با استفاده از HPLC و مویرگی. مطالعه فارماکوکینتیک و فراهمی زیستی - مجله فارماکوکینتیک و فارماکودینامیک کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا

به عنوان نسخه خطی

ملیکوف ایگور اولگوویچ

توسعه روش های میکرو برای آنالیز اسیدهای آمینه،

پپتیدهای کوتاه و الیگونوکلئوتیدها

با استفاده از RP HPLC و مویرگ

الکتروفورز

تخصص: 02.00.02 – شیمی تجزیه

پایان نامه برای درجه کاندیدای علوم شیمی

مسکو 2006 کار پایان نامه در گروه شیمی تحلیلی آکادمی ایالتی مسکو فناوری شیمیایی زیبا به نام به پایان رسید.

M.V. لومونوسوف و در گروه شیمی پروتئین تحلیلی مؤسسه شیمی بیورگانیک به نام. دانشگاهیان M.M. Shemyakin و Yu.A. اوچینیکوف RAS.

مدیر علمی:

کاندیدای علوم شیمی، دانشیار گلوبوکوف یوری میخایلوویچ

مخالفان رسمی:

دکترای علوم شیمی، پروفسور ماکاروف نیکولای واسیلیویچ کاندیدای علوم شیمی کیریلووا یولیا گنادیونا

سازمان پیشرو:

موسسه فیزیک بیوشیمیایی به نام. N.M. امانوئل RAS

دفاع در 20 دسامبر 2006 در ساعت 12:00 در جلسه شورای پایان نامه D 212.120.05 در آکادمی ایالتی مسکو فناوری شیمیایی خوب به نام انجام می شود. M.V. لومونوسوف در آدرس: 119571، مسکو، خیابان Vernadsky، 86، اتاق. M-119.

این پایان نامه را می توان در کتابخانه آکادمی ایالتی مسکو فناوری های شیمیایی زیبا به نام آن یافت. M.V. لومونوسوف

دبیر علمی شورای پایان نامه، کاندیدای علوم شیمی یو.آ. افیمووا ارتباطکار کردن در حال حاضر، تحقیقات بالینی به طور فزاینده ای بر استفاده از روش های ریز تحلیل ابزاری برای تشخیص شایع ترین و خطرناک ترین بیماری های مهم اجتماعی متمرکز شده است. بخش قابل توجهی از این روش ها به طور کامل و همیشه تشخیص به موقع و با کیفیت بالا را ارائه نمی دهند، که اغلب الزامات مدرن برای نظارت بر وضعیت بیوشیمیایی یک فرد را برآورده نمی کند.

اسیدهای آمینه آزاد و پپتیدهای کوتاه که بخشی از مایعات فیزیولوژیکی هستند، اهمیت عملکردی مهمی دارند. در برخی موارد، آنها می توانند به عنوان نشانگرهای مولکولی بیماری های خاص عمل کنند.

تغییر در غلظت آنها اغلب با اختلالات متابولیک همراه است که نشان دهنده ایجاد یک بیماری خاص است. اکثر روش های موجود برای آنالیز اسیدهای آمینه یا به اندازه کافی حساس و انتخابی برای شناسایی آنها نیستند یا نیاز به مشتق سازی اسیدهای آمینه دارند که به طور قابل توجهی فرآیند تعیین آنها را پیچیده می کند. مشکل تجزیه و تحلیل ساده و مقرون به صرفه آمینو اسیدهای رمزگذاری شده ژنتیکی آزاد هنوز به طور کامل حل نشده است. در عین حال، تجزیه و تحلیل بالینی اسیدهای آمینه نیاز به اصلاح قبل یا بعد از ستون آنها برای تعیین بسیار حساس و انتخابی دارد. تغییرات در محتوای نشانگرهای مولکولی در مایعات فیزیولوژیکی نیز ممکن است با استعداد ژنتیکی بیمار به یک بیماری خاص مرتبط باشد. از این رو نیاز به انجام تجزیه و تحلیل مقایسه ای از قطعات DNA به منظور افزایش قابلیت اطمینان در تعیین علت بیماری مورد مطالعه و موثرتر درمان آن است.

در همین حال، تجهیزات وارداتی لازم برای تجزیه و تحلیل اسید آمینه و نوکلئوتید، به عنوان یک قاعده، گران است و برای اکثر آزمایشگاه های بالینی غیرقابل دسترسی است. این وضعیت با این واقعیت تشدید می‌شود که بسیاری از دستگاه‌ها برای هر نوع بیماری بسیار تخصصی هستند، در نتیجه روش‌های تشخیصی چندگانه هم در تجهیزات و هم در روش‌شناسی تکرار می‌شود.

این به شدت هزینه مطالعات بالینی را افزایش می دهد و مقایسه را پیچیده می کند.نویسنده از رئیس گروه شیمی پروتئین تحلیلی در موسسه شیمی بیورگانیک آکادمی علوم روسیه، محقق ارشد، کاندیدای علوم شیمی تشکر می کند. I.V. نازیموف برای کمک مداوم، توجه و بحث در مورد نتایج.

تفسیر نتایج تحلیل به دست آمده بنابراین، توسعه روش‌های جدیدی که امکان استفاده از تجهیزات تحلیلی در دسترس عموم را برای تولید داخلی برای تعیین بسیار حساس، سریع و قابل اعتماد اسیدهای آمینه آزاد و اصلاح‌شده، پپتیدهای کوتاه و الیگونوکلئوتیدها برای آنالیز ساختاری پلیمرهای زیستی و قطعات آنها گسترش می‌دهد. و برای اهداف تشخیصی بالینی یک کار علمی فوری است.

هدف کار. هدفکار پایان نامه توسعه مجموعه ای از ریزروش های بسیار حساس ابزاری برای تجزیه و تحلیل اسیدهای آمینه آزاد و اصلاح شده، پپتیدهای کوتاه و الیگونوکلئوتیدها با استفاده از پایه ابزاری داخلی است.

تازگی علمی.

1. روش هایی برای تعیین اسیدهای آمینه آلفا رمزگذاری شده ژنتیکی اصلاح نشده با استفاده از الکتروفورز ناحیه مویرگی و کروماتوگرافی الکتروکینتیک میسلی با روش های آشکارسازی فتومتریک مستقیم UV و انکسار سنجی توسعه داده شده است.

2. روش‌هایی برای تعیین مشترک آمینوتیول‌های مولکولی کم در پلاسمای خون با استفاده از کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا فاز معکوس و الکتروفورز ناحیه مویرگی با روش‌های تشخیص فتومتریک fluorimetric و مستقیم UV توسعه یافته و در عمل بالینی به کار گرفته شده‌اند.

3. روشی برای تعیین قطعات ژن جهش یافته برای ترومبوز وریدی بر اساس تجزیه و تحلیل محصولات واکنش زنجیره ای پلیمراز خاص آلل با استفاده از الکتروفورز ژل مویرگی با تشخیص فلورمتری ایجاد شده است.

اهمیت عملی . روش توسعه یافته تجزیه و تحلیل اسید آمینه امکان تعیین مقادیر ریز آمینو اسیدهای رمزگذاری شده ژنتیکی را بدون مشتق سازی اولیه آنها ممکن می سازد، که به طور قابل توجهی طرح تجزیه و تحلیل موجود را ساده می کند. مجموعه ای از روش ها برای تجزیه و تحلیل نشانگرهای مولکولی حوادث عروقی (هوموسیستئین، سیستئین، گلوتاتیون)، و همچنین قطعات ژن جهش یافته برای ترومبوز وریدی، توسعه یافته و برای استفاده عملی پیشنهاد شده است. در نتیجه کار انجام شده، امکان استفاده مؤثر از تجهیزات خانگی برای تجزیه و تحلیل بیوشیمیایی هر دو پروتئین و اجزای هسته ای در یک دستگاه برای الکتروفورز مویرگی امکان پذیر شد. تعیین اسیدهای آمینه و پپتیدهای حاوی گوگرد در پلاسمای خون با استفاده از روش توسعه‌یافته در این کار برای ارزیابی ریسک فاکتور ده‌ها بیمار با شرایط قابل اطمینان انفارکتوس و پیش از انفارکتوس مورد استفاده قرار گرفت. نتایج کار انجام شده در ایجاد و آزمایش در عمل تجزیه و تحلیل زیست‌پزشکی یک مجموعه خودکار جهانی و اقتصادی از ابزارها و روش‌های تشخیص مولکولی برخی از بیماری‌های مهم اجتماعی (حمله قلبی، سکته مغزی، ترومبوز)، توسعه‌یافته در موسسه ابزارهای تحلیلی آکادمی علوم روسیه.

برای دفاع ارسال شد:

روش های تعیین آمینو اسیدهای کدگذاری شده ژنتیکی در محلول آبی بدون مشتق سازی اولیه آنها با استفاده از الکتروفورز ناحیه مویرگی و کروماتوگرافی الکتروکینتیک میسلی.

شرایط بهینه برای مشتق‌سازی آمینوتیول‌های پلاسما با وزن مولکولی کم با استفاده از معرف‌های فلوروژنیک (مونوبروموبیمان و 5-iodoacetamidofluorescein).

