Virusų auginimas viščiukų embrionuose. Viščiukų embrionų auginimas Infekcija kraujagyslėse CAO

Dauguma žinomų virusų turi savybę daugintis vištienos embrione (4 pav.). Naudojami nuo 8 iki 14 dienų amžiaus embrionai, priklausomai nuo viruso tipo, užsikrėtimo būdo ir tyrimo tikslų. Gripo virusai išauginami per 9-10 dienų, skiepai nuo raupų – per 12 dienų, kiaulytės – 7 dienų vištų embrionuose. Viruso dauginimasis viščiukų embrionuose vyksta skirtingose ​​embriono dalyse, o tai lemia viruso tropizmo ypatybės. Viruso auginimo vištienos embrione technika plačiai naudojama pramoniniame auginime.

Vištienos embriono sandara ir užsikrėtimo būdai: 1 - į amnioną; 2 - į alantoinę ertmę; 3 - į trynio maišelį. (Mikrobiologija ir imunologija. Redagavo Vorobjovas A.A. – M. – 1999).

Tolimiausia neembrioninė membrana, esanti greta apvalkalo arba motinos audinių ir todėl tarnauja kaip mainų tarp embriono ir jo aplinkos vieta, vadinama Chorionas. Kiaušinius dedančioms rūšims pagrindinė choriono funkcija yra kvėpavimo dujų mainai. Žinduolių chorionas dalyvauja kvėpavime ir mityboje, medžiagų išskyrime, filtravime ir sintezėje. Primityviuose organizmuose chorionas yra antrinė membrana, o išsivysčiusiuose – vaisiaus membrana. Ertmė tarp choriono ir amniono yra chorioamniono ertmė.

Amnionas(graikiškai Amnion), amniono maišelis arba vandeninė membrana – viena iš embrioninių membranų roplių, paukščių ir žinduolių embrionuose.

Evoliuciškai amnionas atsirado siekiant apsaugoti embrionus nuo išdžiūvimo vystymosi metu už vandens aplinkos ribų. Todėl kiaušinius dedantys stuburiniai gyvūnai (ropliai ir paukščiai), taip pat žinduoliai, kilę iš roplių, priskiriami amnionams („Gyvūnai su kiaušinių membranomis“). Ankstesnės stuburinių gyvūnų klasės ir superklasės (galvagalviai, ciklostomos, žuvys, varliagyviai) deda kiaušinėlius vandens aplinkoje, todėl jiems nereikia vandens lukšto. Šios gyvūnų klasės yra sujungtos į anamnijos grupę. Priešingai nei anamnija, amnionams daugintis ir ankstyvam vystymuisi nereikalinga vandens aplinka, todėl amnionas prie vandens telkinių neprisiriša. Tai yra evoliucinis amniono vaidmuo.

Gimstant žinduoliams, plyšta vandens membrana, vanduo išteka, o amniono likučiai ant naujagimio kūno dažnai vadinami „marškiniais“, kurie nuo seno visur buvo sėkmės ir kitų prietarų ženklas. laikų (taigi, ypač rusų patarlė apie tuos, kurie „gimė marškiniais“).

Alantois (iš graikų allantoeid?s – dešros formos) – aukštesniųjų stuburinių gyvūnų embrioninis kvėpavimo organas; gemalo membrana, besivystanti iš užpakalinės embriono žarnos. Be to, alantoisas dalyvauja embriono dujų mainuose su aplinka ir skystų atliekų išleidimu. Alantoisas kartu su kitomis embrioninėmis membranomis – amnionu ir chorionu – yra būdingas aukštesniųjų stuburinių gyvūnų – žinduolių, paukščių ir roplių – požymis.

Kiaušialąsčių turinčių paukščių ir roplių alantoisas vystosi aplink embrioną išilgai kiauto sienelių. Išoriniame sluoksnyje, vadinamame mezoderma, jis sukuria platų kraujagyslių tinklą, per kurį sąveikauja su išorine aplinka. Žinduolių alantoisas yra virkštelės dalis.

Besivystantį vištienos embrioną galima užkrėsti keliais būdais: ant chorioalantojo membranos, alantojo ir amniono ertmėse, trynio maišelyje ir embriono kūne.

