupes: turinčius absoliutų specifiškumą ir turinčius santykinį specifiškumą.

Santykinis specifiškumas stebimas, kai fermentas katalizuoja vienos rūšies reakciją su daugiau nei vienu į struktūrą panašiu substratu. Pavyzdžiui, pepsinas skaido visus gyvūninės kilmės baltymus. Tokie fermentai veikia tam tikro tipo cheminį ryšį, šiuo atveju peptidinį ryšį. Šių fermentų veikimas apima daugybę substratų, o tai leidžia organizmui susidoroti su nedideliu skaičiumi virškinimo fermentų.

Absoliutus specifiškumas pasireiškia, kai fermentas veikia tik vieną vienintelę medžiagą ir katalizuoja tik tam tikrą šios medžiagos virsmą. Pavyzdžiui, sacharozė tik skaido sacharozę.

Veiksmo grįžtamumas:

Kai kurie fermentai gali katalizuoti tiek tiesiogines, tiek atvirkštines reakcijas. Pavyzdžiui, laktato dehidrogenazė – fermentas, kuris katalizuoja laktato oksidaciją į piruvatą ir piruvato redukciją į laktatą.

Fermentinės katalizės įvykių seką galima apibūdinti tokia diagrama. Pirmiausia susidaro substrato-fermento kompleksas. Tokiu atveju pasikeičia fermento molekulės ir substrato molekulės konformacijos, pastaroji fiksuojama aktyviajame centre įtempta konfigūracija. Taip susidaro aktyvuotas kompleksas, arba pereinamoji būsena, yra didelės energijos tarpinė struktūra, kuri yra energetiškai mažiau stabili nei pirminiai junginiai ir produktai. Svarbiausią indėlį į bendrą katalizinį efektą įneša pereinamosios būsenos stabilizavimo procesas – baltymo aminorūgščių liekanų ir substrato sąveika, kuri yra įtemptoje konfigūracijoje. Skirtumas tarp pradinių reagentų laisvosios energijos verčių ir pereinamosios būsenos atitinka laisvąją aktyvacijos energiją (ΔG #). Reakcijos greitis priklauso nuo reikšmės (ΔG #): kuo jis mažesnis, tuo didesnis reakcijos greitis ir atvirkščiai. Iš esmės GD yra „energijos barjeras“, kurį reikia įveikti, kad įvyktų reakcija. Perėjimo būsenos stabilizavimas sumažina šią „barjerą“ arba aktyvacijos energiją. Kitame etape įvyksta pati cheminė reakcija, po kurios susidarę produktai išsiskiria iš fermentų ir produktų komplekso.

Didelio fermentų katalizinio aktyvumo priežastys yra kelios, kurios sumažina reakcijos energijos barjerą.

1. Fermentas gali surišti reaguojančių substratų molekules taip, kad jų reaktyviosios grupės bus išsidėsčiusios arti viena kitos ir nuo fermento katalizinių grupių (poveikis suartėjimas).

2. Susidarius substrato-fermento kompleksui pasiekiamas substrato fiksavimas ir optimali orientacija nutrūkti bei susidaryti cheminiams ryšiams (poveikis orientacija).

3. Substrato surišimas pašalina jo hidratacijos apvalkalą (yra vandenyje ištirpusiose medžiagose).

4. Substrato ir fermento sukeltos korespondencijos poveikis.

5. Pereinamosios būsenos stabilizavimas.

6. Tam tikros grupės fermento molekulėje gali suteikti rūgščių-šarmų katalizė(protonų pernešimas substrate) ir nukleofilinė katalizė(kovalentinių ryšių su substratu susidarymas, dėl kurio susidaro struktūros, kurios yra reaktyvesnės už substratą).

Vienas iš rūgščių-šarmų katalizės pavyzdžių yra glikozidinių jungčių hidrolizė mureino molekulėje veikiant lizocimui. Lizocimas yra fermentas, esantis įvairių gyvūnų ir augalų ląstelėse: ašarų skystyje, seilėse, vištienos baltymuose, piene. Vištienos kiaušinių lizocimas yra 14 600 Da molekulinės masės, susideda iš vienos polipeptidinės grandinės (129 aminorūgščių liekanos) ir turi 4 disulfidinius tiltelius, kurie užtikrina aukštą fermento stabilumą. Lizocimo molekulės rentgeno struktūrinė analizė parodė, kad ji susideda iš dviejų domenų, sudarančių „tarpą“, kuriame yra aktyvusis centras. Prie šio „tarpelio“ jungiasi heksosacharidas, o fermentas turi savo vietą kiekvienam iš šešių mureino cukrinių žiedų (A, B, C, D, E ir F) surišti (6.4 pav.).

Mureino molekulė yra laikoma aktyvioje lizocimo vietoje daugiausia dėl vandenilio ryšių ir hidrofobinės sąveikos. Netoli glikozidinės jungties hidrolizės vietos yra 2 aktyvaus centro aminorūgščių liekanos: glutamo rūgštis, užimanti 35 vietą polipeptide, ir asparto rūgštis, kuri yra 52 pozicijoje polipeptide (6.5 pav.). .

Šių likučių šoninės grandinės yra priešinguose „plyšio“ paviršiuose, arti užpultos glikozidinės jungties – maždaug 0,3 nm atstumu. Glutamato liekana yra nepolinėje aplinkoje ir nėra jonizuota, o aspartato liekana yra polinėje aplinkoje; jo karboksilo grupė yra deprotonuota ir dalyvauja kaip vandenilio akceptorius sudėtingame vandenilio jungčių tinkle.

Hidrolizės procesas atliekamas taip. Glu-35 liekanos protonuota karboksilo grupė suteikia savo protoną glikozidiniam deguonies atomui, dėl kurio nutrūksta ryšys tarp šio deguonies atomo ir cukraus žiedo C 1 atomo, esančio D vietoje (bendros rūgšties katalizės etapas). ). Dėl to susidaro produktas, apimantis E ir F regionuose esančius cukrinius žiedus, kurie gali išsiskirti iš komplekso su fermentu. D srityje esančio cukraus žiedo konformacija yra iškraipoma ir įgauna konformaciją puskėdės, kuriame penki iš šešių atomų, sudarančių cukraus žiedą, yra praktiškai toje pačioje plokštumoje. Ši struktūra atitinka pereinamosios būsenos konformaciją. Šiuo atveju C 1 atomas pasirodo esąs teigiamai įkrautas, o tarpinis produktas vadinamas karbonio jonu (karbokacija). Pereinamosios būsenos laisvoji energija mažėja, nes karbonio joną stabilizuoja Asp-52 liekanos deprotonuota karboksilo grupė (6.5 pav.).

Kitame etape vandens molekulė patenka į reakciją ir pakeičia disacharido likučius, difunduojančius iš aktyvaus centro srities. Vandens molekulės protonas patenka į Glu-35, o hidroksilo jonas (OH -) į karbonio jono C 1 atomą (bendros bazinės katalizės etapas). Dėl to antrasis suskilusio polisacharido fragmentas tampa reakcijos produktu (kėdės konformacija) ir palieka aktyvų centro sritį, o fermentas grįžta į pradinę būseną ir yra pasirengęs atlikti kitą disacharido skilimo reakciją (6.5 pav.). .