روش برای آنالیز آمینوتیول های با وزن مولکولی کم در پلاسمای خون با استفاده از RP HPLC و الکتروفورز مویرگی.

نتایج تعیین محتوای هموسیستئین در پلاسمای خون به روش RP HPLC و الکتروفورز ناحیه مویرگی.

روشی برای تعیین ژن جهش یافته برای ترومبوز وریدی با استفاده از الکتروفورز ژل مویرگی در پلی-N، N'dimethylacrylamide خطی.

تایید کار. نتایج اصلیآثار در هشتمین سمپوزیوم روسی کروماتوگرافی مایع مولکولی و الکتروفورز مویرگی (15 تا 19 اکتبر 2001، مسکو، روسیه)، سومین سمپوزیوم بین‌المللی روش‌های جداسازی در علوم زیستی (13 تا 18 مه، 20، مسکو، روسیه) ارائه شد. ، )، کنفرانس بین المللی دانشجویان کارشناسی و کارشناسی ارشد در علوم پایه "Lomonosov-2005" (بخش شیمی. 12-15 آوریل 2005، مسکو، روسیه)، دومین کنفرانس علمی و عملی "مشکلات فعلی بیوتکنولوژی پزشکی" (12 سپتامبر) -14 2005، آناپا، روسیه)، سومین کنگره انجمن بیوتکنولوژیست های روسیه به نام. یو.آ. Ovchinnikov (25-27 اکتبر 2005، مسکو، روسیه)، اولین کنفرانس دانشمندان جوان در MITHT. M.V. لومونوسوف (13-14 اکتبر 2005، مسکو، روسیه)، کنگره بین المللی علوم تحلیلی ICAS-2006 (25-30 ژوئن 2006، مسکو، روسیه)، سی و یکمین کنگره بین المللی فدراسیون انجمن های بیوشیمیایی اروپا (24-29 ژوئن) ، استانبول، ترکیه)، بیست و ششمین سمپوزیوم بین المللی جداسازی پروتئین ها، پپتیدها و پلی نوکلئوتیدها (16-20 اکتبر 2006، اینسبروک، اتریش).

انتشارات. بر اساس مطالب پایان نامه، 12 اثر در قالب مقاله و چکیده منتشر شد.

ساختار پایان نامه. پایان نامه شامل مقدمه، مرور ادبیات، بخش تجربی، بحث در مورد نتایج، نتیجه گیری و فهرستی از ادبیات استناد شده است.

مطالب پایان نامه در 147 صفحه، شامل 19 جدول و 42 شکل ارائه شده است. فهرست منابع ادبی شامل 187 عنوان است.

در مقدمهمنطق موضوع ارائه شده است، اهداف تحقیق و مفاد ارائه شده برای دفاع تدوین شده، تازگی علمی و اهمیت عملی آن ذکر شده است. داده هایی در مورد آزمایش و انتشار نتایج تحقیق و همچنین در مورد ساختار و محدوده پایان نامه ارائه شده است.

فصل 1. اطلاعات کلی در مورد روش های موجود برای تجزیه و تحلیل ترکیبات مورد مطالعه ارائه شده است. روش های کروماتوگرافی و تعدادی از روش های شناسایی پذیرفته شده به طور کلی با جزئیات بیشتر توضیح داده شده است. روش‌هایی برای تعیین آمینوتیول‌های با وزن مولکولی کم در پلاسمای خون و همچنین قطعات DNA در نظر گرفته شده‌اند. مقایسه روش های موجود برای تجزیه و تحلیل اسیدهای آمینه، پپتیدهای کوتاه و الیگونوکلئوتیدها انجام شده است و ارتباط تحقیقات بیشتر در این زمینه اثبات شده است.

فصل 2. داده ها در مورد مواد، معرف ها، روش های آماده سازی محلول های مورد استفاده و انجام کار ارائه شده است.

فصل 3. نتایج و بحث.

محتوای اسیدهای آمینه آزاد (AA) در مایعات فیزیولوژیکی یک پارامتر تشخیصی برای تعدادی از بیماری ها است. هدف تحقیق انجام شده توسعه تکنیکی است که به آنها امکان می دهد سریع و قابل اعتماد آنها را جدا و شناسایی کنند. تجزیه و تحلیل مخلوط این گونه AA با استفاده از الکتروفورز ناحیه مویرگی (CZE) و کروماتوگرافی الکتروکینتیک میسلی انجام شد.ضریب شکست AA به روش CZE با استفاده از مخلوط AA به روش CZE با طول تشخیص شکست سنجی 90 سانتی متر، طول موثر 75 سانتی متر. .

الف) بافر: 60 میلی مولار سدیم بورات، pH 11.0. ولتاژ: 20 کیلو ولت جریان: 93 µA. دما: 21.0 درجه سانتی گراد از ترکیب بهینه نمونه الکتریکی پس زمینه زمان تزریق: 7.0 ثانیه (الکتروکینتیک، ولتاژ در حین تزریق نمونه - 5 کیلو ولت). ترول را معرفی کرد. برای این منظور، مقدار AA مورد آزمایش قرار گرفت - 0.1 نانوگرم. آلانین، تیروزین - 0.2 نانوگرم.

4 – پرولین 5 – آلانین 6 - تیروزین 7 – سرین; - آسپارتیک اسد؛ 9- متیونین.

سیستم های بافر CAPS و همچنین ترکیبات مختلف آنها با استفاده از مثال مخلوط مدل 8 AA با رادیکال هایی با ماهیت و خواص مختلف و متفاوت ترین مقادیر pKa گروه آمینه. نمونه ای از جداسازی چنین مخلوطی با استفاده از الکترولیت پشتیبان بورات در شکل 1 نشان داده شده است.

الکترولیت زمینه بهینه برای جداسازی AA آزاد با این روش محلولی حاوی 60 میلی مولار بافر بورات (pH 11.0) است.

با استفاده از آن، تأثیر عوامل مختلف (ولتاژ، جریان، قطر داخلی و طول موثر مویرگ، روش معرفی نمونه) بر راندمان جداسازی مورد بررسی قرار گرفت و نشان داد که در شرایط آزمایشی امکان جداسازی کامل مخلوط وجود ندارد. از همه AA های کدگذاری شده از این آزمایش نتیجه می شود که AC هایی که برای آنها تفاوت در زمان مهاجرت بیش از 1 دقیقه است به طور قابل قبولی از هم جدا شده اند. به همین دلیل، روش کلاسیک CZE نمی تواند حضور همزمان گلیسین، آلانین، والین، لوسین، ایزولوسین، هیستیدین، فنیل آلانین و تیروزین و همچنین اسیدهای اسپارتیک، گلوتامیک و سیستئین را جدا و شناسایی کند. ضریب انتخاب برای آنها بسیار کم و نزدیک به 1 است. آرژنین، لیزین، پرولین، سرین، اسید آسپارتیک و متیونین به راحتی جدا و شناسایی می شوند، i.e. AK ها دارای زمان مهاجرت 5.5-10.0، 15 و 19.5-20.8 دقیقه هستند. ضریب انتخاب برای این گروه از AK ها در محدوده 1.1 - 1.3 است. هنگام استفاده از یک الکترولیت پشتیبان فسفات (pH 11.4)، یک الگوی جداسازی کلی مشابه مشاهده شد، اما با وضوح اوج ضعیف‌تر. مطالعات انجام شده نشان می دهد که CZE کلاسیک با پایان انکساری، در بهترین حالت امکان جداسازی و شناسایی کامل حداکثر 8 AA را در یک محلول آبی فراهم می کند. در این مورد، محتوای AA منفرد از موارد غیر قابل جداسازی مشخص شده در چنین مخلوطی نباید از دو تجاوز کند.

کارایی جداسازی AA با افزودن متانول به الکترولیت های پس زمینه با pH 7 به طرز محسوسی بهبود می یابد. هنگام استفاده از بافر فسفات 150 میلی مولار (pH 2.0) با افزودن 30 درصد حجم. متانول، امکان جداسازی 16 مورد از 20 AA رمزگذاری شده ژنتیکی وجود داشت (شکل 2). متأسفانه جداسازی کامل این مخلوط به زمان قابل توجهی نیاز دارد.

مویرگی: قطر داخلی 75 میکرومتر، طول کل - 65 سانتی متر، طول موثر - 50 سانتی متر.

دما: 28.0 oC. زمان تزریق نمونه: 1.5 ثانیه (خلاء).

شناسایی: 1 - لیزین، 2 - آرژنین، 3 - هیستیدین، 4 - گلیسین، 5 - آلانین، 6 - والین، 7 - ایزولوسین، 8 - لوسین، 9 - سرین، 10 - ترئونین، 11 - متیونین، 12 - فنیلانین 13 - اسید گلوتامیک، 14 - پرولین، 15 - اسید آسپارتیک، 16 - تیروزین.