Chorioalantoinės membranos infekcija yra naudojama virusams, kurie ant membranų formuoja apnašas (vakcinos virusai, raupai, herpes simplex), išskirti ir kultivuoti. Prieš užsikrėtimą kiaušinėliai tiriami ovoskopu, pieštuku nubrėžiamos oro erdvės ir chorioalantoinės membranos ribos. Kiaušinio paviršius virš oro erdvės ir infekcijos vietoje nuvalomas spiritu, sudeginamas, apdorojamas jodu ir oro maišelio ertmėje padaroma skylė.

Infekcijos vietoje kevalas pašalinamas, kad nebūtų pažeista sublukštinė membrana, kuri vėliau perduriama trumpa sterilia adata, kad nebūtų pažeista chorioalantoinė membrana. Oras iš oro maišelio ertmės išsiurbiamas. Virusinė medžiaga (0,05–0,2 ml) tuberkulino švirkštu su trumpa adata arba Pasteur pipete uždedama ant chorioalantoinės membranos. Skylė apvalkale uždengiama steriliu dengiamuoju stiklu arba tuo pačiu išpjautu apvalkalo gabalu, o kraštai užpildomi išlydytu parafinu. Užkrėsti embrionai dedami horizontaliai ant stovo ir inkubuojami termostate. Embrionai išpjaustomi ne anksčiau kaip po 48 inkubavimo valandų. Ant užkrėstos membranos aptinkamos balkšvos nepermatomos įvairių formų dėmės (apnašos).

Infekcija alantojo ertmėje. Virusas, patekęs į alantoisą, dauginasi endoderminėse ląstelėse, tada patenka į alantoidinį skystį. Infekcija atliekama tokiu būdu: virš oro kameros esančiame apvalkale skalpelio ar žirklių galiuku padaroma punkcija, po to per skylę vertikalia kryptimi įkišama adata su švirkštu, kuri praeina per chorioalantoinės membranos ir patenka į alantoinę ertmę, medžiaga suleidžiama 0,1 ml tūrio ir skylė užpildoma parafinu.

Infekcija trynio maišelyje. Tam naudojami 5–10 dienų amžiaus embrionai. Dažniausi yra du infekcijos būdai. Pagal pirmąjį, medžiaga įvedama per oro erdvę. Kiaušinio centre padaroma skylutė, ji statoma ant stovo buku galu į dešinę, o per skylutę vertikalia kryptimi įkišama prie švirkšto pritvirtinta adata, adata pereina per chorioalantoinę membraną, alantoinę ertmę į trynį. Į trynio maišelį galima suleisti nuo 0,1 iki 0,5 ml viruso turinčios medžiagos. Po užsikrėtimo kiaute esanti skylė užpildoma parafinu, o embrionas dedamas į termostatą. Pagal antrąjį metodą, prie oro erdvės ribos toje pusėje, kurioje guli trynys (pusė, priešinga embrionui), lukšte padaroma punkcija, per kurią įvedama infekcinė medžiaga. Adata turi būti nukreipta į kiaušinio centrą.

Virusine medžiaga užkrėstas vištienos embrionas dedamas į inkubatorių 2-3 dienoms, priklausomai nuo įnešto viruso pobūdžio. Virusams vystytis iš paciento paimtų mėginių (pavyzdžiui, nosiaryklės tepinėlių, naudojamų gripui diagnozuoti), vištienos embrionas sudaro gerą aplinką. Pagal pakitimų tipą, tarkime, chorioalantoinės membranos audiniuose, galime tiesiogiai nustatyti, su kokiu virusu susiduriame. Raupų ​​ir herpeso virusai sukelia labai būdingus pokyčius. Kai kurie virusai labai intensyviai dauginasi įvairiuose viščiuko embriono audiniuose ir yra pradinė medžiaga virusinių antigenų, reikalingų laboratorinei virusinių ligų diagnostikai, gamybai. Virusai, padauginti viščiukų embrionuose, buvo naudojami kaip pradinė medžiaga aštuoniolikai tipų vakcinų vakcinoms gaminti.