از آنجایی که CZE کلاسیک اعمال شده در pH 7 کیفیت مورد نیاز جداسازی را فراهم نمی کند، تصمیم گرفته شد که روش MEKC با تشخیص مستقیم UV برای تجزیه و تحلیل AA های آزاد اعمال شود. سدیم دودسیل سولفات (SDS) به عنوان یک شوینده به محلول های بافر اضافه شد. در طول کار، از غلظت های مختلف اجزای الکترولیت زمینه استفاده شد. بهترین نتایج با استفاده از یک الکترولیت پس‌زمینه حاوی 133 میلی‌مولار اسید بوریک، 33 میلی‌مولار سدیم بورات و 100 میلی‌مولار SDS، pH 9.5 به دست آمد. استفاده از یک الکترولیت از ترکیب مشخص شده به طور قابل توجهی تعداد AA تجزیه و تحلیل شده را افزایش داد و همزمان آنها را در مقادیر pH الکترولیت پس زمینه واقع در ناحیه اصلی تعیین کرد. در شکل شکل 3 الکتروفروگرام مخلوطی از 14 AA را نشان می دهد.

برنج. 3. جداسازی مخلوطی از 14 AA آزاد توسط کروماتوگرافی الکتروکینتیک میسلی با تشخیص مستقیم UV مویرگی: قطر داخلی 50 میکرومتر طول کل 122 سانتی متر طول موثر 35 سانتی متر بافر:

133 میلی‌مولار اسید بوریک، 33 میلی‌مولار تترابورات سدیم (pH 9.5) 100 میلی‌مولار سدیم دودسیل سولفات. ولتاژ: 20 کیلو ولت جریان: 48 µA. دما: 27.5 oC. زمان تزریق نمونه: 3.0 ثانیه (خلاء).

مقادیر تجویز شده از AA 5.0 نانوگرم بود. آلانین، والین، ایزولوسین و گلیسین - 7.0 نانوگرم.

شناسایی: 1- والین، 2- آلانین، 3- ایزولوسین، 4- گلیسین، 5- سرین، 6- ترئونین، 7- تیروزین، 8- هیستیدین، 9- فنیل آلانین، 10- آرژنین، 11- لیزین، 12- سیستین، 13 - متیونین، 14 - اسید گلوتامیک. * - سیستم به اوج می رسد.

مقادیر بدست آمده از زمان های مهاجرت قابل توجه است.

علیرغم طول مویرگ موثر کمتر، آنها معمولاً بالاتر از مورد CZE کلاسیک هستند که با ماهیت MEKC مطابقت دارد. این همچنین ممکن است به بزرگی ولتاژ اعمال شده در واحد طول مویین مربوط باشد. تفاوت در زمان مهاجرت مورد نیاز برای جداسازی AC به طور قابل توجهی کمتر از مورد CZE است. 0.5 دقیقه کافی است.

مطالعه دقیق تری بر روی شرایط جداسازی 14 AA رمزگذاری شده ژنتیکی، که معمولاً در پلاسمای خون اهداکنندگان سالم در حالت آزاد وجود دارند، انجام شد. اثر pH و افزودن حلال‌های آلی مختلف به الکترولیت زمینه بر میزان تفکیک پیک مورد مطالعه قرار گرفت. از آزمایش نتیجه می شود که برای دستیابی به جداسازی کامل مخلوط 14 AA، مقدار pH باید در محدوده 9.0-10.0 قرار گیرد. در مقادیر pH خارج از محدوده مشخص شده، وضوح لازم AK ارائه نمی شود. بدیهی است که در pH 9 این به دلیل تفاوت بین مقادیر pKa (AA) و در pH 10 به دلیل تجزیه جزئی ترکیبات DDSNAC است. اثر افزودن حلال آلی با استفاده از متانول، 2-پروپانول و استونیتریل بررسی شد. داده های به دست آمده نشان می دهد که افزودن هر یک از حلال های آلی منجر به تغییر قابل توجهی در زمان مهاجرت و ضرایب انتخاب می شود. ماهیت تغییر توسط ماهیت و غلظت ماده افزودنی تعیین می شود. متانول و استونیتریل جداسازی AA مورد مطالعه را بهبود نمی بخشند، که ظاهراً به دلیل توانایی کم آنها برای تشکیل ترکیبات مخلوط AA-SDS-R است، جایی که R یک مولکول حلال آلی است. افزودن 3-5٪ 2-پروپانول به طور قابل توجهی درجه تفکیک اجزا را با افزایش نسبتاً کمی در زمان مهاجرت AA بهبود می بخشد. با افزایش غلظت 2-پروپانول، افزایش قابل توجهی در زمان مهاجرت AA مشاهده می شود که منجر به کاهش سرعت تعیین می شود. مطالعات انجام شده به‌ویژه نشان داده‌اند که بهترین جداسازی AA در حضور مقدار مؤثر یک حلال آلی (2-پروپانول) در صورتی رخ می‌دهد که الکترولیت زمینه حاوی 50 میلی‌مولار اسید بوریک، 33 میلی‌مولار سدیم بورات و 50 میلی‌مولار SDS باشد. در شکل شکل 4 الکتروفروگرام مخلوطی از 14 AA را نشان می دهد.

داده های ارائه شده نشان دهنده جداسازی موثر 13 از 14 AA کدگذاری شده ژنتیکی است. مجموع زمان جداسازی از حداقل کمتر است. زمان مهاجرت Sr 0.03 است. مقادیر Sr کمی بزرگتر، نزدیک به 0.06-0.08، برای آلانین، والین و هیستیدین مشاهده می شود.

برنج. 4. جداسازی مخلوط 14 AA توسط MEKC با تشخیص مستقیم UV مویرگی: قطر داخلی 75 میکرومتر طول کل 61 سانتی متر طول موثر 41 سانتی متر.

بافر: 33 میلی مولار تترابورات سدیم، 100 میلی مولار اسید بوریک، 50 میلی مولار SDS، 5% 2-پروپانول، pH=10.2. ولتاژ: 25 کیلو ولت جریان: 65 µA. دما: 29.5 oC. زمان تزریق نمونه: 1.5 ثانیه (خلاء). مقادیر تجویز شده از AA 0.5 نانوگرم بود.

شناسایی: 1 -لیزین; 2 - پرولین; 3 - فنیل آلانین; 4 - آلانین; 5 - والین; 6 - گلیسین;

7 - هیستیدین; 8 - تیروزین; 9 – لوسین + ایزولوسین; 10 - سرین; 11 - ترئونین; 12 - اسید گلوتامیک; 13 - سیستئین.

سطح تفکیک به دست آمده امکان انجام مطالعاتی در مورد تعیین کمی AAهای در نظر گرفته شده را فراهم کرد. تجزیه و تحلیل یک مخلوط مدل از 14 AA از ترکیب شناخته شده انجام شد. مطالعات نشان داده اند که روش MEKC با تشخیص مستقیم اشعه ماوراء بنفش با استفاده از محلول بافر بورات حاوی 3-5٪ 2-پروپانول، تعیین کمیت 14-16 AA کدگذاری شده ژنتیکی با خطای (Sr) 6-8٪ در کمتر از 30 را ممکن می کند. دقایق. دقت نتایج به‌دست‌آمده علاوه بر این با استفاده از روش «ورودی یافت شده» انجام شد (جدول 1). تأیید صحت تعیین محتوای AAهای کدگذاری شده ژنتیکی با استفاده از روش MEKC (mo(AA) = 0.50 نانوگرم؛ وارد شده - 1.00 نانوگرم) آنالیز هموسیستئین و سایر آمینوتیول‌های با وزن مولکولی کم در خون پلاسما هموسیستئین (Hcy) و آمینوتیول‌های همراه آن (AT) (اسید آمینه رمزگذاری شده - سیستئین (Cys)، تری پپتید گلوتاتیون (GSH)) در پلاسمای خون نشانگرهای مولکولی اختلال عملکرد سیستم قلبی عروقی هستند. هدف اصلی این مطالعه ایجاد روشی برای تعیین محتوای هموسیستئین به عنوان یک عامل خطر قابل اعتماد برای چنین بیماری‌هایی بود.

تجزیه و تحلیل کمی آمینوتیول های با وزن مولکولی کم در پلاسمای خون شامل کاهش پیوندهای دی سولفیدی، پروتئین زدایی از پلاسمای خون، اصلاح آمینوتیول ها با معرف های مناسب، جداسازی و شناسایی آمینوتیول های اصلاح شده توسط RP HPLC یا CE با یک یا آن روش تشخیص است. در این کار، آمینوتیول های اکسید شده و متصل به پروتئین با تری فنیل فسفین کاهش یافتند. برای حذف کاتیون های فلزات سنگین، از افزودنی EDTA استفاده شد. روش کاهش پیشنهادی کاهش سریع (15 دقیقه) و کامل (96٪) دی سولفیدها و آزادسازی گروه‌های سولفیدریل در دمای اتاق را فراهم کرد. بازده واکنش‌های کاهش با استفاده از یک روش استاندارد برای اندازه‌گیری محتوای AT آزاد تعیین شد. پروتئین های پلاسما با وزن مولکولی بالا با اسید 5 سولفوسالیسیلیک رسوب داده شدند.