Nepaisant teigiamų ląstelių kultūrų aspektų, kurie taip plačiai paplito šiuolaikinėse virusologijos laboratorijose, vištienos embrionas daugeliu atvejų išlaikė savo pirmenybę ir toliau tarnauja kaip klasikinė medžiaga darbui. Viruso buvimą vištienos embrione rodo embriono mirtis, teigiama hemagliutinacijos reakcija ant stiklo su alantoiniu arba amniono skysčiu, židininių pažeidimų („apnašų“) susidarymas ant choriono-alantojo membranos, taip pat RHA.

Daugelis virusų, užkrečiančių žmones ir gyvūnus, gali didesniu ar mažesniu mastu daugintis viščiuko embrione. Tankaus apvalkalo buvimas apsaugo embrioną nuo mikroorganizmų nuo išorinės aplinkos.

Virusų auginimo vištų embrionuose metodas naudojamas laboratorinei virusinių infekcijų diagnostikai, taip pat virusinių vakcinų ir diagnostinių vaistų gamybai. Tačiau šis metodas turi trūkumų: 1) neįmanoma dinamikoje stebėti patologinių pokyčių, atsirandančių embrione užsikrėtus virusu; 2) atidarant virusu užkrėstą embrioną, dažnai neaptinkama jokių matomų pakitimų ir būtina kitais virusologiniais metodais nustatyti viruso buvimą embriono audiniuose ir skysčiuose (pavyzdžiui, hemagliutinacijos reakcija); 3) auginimo būdas vištų embrionuose netinka visiems virusams. Nepaisant esamų trūkumų, metodas yra gana paprastas, patogus ir pigus bei plačiai naudojamas virusologiniuose tyrimuose. Tai svarbiausia dirbant su ortomiksovirusais, herpesvirusais, raupų virusais.

1.3.1. Vištienos embriono struktūra

Vištienos embrionas yra padengtas kalkingu kiautu – kiautu, prie kurio iš vidaus greta lukšto membrana. Bukajame kiaušinio gale jis išsišakoja ir turi oro tarpą. Po lukšto membrana yra chorioalantoinė membrana, bukas kiaušinio galas eina išilgai vidinės lukšto membranos pusės, uždarydamas oro tarpą; šioje membranoje gausu kraujagyslių ir ji tarnauja kaip embriono kvėpavimo organas. Šalia jo iš vidaus yra alantoidinė ertmė, kuri yra šalinimo organas ir apsaugo embrioną nuo išsausėjimo ir sužeidimų. Alantoidinė ertmė supa amniono ertmėje esantį embrioną, kuris pripildytas vaisiaus vandenų. Per trynio virvelę embrionas yra prijungtas prie trynio maišelio, pagrindinio maistinių medžiagų šaltinio.

Norint sėkmingai auginti virusus besivystančių viščiukų embrionų organizme, reikalingas tam tikras temperatūros režimas (36 0 -38 0), drėgmė (50-70%), taip pat pakankama ventiliacija. Tam tikro amžiaus vištų embrionai yra užkrėsti, inkubuojami 6–13 dienų, priklausomai nuo viruso tipo ir užsikrėtimo būdo. Būtina paruošti: kiaušinių stovą, alkoholio ir jodo buteliukus, mėgintuvėlį su steriliu parafinu, dangtelius, sterilios vatos ir marlės maišelius, sterilius indelius, suvyniotus į popierių, sterilius švirkštus, adatas, pincetus, skrodimo adatas. Instrumentai dedami į spirito stiklinę, kur išlieka viso darbo metu, prieš kiekvieną manipuliavimą papildomai sterilizuojami kūrenant degiklio liepsnoje. Prieš darbą kruopščiai nusiplaunamos rankos, rekomenduojama dėvėti marlės kaukę.

Gyvybingi embrionai darbui atrenkami tiriant inkubuotus kiaušinėlius ovoskopu. Gyvybingas embrionas yra mobilus, membranos kraujagyslės užpildytos krauju. Atrinkti kiaušiniai buku galu (arba kiaušinio šone) kruopščiai dezinfekuojami: lukštas nuvalomas spiritu, sutepamas jodu, pakartotinai apdorojamas spiritu ir išdeginamas.

1.3.2. Viščiuko embriono infekcija ant chorioalantoinės membranos

Infekcijai naudojami 10–12 dienų amžiaus vištų embrionai. Pagrindiniai infekcijos etapai:

1. Kiaušinis statomas ant stovo vertikalioje padėtyje, kad oro pagalvė būtų viršuje, o lukštas sterilizuojamas ties buku kiaušinio galu.