غلظت آن در طول مطالعه بهینه شد، که از کاهش حساسیت به دلیل رقت در مرحله خنثی سازی جلوگیری کرد.

اصلاح سولفیدریل های آزاد با مونوبروموبیمان (mBrB) یا 5-iodoacetamido-fluorescein (5-IAF) انجام شد. مقدار pH مورد نیاز با استفاده از دی اتانول آمین (pKa = 8.9) و سدیم ارتوفسفات بسته به معرف مورد استفاده برای اصلاح AT حفظ شد. استفاده از دی اتانول آمین امکان کنترل مستقیم تشکیل محصولات هدف توسط طیف سنجی جرمی را فراهم کرد. برای شناسایی مشتقات AT، از روش‌های تشخیص فتومتریک و فلورمتری استفاده شد. مشتقات با طیف‌سنجی جذبی، فلورمتری و جرمی (MALDI-TOF، ESI) مشخص شدند. تشخیص فتومتریک و فلورمتری در طول موج‌های انتخاب شده با توجه به طیف جذب (Hcy-MB - 234 نانومتر) و طیف فلورسانس مشتقات Hcy (390 نانومتر (تحریک) و 478 نانومتر (فلورسانس) انجام شد. از طیف فلورسانس مزدوج Hcy-AF نتیجه می‌شود که در طول تشخیص فلورمتری، طول موج بهینه برای تحریک 462 نانومتر و برای فلورسانس 504 نانومتر است.

برای یکسان کردن روش‌ها برای تعیین و تأیید امکان اساسی استفاده از آشکارساز مشابه برای شناسایی مشتقات مونوبیمان و فلورسین، کارایی تحریک در طول موج 390 نانومتر مورد مطالعه قرار گرفت. شدت حداکثر فلورسانس حاصل، و در نتیجه، حساسیت تشخیص یک مرتبه قدر کمتر از زمانی بود که از تابش در طول موج 462 نانومتر برای تحریک استفاده می شد.

مشتقات تک تک منوبروموبیمان (MB) و استامیدوفلورسئین (AF) AT، و همچنین مخلوط مدل آنها، مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. مشتقات مونوبروموبیمان منفرد Cys، Hcy و GSH به ترتیب با زمان ماند (دقیقه) 0.19±6.01، 0.17±10.76 و 0.11±11.89 شسته شدند (شکل 5)1.

زمان ماندگاری یکسان در هنگام استفاده از مخلوط آمینوتیول ها با ترکیب شناخته شده حفظ می شود. داده های تجربی به دست آمده امکان محاسبه بازده واکنش اصلاح را فراهم می کند. این کمتر از 97٪ نبود که با داده های شناخته شده مطابقت خوبی دارد، اما تحت شرایط آماده سازی نمونه دقیق تر به دست آمد. مشتقات حاصل از مخلوط جدا شده و با طیف سنجی جرمی مشخص شدند.

مشتقات فلورسئین Cys، Hcy و GSH با زمان ماند (دقیقه) 0.12 ± 8.49 شسته شدند. به ترتیب 10.46±0.15 و 12.96±0.14 (شکل 6).

آنالیز کروماتوگرافی بر روی یک کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا داخلی "MiliChrom A-02" (EkoNova، نووسیبیرسک) انجام شد. 5. RP HPLC از مخلوط مدل آمینوتیول ها اصلاح شده با مونوبروموبیمان. Cys-MB-50.0 میکرومولار، Hcy-MB-25.0 میکرومولار، GS-MB-25.0 میکرومولار.

تشخیص فلورمتری (exc = 390nm، exp = 478nm) شکل. 6. RP HPLC مخلوط مدل آمینوتیول اصلاح شده با 5-iodoacetamidofluorescein. Cys-AF-100.0μM، Hcy-AF-150.0μM، GS-AFμM. تشخیص فلورمتری (abs = 390 نانومتر، esp = 478 نانومتر) هنگام استفاده از 5-IAF به عنوان یک برچسب، وضوح بهتری از پیک های ترکیبات تیول-فلورسنت در مقایسه با مزدوج های تیول-مونوبیمان به دست می آید. بازده واکنش اصلاح AT 5-IAF، که به صورت تجربی با کاهش شدت پیک برچسب فلورسنت تعیین شد، 95٪ بود. تمام مشتقات حاصل از مخلوط جدا شده و با طیف سنجی جرمی مشخص شدند.

داده های به دست آمده به عنوان پایه ای برای توسعه روشی برای تعیین کمی هموسیستئین عمل کردند. برای ساخت منحنی کالیبراسیون، نمونه‌هایی از مخلوط‌ها با محتوای آن از 2.5 تا 100 میکرومولار استفاده شد. فاصله انتخاب شده شامل محدوده غلظت فیزیولوژیکی Hcy (5-50 میکرومولار) است. mBrB به عنوان برچسب استفاده شد. وابستگی کالیبراسیون حاصل از ناحیه پیک کروماتوگرافی به محتوای هموسیستئین در مخلوط در سراسر محدوده غلظت مورد مطالعه خطی است و با معادله توصیف می‌شود:

انحراف استاندارد نسبی نتایج تعیین بر اساس سطح پیک از 0.083 و با زمان بازیابی - 0.026 تجاوز نمی کند. حد تشخیص فلورمتری مشتقات MB 1 میکرومولار است (شکل 7).

برنج. 7. تغییر در ناحیه پیک کروماتوگرافی بسته به غلظت Hcy اثربخشی روش با مقایسه کروماتوگرام های به دست آمده برای هر ماده و نمونه های پلاسمای خون تهیه شده با استفاده از روش پیشنهادی تایید می شود. مطالعات انجام شده امکان توسعه روشی برای تعیین کمی هموسیستئین، سیستئین و گلوتاتیون در پلاسمای خون و استفاده موفقیت آمیز از آن برای تجزیه و تحلیل معمول آنتی بادی های ذکر شده در بالا در قالب مشتقات MB آنها را فراهم کرد (شکل 8). . هنگام توسعه روش، کنترل اضافی با استفاده از روش "ورودی یافت شده" انجام شد (جدول 2).

برنج. 8. RP HPLC پلاسمای خون از اهداکننده سالم. Cys-MB-192.4 میکرومولار، HcyMB-10.1 میکرومولار، GS-MB-15.7 میکرومولار. تشخیص فلورمتری تعیین Hcy به شکل مشتقات MB با استفاده از میکروستون HPLC با استفاده از روش توسعه‌یافته، بیش از 50 نمونه پلاسمای خون از بیماران سالم و کسانی که از بیماری‌های قلبی عروقی با شدت متفاوت رنج می‌برند، مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت. برای بیماران سالم، میانگین محتوای (μM) AT در پلاسمای خون به دست آمده از ورید با معده خالی در صبح عبارت بود از:

برای Hcy 3.21 ± 12.75، برای GSH 1.17 ± 9.53 و برای Cys 24.61 ± 206.34. مقادیر غلظت بدست آمده در محدوده مقادیر مرجع ارائه شده در ادبیات قرار می گیرد. برای بیماران مبتلا به بیماری های قلبی عروقی، غلظت یافت شده Hcy در پلاسمای خون به شدت بیماری بستگی دارد. نتایج با وضعیت بالینی بیماران ارتباط دارد.

امکان تجزیه و تحلیل AT با استفاده از روش تشخیص ارزان‌تر و رایج‌تر مانند فتومتریک مورد بررسی قرار گرفت. این آزمایش نشان داد که حساسیتی ایجاد می کند که به فرد امکان می دهد سطوح بالای پاتولوژیک AT در پلاسمای خون را تعیین کند. هنگام استفاده از تشخیص فتومتریک، ترجیحاً از 5-IAF به عنوان برچسب استفاده شود زیرا پیک ها را به خط مبنا حل می کند (شکل 9) و امکان کمی سازی را فراهم می کند.

برنج. 9. RP HPLC مخلوط مدل آمینوتیول های اصلاح شده با مونوبروموبیمان (a) و 5-iodoacetamidofluorescein (b). الف) Cys-MB-50.0μM، HcyMB-25.0μM، GS-MB-25.0μM. ب) Cys-AF-50.0μM، Hcy-AF-75.0μM، GS-AF-25.0μM. تشخیص فتومتریک (a = 234 نانومتر، b = 250 و 300 نانومتر) بنابراین، کار انجام شده امکان بهینه‌سازی مرحله آماده‌سازی نمونه را فراهم کرد و آن را تحت "شرایط ملایم" با بازده کمی تضمین شده جزء تجزیه‌وتحلیل‌شده انجام داد. بر اساس آن، روشی ایجاد شده است که به فرد امکان می دهد تا به سرعت و با اطمینان محتوای آنتی بادی های با وزن مولکولی کم در پلاسمای خون بیماران سالم و بیمار را تعیین کند. خطای اندازه گیری از 8.5٪ تجاوز نمی کند. حد پایین محدوده غلظت های اندازه گیری شده (2.5 میکرومولار) امکان اساسی استفاده از این روش برای تعیین میزان کاهش یافته Hcy در پلاسمای خون را نشان می دهد. حد تشخیص روش توصیف شده 1 میکرومولار است. روش توسعه‌یافته بر روی نمونه‌های واقعی پلاسمای خون بیمار آزمایش شد و می‌توان از آن برای استفاده معمول استفاده کرد.

تعیین هموسیستئین و سایر آمینوتیول های با وزن مولکولی کم در پلاسما شکل. 10. CZE مخلوط مدل AT، دارای زمان مهاجرت 0.16 ± 6.18 است. سیستئین mBrB Hcy-MB-700.0 میکرومولار، Cys-MB-300.0 میکرومولار 0.20 ± 6.83 و گلوتاتیون - به ترتیب 0.17 ± 8.54 دقیقه (شکل 10). در مقایسه با GS-MB- 700.0 میکرومولار. (جذب = 234 نانومتر).

مویرگی: قطر داخلی 50 میکرومتر، روش کامل HPLC CZE استفاده شده، اجازه می دهد طول 82 سانتی متر، طول موثر 62 سانتی متر باشد.

بافر: 50 میلی مولار تترابورات سدیم pH=11.0. زمان آنالیز AT را 2-3 دقیقه کاهش دهید.

ولتاژ: 25 کیلو ولت جریان: 58 µA.

تشخیص مستقیم اشعه ماوراء بنفش (خلاء) برای تعیین مقادیر کمی Hcy در پلاسمای خون کافی نیست. در محتوای هموسیستن 10 میکرومولار، نسبت سیگنال به پس زمینه 2.5-3 است و انحراف استاندارد نسبی در محدوده 0.3-0.5 است. این روش برای کنترل محتوای Hcy در پلاسمای خون بیماران با سطوح پاتولوژیک بالا (25 میکرومولار) قابل استفاده است. انحراف استاندارد نسبی هنگام تعیین این غلظت ها 0.12 برای MB-Cys، 0.18 برای MB-Hcy و 0.17 برای MB-GS است.

الکتروفورز ناحیه ای مویرگی با تشخیص فلورمتری بر روی یک تحلیلگر یون مویرگی "Nanofor 02" (INP RAS، سنت پترزبورگ) انجام شد. P = 0.95) مخلوط مدل مشتقات AF با روش CZE با تشخیص نورسنجی مستقیم (شکل 11) و فلورمتری (شکل 12) (جدول 3) مورد مطالعه قرار گرفت. تشخیص فوتومتریک در طول موج 492 نانومتر انجام شد که مطابق با طول موج تحریک 5-IAF است. برای تشخیص فلورمتری، طول موج تحریک 473 نانومتر و طول موج انتشار 514 نانومتر بود. مشخص شده است که استفاده از 5-IAP امکان افزایش حساسیت تعیین Hcy با روش CZE با تشخیص فلورمتری را فراهم می کند.

جذب، 492 نانومتر شکل. شکل 11. CZE از مخلوط مدل AT، mo- شکل. 12. CZE از مخلوط مدلی از ATها اصلاح شده با 5-iodoacetamidofluorescein اصلاح شده با 5-iodoacetamido-fluorescein با فلورسین UV مستقیم با Hcy-AF-100.0 میکرومولار فلورمتری، Cys-AF-300.0 میکرومولار، GS-AF15، Hcy-AF-0. میکرومولار، Cys-AF-15.0 میکرومولار، GS-AFµM. (abs = 473 نانومتر، exp = 514 نانومتر) 700.0 میکرومولار. (جذب = 492 نانومتر).

مویرگ: قطر داخلی 50 میکرومتر، مویرگ کل: قطر داخلی 50 میکرومتر، طول کل 68 سانتی متر، طول موثر 53 سانتی متر طول 65 سانتی متر، طول موثر 57 سانتی متر.

بافر: 25 میلی مولار تتربورات سدیم، 25 میلی مولار فسفات بافر: 25 میلی مولار تترابورات سدیم، 25 میلی مولار فسفات سدیم pH = 11.2. ولتاژ: 20 کیلو ولت قدرت فعلی: pH سدیم = 11.2. ولتاژ: 20 کیلو ولت قدرت فعلی:

22 µA. دما: 25.0 oC. زمان ورودی 18 µA است. دما: 25.0 oC. زمان تزریق نمونه: 5 ثانیه (الکتروکینتیک، ولتاژ در: 5 ثانیه (الکتروکینتیک، ولتاژ در) روش‌های توسعه‌یافته برای تعیین محتوای هموسیستئین در پلاسمای خون با استفاده از RP HPLC و الکتروفورز مویرگی در عمل تجزیه و تحلیل زیست‌پزشکی توسط JSC معرفی شده‌اند. فناوری های پزشکی، با مسئولیت محدود

با استفاده از الکتروفورز ژل مویرگی تغییرات در محتوای نشانگرهای مولکولی در مایعات فیزیولوژیکی نیز ممکن است به دلیل استعداد ژنتیکی بیمار به یک بیماری خاص باشد. از این رو نیاز به انجام تجزیه و تحلیل مقایسه ای از قطعات DNA به منظور افزایش قابلیت اطمینان در تعیین علت بیماری مورد مطالعه و موثرتر درمان آن است.

در این کار، ما امکان استفاده از تجهیزات CE داخلی موجود برای تعیین جهش در مولکول‌های DNA را با استفاده از نمونه‌ای از قطعات ژن جهش یافته برای ترومبوز وریدی، با استفاده از PCR اختصاصی آلل بررسی کردیم. نوکلئوتیدها با الکتروفورز ژل مویرگی (CGE) با استفاده از مویرگ های شیشه ای کوارتز اصلاح نشده با قطر 25 تا 100 میکرومتر جدا شدند. پلی-N، N-دی متیل آکریل آمید خطی (pDMA) تولید داخلی به عنوان ماتریس جداسازی استفاده شد. انتخاب این پلیمر به امکان استفاده از آن در نسخه تراشه ای CGE مربوط می شود. pDMA در Synthol JSC از مونومر دی متیل آکریل آمید با پلیمریزاسیون رادیکال سنتز شد. طول زنجیر با تغییر دما یا افزودن جاذب‌های رادیکال کنترل می‌شد. پلیمرهای حاوی 5-8% مونومر pDMA استفاده شد. 0.1 M TBE (0.1 M TRIS، 0.1 M اسید بوریک، و 2.5 میلی مولار EDTA؛ pH = 8.3) و 0.1 M TAPS (N-tris(hydroxymethyl)methyl) به عنوان الکترولیت های زمینه استفاده شد. اسید 3-aminopropanesulfonic؛ pH = 8.3) همه پلیمرهای مورد مطالعه دارای سطح پایین فلورسانس بومی (0.5 AU) بودند. پلیمرهای تهیه شده با استفاده از 0.1M TAPS تا 5 جداسازی را بدون پر کردن مجدد مویرگ با ژل امکان پذیر می کند، در حالی که آنهایی که حاوی TBE هستند اجازه بیش از 3 جداسازی را نمی دهند.

مطالعات مخلوطی از پلی نوکلئوتیدهای نشاندار شده با فلورسنت با طول 5-15 نوکلئوتید. به ترتیب، با محتوای 10-9 M از هر یک از آنها، امکان تعیین ترکیب پلیمری بهینه برای جداسازی الیگونوکلئوتیدهایی با طول زنجیره تا 100 nt وجود داشت. (شکل 13). این ژل مبتنی بر pDMA حاوی 6% مونومر، 7M اوره و 0.1M TAPS است.

برنج. 13. جداسازی مخلوطی از پلی نوکلئوتیدها با طول مویرگی: قطر داخلی - 50 میکرومتر، طول کل - 45 سانتی‌متر، طول مؤثر - 38.5 سانتی‌متر. پلیمر: 6% مونومر pDMA، 0.1M TAPS، 7M اوره. الکترولیت کار: 0.1M TAPS. ولتاژ:

10 کیلو ولت جریان: 4.3 µA. دما: 25.0 oC. زمان تزریق نمونه 10 ثانیه است (الکتروکینتیک، ولتاژ جمع آوری نمونه 10 کیلو ولت).

بهینه سازی شرایط جداسازی (ولتاژ، جریان، طول موثر و قطر مویرگی) امکان دستیابی به جداسازی به خط پایه اولیگونوکلئوتیدها با طول کلی کمتر از 100 nt را فراهم کرد. و اختلاف طول 1 n.o. (شکل 14.).

برنج. 14. جداسازی مخلوطی از پلی نوکلئوتیدها با اختلاف طول 1 جفت باز.

مویرگی: قطر داخلی - 50 میکرومتر، طول کل - 65 سانتی‌متر، طول مؤثر - 57.5 سانتی‌متر. پلیمر: 6% مونومر pDMA، 0.1M TAPS، 7M اوره. الکترولیت کار: 0.1M TAPS. ولتاژ:

11 کیلو ولت جریان: 5.1 µA. دما: 25.0 oC. زمان تزریق نمونه 10 ثانیه است (الکتروکینتیک، ولتاژ جمع آوری نمونه 10 کیلو ولت).

داده های به دست آمده به عنوان پایه ای برای توسعه سیستمی برای تشخیص سریع و موثر ژن جهش یافته برای ترومبوز وریدی (ژن لیدن فاکتور V سیستم انعقاد خون انسان) عمل کرد.