2. Virš oro maišelio centro, naudojant išpjaustymo adatą, perduriama apvalkalo punkcija.

3. Į susidariusią skylutę įkišamas žirklių žandikaulis ir korpuse išpjaunamas apie 1,5 cm skersmens langelis.

4. Pro skylutę adata atsargiai perplėškite vidinį lukšto lapą ir nedideliame plotelyje (0,5-1 cm 2) nulupkite.

5. Chorialantoinė membrana užkrečiama Pasteur pipete ar švirkštu užtepus ant jos 0,1-0,2 ml viruso turinčios medžiagos.

6. Langelis korpuse uždengiamas specialia elastine plėvele arba steriliu dengiamuoju stiklu ir tvirtinamas išlydytu parafinu.

Užkrėsti embrionai dedami į termostatą vertikalioje padėtyje ir inkubuojami 2-3 dienas, po to atliekama skrodimas pagal šias taisykles:

1. Kiaušinis dedamas ant stovo taip, kad oro erdvė būtų viršuje, o atsidarymo vieta sterilizuojama.

2. Steriliomis žirklėmis nupjaukite apvalkalą išilgai oro erdvės ribos.

3. Pincetu nuimkite apvalkalą išilgai krašto. Atidengta chorioalantoinė membrana apipjaustyta išilgai apvalkalo krašto. Per susidariusią skylutę supilkite visą kiaušinio turinį į puodelį ar padėklą.

4. Korioalantoinė membrana, likusi lukšto viduje, atsargiai pašalinama pincetu ir dedama į sterilų puodelį su druskos tirpalu. Čia jie jį ištiesina ir tiria pokyčius, padėdami puodelį tamsiame fone.

Norint gauti medžiagą, kurioje yra viruso iš chorioalantoinės membranos, ją reikia susmulkinti žirklėmis ir sumalti kvarcinio stiklo skiedinyje, pridedant druskos tirpalo. Gauta suspensija centrifuguojama 2000 aps./min. greičiu 10-15 minučių, o supernatantas naudojamas kaip viruso turinti medžiaga.

Ryžiai. 3. Viščiukų embrionų infekcija

1.3.3. Infekcija alantojo ertmėje

Infekcijai imami 10-11 dienų embrionai. Pagrindiniai infekcijos etapai:

1. Kiaušinis pastatomas ant stovo buku galu į viršų, o lukštas sterilizuojamas virš oro erdvės.

2. Buko galo centre, naudojant pjaustymo adatą, atliekama apvalkalo punkcija.

3. Į skylę įkišama švirkšto, kuriame yra viruso skiedimo, adata. Adata judama vertikalia kryptimi 2–3 mm žemiau oro maišelio lygio ir tada suleidžiama 0,1–0,2 ml medžiagos.

4. Skylė apvalkale užsandarinama ištirpintu steriliu parafinu.

Užkrėsti embrionai paprastai laikomi termostate 2 dienas. Prieš atidarant kiaušinius dedama į šaldytuvą nakčiai 4 0 C temperatūroje. Atidaroma tokia tvarka:

1. Kiaušinis dedamas ant stovo taip, kad oro pagalvė būtų viršuje, lukštas virš jo sterilizuojamas.

2. Žirklėmis lukštas nupjaunamas šiek tiek aukščiau oro erdvės ribos.

3. Pincetu atsargiai nuimkite lukšto membraną, po to toje vietoje, kur nėra kraujagyslių, Pasteur pipete perveriama chorioalantoinė membrana ir įsiurbiamas alantoinis skystis.

4. Alantoinis skystis perpilamas į sterilų mėgintuvėlį, o dalis jo pasėjama į sultinį, siekiant ištirti bakteriologinį sterilumą.

Embrionai naudojami nuo 8 iki 14 dienų, priklausomai nuo viruso tipo ir užsikrėtimo būdo. Dauginimasis viščiukų embrionuose vyksta skirtingose ​​embriono dalyse.Užsikrėtimo būdai: ant chorioalantoinės membranos, alotoninėje ir amniono membranoje, trynio maišelyje, embriono kūne.