برای اثبات امکان تعیین مشترک محصولات نوع وحشی و جهش یافته (تفاوت 5 جفت باز)، PCR های زیر انجام شد: 1.

DNA نوع وحشی (بدون جهش) + پرایمر نوع وحشی. 2. DNA نوع وحشی (بدون جهش) + پرایمر FV Leiden; 3. DNA با جهش هتروزیگوت FV Leiden + پرایمر FV Leiden. 4. پرایمر FV Leiden بدون DNA. محصولات واکنش پس از تیمار با فرمامید و رقیق شدن با آب، توسط CGE با تشخیص فلورمتری آنالیز شدند. تجزیه و تحلیل نمونه های 1 و 3 وجود محصول در مخلوط را پس از PCR نشان داد و نمونه های 2 و 4 عدم وجود آن را نشان دادند. برای تایید این الگو، مخلوطی از پرایمر جهش یافته/محصول جهش یافته و نمونه های پرایمر نوع وحشی/محصول نوع وحشی را در نسبت 1:1 تجزیه و تحلیل کردیم (شکل 15).

برنج. 15. تعیین مشترک محصولات PCR جهش یافته و غیر جهش یافته مویرگی: قطر داخلی - 50 میکرومتر، طول کل - 45 سانتی متر، طول موثر - 38.5 سانتی متر، پلیمر 6% مونومر pDMA، 0.1 M TAPS، 7 مولار اوره. الکترولیت کار: 0.1M TAPS. ولتاژ: 12 کیلو ولت

جریان: 6.5 µA. دما: 25.0 oC. زمان جمع آوری نمونه: 10 ثانیه (الکتروکینتیک، ولتاژ جمع آوری نمونه – 10 کیلو ولت).

داده های به دست آمده امکان تعیین مشترک محصولات PCR آللی خاص جهش FV Leiden و نوع وحشی را نشان می دهد. رویکرد پیشنهادی، یعنی انتخاب و سنتز پرایمرهای اختصاصی آلل با طول‌های مختلف و یک آغازگر متداول متداول، به دنبال آنالیز توسط CGE با تشخیص فلورمتری، می‌تواند برای تشخیص سایر بیماری‌های تعیین‌شده ژنتیکی گسترش یابد. همچنین لازم به ذکر است که امکان آنالیز الیگونوکلئوتیدها با استفاده از تجهیزات استاندارد داخلی مورد استفاده برای آنالیز اسیدهای آمینه و پپتیدهای کوتاه وجود دارد.

1. روش هایی برای تجزیه و تحلیل آمینو اسیدهای رمزگذاری شده ژنتیکی بدون مشتق سازی اولیه آنها با استفاده از کروماتوگرافی الکتروکینتیک میسلی و الکتروفورز ناحیه مویرگی با انکسار سنجی و تشخیص مستقیم UV ایجاد شده است. تأثیر ترکیب و مقدار pH الکترولیت پس‌زمینه، و همچنین افزودن حلال‌های آلی، بر راندمان جداسازی مورد مطالعه قرار گرفت.

2. با استفاده از روش کروماتوگرافی الکتروکینتیک میسلی با تشخیص مستقیم UV، تعیین کمی مخلوط مدل از 14 اسید آمینه آزاد کدگذاری شده ژنتیکی انجام شد.

3. روشی برای تعیین سریع و قابل اعتماد محتوای آمینوتیول های با وزن مولکولی کم در پلاسمای خون بیماران سالم و بیمار با استفاده از HPLC فاز معکوس با تشخیص فلورمتری ایجاد شده است. امکان اساسی استفاده از این تکنیک برای تعیین سطوح پایین هموسیستئین در پلاسمای خون نشان داده شده است. روش توسعه‌یافته بر روی نمونه‌های واقعی پلاسمای خون بیمار آزمایش شد.

4. امکان تعیین غلظت های پاتولوژیک بالا هموسیستئین در پلاسمای خون توسط الکتروفورز ناحیه مویرگی با تشخیص فتومتریک نشان داده شده است. روش توسعه‌یافته بر روی نمونه‌های واقعی پلاسمای خون بیمار آزمایش شد. امکان استفاده از 5-iodoacetamidofluorescein به عنوان برچسب جذب کننده و فلوروژنیک مورد بررسی قرار گرفت.

5. روشی برای تعیین انتخابی قطعات ژن جهش یافته برای ترومبوز وریدی (جهش FV Leiden) توسط الکتروفورز ژل مویرگی با تشخیص فلورمتری ایجاد شده است. امکان آنالیز نوکلئوتیدهایی با طول زنجیره تا 100 نوکلئوتید نشان داده شده است. و با اختلاف طول 1 n.o.

مواد اصلی پایان نامه در آثار زیر ارائه شده است:

1. Melnikov I.O., Nazimov I.V., Stukacheva E.A., Glubokov Yu.M. تعیین محتوای هموسیستئین و سایر آمینوتیول های با وزن مولکولی کم در پلاسمای خون. // جی. مقعد. شیمی. -2006. -تی. 61. -شماره 11. -س. 1185-1191.

2. Melnikov I.O., Glubokov Yu.M., Nazimov I.V. الکتروفورز مویرگی اسیدهای آمینه آزاد با تشخیص رفرکتومتری و مستقیم UV. // Inf.-Anal. بولتن "یادداشت های علمی MITHT." م.:

MITHT. -2004. جلد 11. -S. 54-57.

3. Melnikov I.O., Glubokov Yu.M., Nazimov I.V. تجزیه و تحلیل آمینوتیول های با وزن مولکولی کم با الکتروفورز مویرگی و RP HPLC با تشخیص فلورسنت و مستقیم UV. // J. "فناوری های پیشرفته مدرن." M.: فرهنگستان علوم طبیعی، -2005. -شماره 3. -ص.40-41.

4. Melnikov I.O., Nazimov I.V., Stukacheva E.A., Glubokov Yu.M. تعیین HPLC و HPCE هموسیستئین به عنوان معیار عروقیعامل خطر بیماری ها // FEBS J. -2006. -V. 273. -S.1. -پ. 256.

5. Melnikov I.O., Nazimov I.V., Lobazov A.F., Popkovich G.V. الکتروفورز مویرگی اسیدهای آمینه اصلاح نشده // خلاصه. گزارش هشتمین سمپوزیوم روسی کروماتوگرافی مایع مولکولی و الکتروفورز مویرگی، مسکو، اکتبر 2001، ص 23.

6. ملنیکوف I.O.، Nazimov I.V.، Lobazov A.F.، Popkovich G.B. الکتروفورز مویرگی آمینو اسیدهای رمزگذاری نشده با رفرکتومتریتشخیص. // سومین سمپوزیوم بین المللی جدایی ها در علوم زیستی، مسکو، می 2003، ص 263.

7. Melnikov I.O., Stukacheva E.A., Glubokov Yu.M., Nazimov I.V. تعیین هموسیستئین و سایر آمینوتیول های با وزن مولکولی کم در پلاسمای خون به روش CEF و RP HPLC. // مطالب کنفرانس بین المللی دانشجویان و دانشجویان تحصیلات تکمیلی در علوم پایه "Lomonosov-2005".

M.: MSU، 2005. بخش شیمی. -تی. 1. -S. 31.

8. Nazimov I.V., Melnikov I.O., Glubokov Yu.M., Sivoplyasova E.A. ریزروش های ابزاری برای تعیین هموسیستئین به عنوان یک عامل خطر برای بیماری های قلبی عروقی. // مطالب دومین کنفرانس علمی و عملی «مشکلات کنونی بیوتکنولوژی پزشکی»، آناپا، سپتامبر 2005، -S. 15-16.

9. Melnikov I.O., Nazimov I.V., Sivoplyasova E.A., Glubokov Yu.M. Micromethods برای تعیین کمی هموسیستئین در پلاسمای خون. // مواد سومین کنگره انجمن بیوتکنولوژیست های روسیه به نام. یو.آ. اووچینیکوا، مسکو، اکتبر 2005، -S. 61.

10. Melnikov I.O., Sivoplyasova E.A., Glubokov Yu.M., Nazimov I.V. تعیین عوامل خطر بیماری های قلبی عروقی با استفاده از روش های آنالیز کروماتوگرافی. // مطالب اولین کنفرانس دانشمندان جوان MITHT im. M.V. لومونوسوف، مسکو، اکتبر 2005، -S. 31.

11. Melnikov I.O., Nazimov I.V., Stukacheva E.A., Glubokov Yu.M. جداسازی و شناسایی آمینوتیول های خون با وزن مولکولی کم توسطکروماتوگرافی مایع با کارایی بالا فاز معکوس و الکتروفورز مویرگی // کنگره بین المللی علوم تحلیلی ICAS-2006، مسکو، ژوئن 2006، -P. 204.