29.Audinių kultūros.

Priklausomai nuo paruošimo technikos, yra 3 tipų ląstelės:

Vieno sluoksnio stiklas gali daugintis ant chemiškai neutralaus stiklo paviršiaus vienasluoksnio pavidalo;

Suspensija, pasklinda per visą maistinės terpės tūrį;

Organai – tai ištisi organų ir audinių gabalai, išlaikantys savo pradinę struktūrą.

Pirminės ląstelių kultūros paruošimas susideda iš kelių etapų: audinio šlifavimas, ląstelių atskyrimas ir gautos suspensijos plovimas iš tripsino.

Indikacija:

- citopatinis poveikis – morfologiniai ląstelių pokyčiai, matomi pro mikroskopą, iki atmetimo iš stiklo.

Virusiniai intarpai – tai viruso dalelių sankaupa arba viruso komponentų atskyrimas ląstelių citoplazmoje arba branduolyje.

Plokštelės yra ribotos sritys, susidedančios iš degeneracinių ląstelių. Jie matomi kaip šviesios dėmės spalvotų ląstelių fone.

Spalvos testas

Hemadsorbcija yra ląstelių kultūrų gebėjimas adsorbuoti raudonuosius kraujo kūnelius ant jų paviršiaus.

Trukdymas.

30. Bakteriofagų klasifikacija, cheminė sudėtis.

Bakteriofagai yra bakteriniai virusai, kurie gali prasiskverbti į bakterijų ląsteles ir sukelti jų ištirpimą. Jie yra buožgalvio formos, kai kurie panašūs į kubinius siūlus. Jie susideda iš ikosaedrinės galvos ir uodegos. Kaudalinio ataugos viduje yra cilindrinis strypas, išorėje – apvalkalas, procesas baigiasi šešiakampe bazine plokštele su trumpais spygliais. Fagai susideda iš nukleino rūgšties ir baltymų. Spermatozoidų formos faguose dvigrandė DNR yra sandariai supakuota į spiralę galvos viduje. Baltymai yra apvalkalo dalis. Be struktūrinių baltymų, buvo atrasti vidiniai baltymai, susiję su nukleino rūgštimi, ir fermentų baltymai, dalyvaujantys fago sąveikoje su ląstele.

31. Virulentiškų fagų ir jiems jautrios bakterinės ląstelės sąveikos procesas

Virulentiškų fagų skaičius gali padidėti tik per lizės ciklą. Virulentiško bakteriofago ir ląstelės sąveikos procesas susideda iš kelių etapų: bakteriofago adsorbcijos ant ląstelės, įsiskverbimo į ląstelę, fago komponentų biosintezės ir jų surinkimo bei bakteriofagų išskyrimo iš ląstelės.

Iš pradžių bakteriofagai prisijungia prie fagui specifinių receptorių bakterinės ląstelės paviršiuje. Fago uodega, padedama jos gale esančių fermentų (daugiausia lizocimo), lokaliai ištirpdo ląstelės membraną, susitraukia ir galvoje esanti DNR įšvirkščiama į ląstelę, o bakteriofago baltyminis apvalkalas lieka lauke. Suleista DNR sukelia visišką ląstelės metabolizmo restruktūrizavimą: sustoja bakterijų DNR, RNR ir baltymų sintezė. Bakteriofago DNR pradedama transkribuoti naudojant savo paties transkriptazės fermentą, kuris aktyvuojamas patekus į bakterijos ląstelę. Pirmiausia sintezuojamos ankstyvosios, o vėliau vėlyvosios iRNR, kurios patenka į šeimininko ląstelės ribosomas, kur sintetinami ankstyvieji (DNR polimerazės, nukleazės) ir vėlyvieji (kapsidės ir uodegos baltymai, fermentai lizocimas, ATPazė ir transkriptazė) bakteriofagų baltymai. Bakteriofago DNR replikacija vyksta pagal pusiau konservatyvų mechanizmą ir atliekama dalyvaujant savo DNR polimerazėms. Po vėlyvųjų baltymų sintezės ir DNR replikacijos pabaigos prasideda galutinis procesas – fago dalelių brendimas arba fago DNR susijungimas su apvalkalo baltymu ir subrendusių infekcinių fago dalelių susidarymas.