12. ملنیکوف I.O.، Nazimov I.V.، Patrushev L.I.، Alekseev Ya.I.، Glubokov Yu.M.، Mosina A.G. تعیین جهش ژن لیدن انسانی توسطالکتروفورز ژل مویرگی با کارایی بالا // بیست و ششمین سمپوزیوم بین المللی جداسازی پروتئین ها، پپتیدها و پلی نوکلئوتیدها، LMP، اینسبروک، اتریش، اکتبر 2006، -P. 24.

کارهای مشابه:

Dmitry Sergeevich KOPCHUK 5-ARYL-2,2'-BIPIRIDIINES و کمپلکس های لومینسانت آنها با لانتانید (III) عملکردی 02.00.03. - چکیده شیمی آلی پایان نامه برای درجه علمی کاندیدای علوم شیمی اکاترینبورگ 2010 این کار در گروه شیمی آلی موسسه آموزشی دولتی آموزش عالی حرفه ای USTU-UPI به نام اولین رئیس جمهور روسیه B.N. یلتسین ناظر تحقیقاتی: دکتر علوم شیمی کوژونیکوف دیمیتری نیکولایویچ مخالفان رسمی: دکتر علوم شیمی...

"Venv Sergey Valerievich e مطالعه نظری تاثیر برهمکنش های الکترواستاتیک و ساختار اولیه ماکرومولکول ها بر خود سازماندهی آنها 02.00.06 - ترکیبات مولکولی بالا چکیده پایان نامه برای درجه کاندیدای علوم فیزیکی و ریاضی مسکو - 2011 کار در گروه فیزیک پلیمرها و بلورهای دانشکده فیزیک دانشگاه دولتی مسکو به نام M.V. لومونوسوف ناظر علمی: دکتر...”

"NIKOLAEV ANDREY ALEXANDROVICH مطالعه نظری و تجربی در مورد تعامل کمپلکس ها در فلزات 6 و 1 0 G R U P Y S D A L K I L F O S F I T A M I ​​02.00.08 - Candidas Adidas of Science Tradesert of Chemistry 02.00.08 - Chemistry of Science Tradesert of Chemistry of the Science of Chemistry and Chemistry 02.00.08) علوم hemical کازان - 2008 کار انجام شد در بخش ترکیبات مولکولی بالا و عناصر آلی مؤسسه شیمی به نام. ایالت A. M. Butlerov..."

Vilesov Alexander Sergeevich تشعشع - سنتز شیمیایی اشکال پلیمری فسفر در محیط های مختلف 02.00.01. – شیمی معدنی چکیده پایان نامه برای درجه علمی کاندیدای علوم شیمی مسکو 2009 این کار در موسسه شیمی و مشکلات توسعه پایدار دانشگاه شیمی-تکنولوژی روسیه به نام D.I. مندلیوا ناظر علمی: عضو مسئول آکادمی علوم روسیه، دکترای علوم شیمی، پروفسور ناتالیا پاولونا تاراسووا رسمی..."

«اسلووخوتوف یوری لئونیدوویچ ساختار اتمی و ویژگی‌های شیمی کریستال مشتقات جدید فولرن‌ها 02.00.03 – شیمی آلی 02.00.04 – شیمی فیزیک چکیده کار پایان‌نامه دکترای علوم 2 در مسکو انجام شد. ترکیبات ارگانو عنصری به نام A.N. Nesmeyanov دکترای علوم شیمی آکادمی روسیه، رسمی..."

«Varnavskaya Olga Alekseevna خصوصیات فیزیکی-شیمیایی ترکیب نئودیمیم (III) و EUROPIUM (III) با 2،2-DIPIRIDILINE در محیط های آلی در محیط های ارگانیک OF DIFFERENT of physics0hemry40ssert. برای درجه علمی کاندیدای علوم شیمی تومسک - 2010 کار انجام شده در دانشگاه ایالتی آلتای، بارنائول سرپرست علمی: نامزد علوم شیمی، دانشیار Smagin Vladimir Petrovich مخالفان رسمی: دکتر...

طیف سنجی جرمی کراسنووا تاتیانا الکساندرونا با واجذب/یونیزاسیون لیزری فعال ماتریسی (سطحی) در شناسایی و تعیین الیگومرهای پلی سولفونیک، پلی کربوکسیلیک اسیدها و آنتی بیوتیک ها 02.00.02 - شیمی تجزیه و تحلیل علمی - 2013 این کار در بخش شیمی دانشگاه دولتی ولادیمیر به نام الکساندر گریگوریویچ و نیکولای گریگوریویچ انجام شد..."

"تخصص تجزیه و تحلیل 02.00.02 - شیمی تحلیلی چکیده پایان نامه برای درجه کاندیدای علوم شیمی تومسک - 2012 www.sp-department.ru این کار در موسسه آموزشی بودجه ایالتی فدرال تحقیقات ملی آموزش عالی حرفه ای انجام شد. .."

«اسمیرنوف الکسی الکساندرویچ فرآیندهای فیزیکی و شیمیایی در پلاسمای دمای پایین غیرتعادل HBr و مخلوط‌های آن با آرگون، هلیوم و هیدروژن 02.00.04 – نامزد فیزیکال فیزیک و درجه فیزیک ایوانوو 2010 کار انجام شده در موسسه آموزشی دولتی آموزش عالی حرفه ای دانشگاه فناوری شیمی دولتی ایوانوو. ناظر علمی: دکترای علوم شیمی، پروفسور افرموف الکساندر میخائیلوویچ مخالفان رسمی:..."

«VASYUTIN Oleg Alekseevich RESEARCH OF THE INFLUENCE OF SYNTHESIS CONDITIONS ON THE ADSORPTION PROPERTIES OF FERROSPINEL AND SURFACE PROPERTIES OF YTRIUM FERROGARNET BY METHODS OF POTENTYI 10 WETTENTYOMING – 10 و 20 ویژه پتانسیل. istry چکیده پایان نامه برای درجه علمی کاندیدای علوم شیمی خ پترزبورگ 2012 این کار در گروه شیمی کلوئیدی دانشکده شیمی سنت پترزبورگ انجام شد.

"ملنیکووا تاتیانا ایگورونا توسعه چارچوب های نظری و تجربی برای تعیین ترکیب و ویژگی های ساختاری بورات ها و سیلنیت های بیسموت تخصص 02.00.21 A 2011 کار تکمیل و در بخش فیزیک و شیمی حالت جامد، دانشگاه دولتی مسکو هنرهای زیبا فناوری های شیمیایی به نام M.V. لومونوسوف ناظر علمی: دکتر...

“Starostina Irina Alekseevna برهمکنش های اسید و باز پلیمرها و فلزات در ترکیبات چسب 02.00.06 – ترکیبات مولکولی بالا چکیده پایان نامه برای درجه دکتری علوم شیمی کازان - 2011 کار انجام شد. در موسسه آموزشی بودجه دولتی فدرال ملی کازان دانشگاه فناوری تحقیقاتی آموزش عالی حرفه ای مشاور علمی دکترای علوم فنی، پروفسور اولگ ولادیسلاوویچ استویانوف، دکتر مخالفان رسمی...

«واسیلیف ولادیمیر پتروویچ SPECTRAL - LUMINESCENCE STUDY OF INTERMOLECULAR INTERACTIONS do METALLOCENE Complexes Zr and Hf in Solutions 02.00.04. - شیمی فیزیک چکیده پایان نامه برای درجه کاندیدای علوم شیمی Chernogolovka - 2008 این کار در مؤسسه مسائل فیزیک شیمی آکادمی علوم روسیه و مؤسسه آموزشی دانشگاه فدرال جنوبی انجام شد سرپرست علمی: نامزد رسمی علوم شیمی لوکووا گالینا ویکتورونا..."

"اسپانچنکو اولگا والریوانا توپوگرافی عملکردی ماده حمل و نقل RNA 02.00.10 - شیمی بیو ارگانیک چکیده پایان نامه برای درجه دکتری علوم شیمی مسکو - 2010 2 این کار در گروه شیمی شیمی طبیعی انجام شد. ایالت مسکو...»

"KOSHELEV Ekaterina Valentinovna SOLID ELECTROLYTES IN CaY2S4-Yb2S3 and Phyb2S4-Y2S3 SYSTEMS تخصص: 02.00.05 – الکتروشیمی چکیده پایان نامه برای درجه علمی کاندیدای علوم شیمی -2 دانشکده علوم شیمی 20 انجام شد. ical شیمی مؤسسه آموزشی بودجه ایالتی فدرال دانشگاه ایالتی V PA Vyatka، کیروف کالینینا لیودمیلا آلکسیونا، ناظر علمی: کاندیدای علوم شیمی، دانشیار دانشگاه ایالتی ویاتکا، ...

"Ekaterina Konstantinovna Lavrentyeva قالب در سیستم های حاوی خاک رس به عنوان روشی برای کنترل خواص جاذب های پلیمری-کامپوزیت و الکتروکاتالیست های پلاتین تخصص: 02.00.06 - ترکیبات مولکولی بالا 02.00.05 - الکتروشیمی چکیده درجه علمی نامزد پایان نامه علوم فیزیکی و ریاضی مسکو – 2009 کارهای انجام شده در گروه فیزیک...”