Chorioalantoinės membranos infekcija.Šis metodas yra vienas iš dažniausiai naudojamų. Pagrindinis jo privalumas yra tas, kad daugybė virusų, besidaugindami ant chorioalantoinės membranos, sukelia jai būdingus pokyčius, formuodami pažeidimus balkšvų įvairios morfologijos dėmių-apnašų pavidalu.

Infekcijai naudojami 10–12 dienų amžiaus embrionai. Paprastai į chorioalantoinę membraną prasiskverbia padarius skylę lukšte virš oro maišelio arba kiaušinio šone.

Pagrindiniai chorioalantoinės membranos infekcijos iš oro erdvės etapai:

1. Kiaušinis dedamas ant stovo vertikalioje padėtyje
kad oro pagalvė būtų viršuje)“; atlikite
kruopštus lukšto sterilizavimas buku kiaušinio gale.

2. Korpusas pradurtas virš oro maišelio centro.
naudojant pjaustymo adatą.

3. Į gautą angą įkišamas žirklių žandikaulis ir
korpuse išpjaukite maždaug 1,5 cm skersmens langą. (kur
Neleiskite lukšto gabalėlių patekti į kiaušinio vidų).

4. Pro padarytą skylutę matosi vidinis lapas
apvalkalo membrana, ji atsargiai suplėšoma akimi
pincetu arba adata ir nulupkite nedideliame plote (0,5-1
cm 2), atidengdama chorioalantoinę membraną.

5. Infekuoja chorioalantoinę membraną
užtepus 0,1-0,2 ml virusų turinčios medžiagos
(pavyzdžiui, vakcinos virusas), naudojant Pasteur pipetę
arba švirkštą.

6. Langas korpuse uždaromas specialia tampria
plėvelė, sterilus dangtelis arba stiklas
dangtelis. Stiklo ir dangtelio tvirtinimui prie korpuso
naudoti išlydytą parafiną.

Užkrėsti embrionai dedami į termostatą vertikalioje padėtyje ir inkubuojami 2-3 dienas, po to atliekama skrodimas pagal šias taisykles:

1. Kiaušinis dedamas ant stovo, kad oras
vieta buvo viršuje, vieta sterilizuojama
būsimas atidarymas tinkamai apdorojant
alkoholis ir jodas.

2. Nuėmę plėvelę, dengiamąjį stiklelį ar dangtelį,
Steriliomis žirklėmis nupjaukite apvalkalą išilgai oro ribos
erdvė.

3. Pincetu nuimkite apvalkalą.
Atidengta chorioalantoinė membrana (kuri gali
būti matomų pakitimų) apkarpyti išilgai apvalkalo krašto. Per
susidariusią skylutę supilkite į puodelį visą kiaušinio turinį
arba padėklas.

4. Kiauto viduje likęs chorioalantinis audinys
lukštas atsargiai nuimamas pincetu ir įdedamas
sterilus puodelis su druskos tirpalu. Štai jis
ištiesinkite ir ištirkite pokyčius, padėdami puodelį ant tamsaus
fone.

Norint gauti medžiagą, kurioje yra viruso iš chorioalantoinės membranos, ją reikia susmulkinti žirklėmis ir sumalti kvarcinio stiklo skiedinyje, pridedant druskos tirpalo. Gauta suspensija centrifuguojama 2000 aps./min. greičiu 10-15 minučių ir supernatantas naudojamas! kaip virusų turinčią medžiagą (būtina atlikti privalomus tyrimus, ar nėra užteršimo bakterijomis).

Infekcija alantojo ertmėje.Šis metodas

Jis išsiskiria savo paprastumu ir yra vertingas, nes prisideda prie didelio viruso kaupimosi. Infekcijai dažniausiai imami 10 dienų embrionai. Pagrindiniai alantojos ertmės infekcijos etapai:

}. Kiaušinis dedamas ant stovo buku galu į viršų, o lukštas sterilizuojamas virš oro erdvės.

2. Buko galo centre daroma punkcija apvalkale su
naudojant pjaustymo adatą.

3. Į angą įkišama švirkšto su skiedimu adata
virusas (pvz., gripo virusas). Adata yra pažengusi į
vertikali kryptis 2-3 mm žemiau oro lygio
maišelį ir tada įšvirkškite OD-0,2 ml medžiagos.

4. Skylė korpuse užsandarinama naudojant
ištirpęs sterilus parafinas.

Užkrėsti embrionai paprastai laikomi termostate 2 dienas. Prieš atidarant, kiaušiniai dedami į šaldytuvą nakčiai 4° temperatūroje. Atidarymas atliekamas tokia tvarka:

1. Kiaušinis dedamas ant stovo taip, kad oro pagalvė būtų viršuje, lukštas virš jo sterilizuojamas;

2. Žirklėmis nupjaukite lukštą kiek aukščiau
oro erdvės ribos.

3. Atsargiai pincetu nuimkite apvalkalo apvalkalą, tada
kodėl chorioalantoinė membrana pradurta Pasteru
pipete toje vietoje, kur nėra kraujagyslių, ir čiulpti alantoidą
skysčio (galite surinkti 5-6 ml).

4. Alantoic skystis perpilamas į sterilų
mėgintuvėlyje, o dalis pasėjama į sultinį, kad būtų patikrinta
bakteriologinis sterilumas.

Alantoinės ertmės infekcijos metodas dažnai naudojamas gripo virusui, taip pat kiaulytėms ir vakcinijoms kultivuoti.

Infekcija amniono ertmėje

Šį metodą atlikti sunkiau ir jis naudojamas šiek tiek rečiau nei ankstesni. Jo ypatumas tas, kad užsikrėtę kai kuriais pneumotropiniais virusais (pavyzdžiui, gripo virusais, kiaulytės), pastarieji dauginasi ne tik amniono membranos ląstelėse, bet ir embriono kvėpavimo takuose bei plaučių audinyje, kur patenka infekuotas skystis. prasiskverbia. Infekcijai naudojami 7-12 dienų amžiaus embrionai. Infekcija į amniono ertmę atliekama atviruoju metodu, kai apvalkale padaroma santykinai didelė skylė medžiagai įterpti, arba uždaruoju būdu, kai užkrečiama per kiautą.

Pirmasis iš jų yra labiau trauminis, antrasis yra mažiau patikimas, nes, veikiant aklai, ne visada įmanoma įdurti adatą į amniono ertmę.

Atviros infekcijos technika:

1. Kiaušinis dedamas ant stovo ir sterilizuojamas
apvalkalas buko galo srityje.

2. Virš oro erdvės centro korpuse
Naudodami žirkles, išpjaukite 2 cm skersmens langą (kaip
dėl chorioalantoinės membranos infekcijos).

3. Atsargiai nuimkite vidinį lukšto lapą
membrana naudojant pincetą, atidengdama apatinę dalį
chorioalantoinė membrana.

Naudodami žirkles išpjaukite nedidelę skylę
chorioalantoinė membrana toje vietoje, kur nėra kraujagyslių, o į pjūvį įkišamas akių pincetas. Pincetu suimama amniono membrana ir amniono maišelis ištraukiamas per chorioalantoinės membranos paviršių.

5. Laikydami amniono membraną tokioje padėtyje,
užkrėsti amniono ertmę, švirkščiant 0,1-
0,2 ml viruso skiedimo.

6. Skylė korpuse uždaroma steriliu dangteliu.
arba padengti stiklą, naudojant juos pritvirtinti ir
kiaušinio sandarinimas išlydytu parafinu.

Užkrėsti embrionai inkubuojami 2 paras, negyvi per pirmąją parą išmetami (stebėjimai atliekami pro langą kiaute). Atidarius, embrionai per naktį laikomi šaldytuve 4°C temperatūroje.

Embriono atidarymo būdas užsikrėtus amniono ertmėje:

1. Sterilizavę būsimo skrodimo vietą, ją nupjaukite
apvalkalas šiek tiek virš oro maišelio krašto.

2. Prakirsta chorioalantoinė membrana
pasteur pipete ir pašalinkite alantojo skystį.

3. Paėmus pincetu už vaisiaus vandenų maišelio, pradurti
jo membrana su švirkšto adata arba Pasteur pipete ir
įsiurbiama amnestinio skysčio (nuo 0,5 iki 1,5 ml). U
užkrėstas embrionas, tuo tarpu skystis turi būti drumstas
kaip ir normalus embrionas yra skaidrus.

4. Paimtas skystis perpilamas į sterilų mėgintuvėlį, 0,1-
0,3 ml jo pasėjama į sultinį bakteriologinei kontrolei
sterilumas.

Virusologijos raidai didelę reikšmę turėjo virusų auginimo viščiukų embrionuose metodų įdiegimas. Viruso dauginimuisi naudojami 7-12 dienų amžiaus viščiukų embrionai, inkubuojami termostate 37 C temperatūroje. Būtina sąlyga tinkamam embriono vystymuisi yra tam tikros oro drėgmės palaikymas, kurį galima sukurti dedant indas su vandeniu termostate. Virusų auginimas viščiukų embrionuose atliekamas skirtingose ​​užkrėsto embriono vietose:

1) ant choriono-alantoinės membranos;

2) į alantojo ertmę;

3) į vaisiaus vandenų ertmę;

4) į trynio maišelį.

Viščiukų embrionai užkrėsti steriliais instrumentais dėžėje. Prieš: infekciją, vištienos embrionai du kartus nušluostomi alkoholiu sudrėkintu vatos tamponu.

Choriono-alantoinės membranos infekcija. Dezinfekavus kiaušinį, atsargiai nupjaukite lukšto gabalėlį nuo buko galo, nuimkite polukštinę plėvelę – taip atsiskleidžia chorioninė-alatioinė membrana. 0,1–0,2 ml infekcinės medžiagos švirkštu arba Pasteur pipete uždedama ant choriono-alantojo membranos. Užsikrėtus, skylė uždaroma dangteliu, o tarpas tarp jos ir vištienos embriono užpildomas parafinu. Kitoje kiaušinio pusėje paprastu pieštuku užrašykite infekcinės medžiagos pavadinimą ir užsikrėtimo datą.

Infekcija amniono ertmėje. Kiaušinis yra ovoskopinis, o šoninėje pusėje parenkama sritis, kurioje chorionas-alantoisas neturi didelių kraujagyslių. Ši sritis pažymėta pieštuku. Kiaušiniai dedami ant stovo horizontalioje padėtyje, dezinfekuojami ir specialia sterilia ietimi praduriama skylutė. Ir apvalkalas iki 2-3 mm gylio, per kurį adata su infekcine medžiaga tuo pačiu atstumu tiesiai į amniono ertmę. Kad suleistas skystis netekėtų atgal, pirmiausia virš oro maišelio padaroma punkcija. Po to abi skylės užpildomos parafinu.

Infekcija alantojo ertmėje. Infekcija taip pat atliekama tamsesnėje dėžutėje. Oro tarpas pažymimas, virš oro tarpo esantis apvalkalas dezinfekuojamas ir švirkšto adata su medžiaga įkišama pro kiaute esančią skylutę link embriono. Jei adata patenka į alantoinę ertmę, pastebimas embriono šešėlio poslinkis. Po užsikrėtimo skylė užpildoma parafinu.

Infekcija trynio maišelyje. Korpusas dezinfekuojamas. Kiaušinis dedamas ant stovo buku galu į dešinę taip, kad trynio žymė būtų nukreipta į viršų. Virš oro kameros centre pradurta skylė. Švirkšto adata įkišama per skylę apvalkale horizontalia kryptimi iki 2-3 mm gylio, kuri patenka į trynio maišelį. Medžiaga įvedama 0,2-0,3 ml tūrio. Įvedus medžiagą, skylė vaškuojama.

Temperatūra ir inkubacijos trukmė priklauso nuo viruso biologinių savybių. Užkrėsti kiaušinėliai tikrinami kasdien ir ovoskopuojami, kad būtų patikrintas embriono gyvybingumas. Jei embrionai miršta pirmą dieną, priežastis dažniausiai yra traumos infekcijos metu. Tokie kiaušiniai išperi iš patirties. Viruso buvimą užkrėstame embrione lemia būdingi užkrėsto viščiuko embriono choriono-alantojo membranos pokyčiai. Virusai, kurie neturi hemagpotinuojančio aktyvumo, aptinkami naudojant RSC. Norint aptikti virusą užkrėstų embrionų alantoiniame arba amniono skystyje, atliekama RGA.