Evgenia Viktorovna Korchagina تجمع کیتوزان و مشتقات آن در محلول های آبی رقیق شده 02.00.06 – ترکیبات مولکولی بالا، علوم فیزیکی و ریاضی و چکیده پایان نامه برای درجه علمی کاندیدای علوم فیزیکی و ریاضی انجام شد. در گروه فیزیک پلیمرها و بلورهای دانشکده فیزیک و دانشگاه دولتی مسکو..."

"Vorobeva Ekaterina Georgievna مجتمع های کایرال پالادیوم بر اساس مشتقات حاوی نیتروژن از مونوترپنوئیدهای طبیعی 02.00.03 - شیمی آلی چکیده پایان نامه انجام شده در پایان نامه برای درجه علمی Chem10 انجام شده است. از روسی موسسه شیمی علوم آکادمی مرکز علمی کومی شعبه اورال آکادمی علوم روسیه و در گروه شیمی FSBEI HPE دانشگاه ایالتی سیکتیوکار. ناظر علمی: اولگا زالوسکایا...”

"Rykunov Alexey Aleksandrovich قابلیت حمل و نقل کوانتومی-توپوولوژیکی توصیفگرهای اتمی و پیوندی در طیف وسیعی از هیدروپیریمیدین های جایگزین تخصص 02.00.04 - شیمی فیزیک - شیمی فیزیک 1 چکیده کار علمی در مسکو تکمیل شده در وزارت کوانتوم شیمی، دانشکده علوم طبیعی، دانشگاه شیمی-تکنولوژی روسیه. . DI. مندلیف استاد راهنمای علمی: دکترای علوم فیزیک و ریاضی، پروفسور...

کورشون ولادیمیر آرکادیویچ نوکلئوزیدهای پیریمیدین و واکنشگرهای غیر نوکلئوزیدی را در سنتز مزدوج‌های الیگونوکلئوتیدی اصلاح کرد، ویژگی‌های آنها و کاربرد آن‌ها 02.00-2010 علوم شیمی مسکو - 2012 این کار در انجام شد گروه مهندسی ژنتیک اینترلوکین، آزمایشگاه مکانیسم‌های بیان ژن، آزمایشگاه شیمی اسید نوکلئیک، آزمایشگاه سنتز آلی و گروه...

رونوشت

1 دانشگاه دولتی NOVOSIBIRSK دانشکده علوم طبیعی گروه شیمی تجزیه کار دوره پیش بینی حجم احتباس و طیف UV پپتیدها در فاز معکوس HPLC تکمیل شده توسط: Kuchkina A.Yu., gr. 147 استاد راهنما: دکتری. آزارووا I.N. نووسیبیرسک-2005

2 مطالب 1. مقدمه بررسی ادبیات 2.1. پپتیدها اسیدهای آمینه پپتیدهای HPLC پیش بینی حجم احتباس و طیف UV پپتیدها در RP HPLC بخش تجربی نتایج و بحث 4.1. مانیتورینگ پایداری سیستم کروماتوگرافی محاسبه حجم های نگهداری پپتید مدل خطی "حفظ ترکیب" مدل غیرخطی "حفظ ترکیب" محاسبه طیف UV پپتیدها نتیجه گیری ادبیات پیوست

3 1. مقدمه شناسایی پروتئین های فعال در سلول های زنده بر اساس اطلاعات شناخته شده در مورد ساختار ژنوم، پروتئومیکس، یکی از مهم ترین وظایف زیست شناسی مولکولی مدرن در نظر گرفته می شود. این مشکل پس از رمزگشایی کامل ژنوم برخی از موجودات در چند سال گذشته به وجود آمده است. مشخص شد که ژنوم ها پروتئین های بسیار بیشتری نسبت به تولید بدن آنها را رمزگذاری می کنند. شناسایی پروتئین مورد نظر در مجموع همه پروتئین ها یک کار روش شناختی پیچیده است که معمولاً با روش مستقیم قابل حل نیست. یکی از روش‌های حل این نوع مشکل که پپتیدومیکس نامیده می‌شود، این است که مجموع پروتئین‌ها با یک پروتئاز خاص هیدرولیز می‌شوند و مجموع پپتیدهای حاصل با الکتروفورز مویرگی یا کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) جدا می‌شوند. هدف نهایی این است که یک پپتید (پپتید) با یک ساختار شناخته شده را شناسایی کنیم، که به طور پیشینی قطعه ای از پروتئین است که توسط ژنوم ارگانیسم مورد مطالعه رمزگذاری شده است. اگر چنین پپتید(هایی) در نمونه ای شناسایی شود، نتیجه گیری می شود که پروتئین توسط بدن تولید می شود. مشکلات روش شناختی که هنگام حل مسائل از این نوع به وجود می آیند را می توان به 2 گروه تقسیم کرد. اولین مشکل جداسازی مخلوطی است که معمولاً از چندین هزار پپتید تشکیل شده است. دوم تعیین ساختار پپتیدهای منفرد جدا شده است. مشکل جداسازی با تکه تکه کردن مخلوط اولیه و سپس جداسازی کسرهای جدا شده به اجزای جداگانه حل می شود. مشکل دوم عمدتاً با روش های طیف سنجی جرمی حل می شود که در نهایت امکان تعیین جرم مولکولی اجزای جداگانه (پپتیدها) را فراهم می کند. اگر یک پپتید دارای ساختار نسبتاً "یکتا" (مجموعه ای از اسیدهای آمینه) باشد - این پپتیدها معمولاً شامل پپتیدهای طولانی (بیش از بقایای اسید آمینه) هستند - وزن مولکولی آن نیز "منحصر به فرد" خواهد بود و احتمال شناسایی اشتباه ناچیز می شود. . از آنجایی که هدف از روش جداسازی پپتید جداسازی یک پپتید با مجموعه ای از اسیدهای آمینه شناخته شده است، این سوال مطرح می شود: آیا با دانستن ترکیب اسید آمینه آن می توان زمان انتشار چنین پپتید را از ستون HPLC پیش بینی کرد؟ این رویکرد برای اولین بار در اوایل دهه 80 نشان داده شد. هدف از این مطالعه توسعه روشی برای پیش‌بینی حجم احتباس پپتیدها بر روی کروماتوگرافی Milichrom A-02 در حالت HPLC فاز معکوس (RP HPLC) با استفاده از فاز متحرک مناسب برای تزریق مستقیم به طیف‌سنج جرمی بود. 3

4 2. بررسی ادبیات 2.1. پپتیدها اسیدهای آمینه پپتیدها بیوپلیمرهایی هستند که از بقایای اسیدهای آمینه α ساخته شده اند که توسط پیوندهای پپتیدی (-NH-CO-) به یکدیگر متصل شده اند. فرمول کلی یک پپتید را می توان به صورت زیر ارائه کرد: NH 2 CH CO NH CH CO... NH CH R 1 R 2 Rn مرز مشخصی بین پروتئین ها و پپتیدها وجود ندارد؛ به عنوان یک قاعده، پپتیدها شامل بیوپلیمرهایی هستند که حاوی بیش از 100 باقی مانده اسید آمینه اسیدهای آمینه به هر اسید آلی گفته می شود که مولکول های آن شامل یک گروه آمینه است؛ این نام اغلب به معنای اسیدهای آمینه α است، زیرا آنها اهمیت بیولوژیکی مهمی دارند. مولکول های اکثر اسیدهای آمینه طبیعی که پروتئین ها را تشکیل می دهند دارای فرمول کلی H 2 NCH R هستند همانطور که از فرمول ساختاری مشخص است، اسیدهای آمینه (به استثنای پرولین) فقط در ساختار زنجیره جانبی R با یکدیگر تفاوت دارند. اسیدهای آمینه ترکیبات آمفوتری هستند، زیرا مولکول های آنها دارای هر دو گروه کربوکسیل اسیدی و گروه آمینه بازی هستند. در یک محیط به شدت اسیدی، گروه کربوکسیل عمدتاً تفکیک نشده است و گروه آمینه پروتونه می شود. در یک محیط شدیدا قلیایی، گروه آمینه به شکل یک باز آزاد و گروه کربوکسیل به شکل یک آنیون کربوکسیلات است. در حالت کریستالی، اسیدهای آمینه به شکل زوئیتریون وجود دارند که در آن یک پروتون از گروه کربوکسیل به گروه آمینه منتقل می شود. تنها 20 اسید آمینه در بیوسنتز پپتیدها و پروتئین های طبیعی نقش دارند. اسیدهای آمینه و خواص آنها در جدول 1 آورده شده است. جدول 1. اسیدهای آمینه و خواص آنها. نام اسید آمینه کد ساختار p a - -NH 2 -R گلیسین G H 2.35 9.78 آلانین A H 3 C 2.35 9.87 والین V H 3 C CH CH 3 2.29 9.74 4

5 نام آمینواسید کد ساختار p a - -NH 2 -R لوسین L H 3 C CH CH 3 2.33 9.74 ایزولوسین I H 3 C * CH CH 3 2.32 9.76 H 2 C پرولین P HC NH 1.95 10.64 CH CH 3. NH 2 2.46 9.41 تیروزین Y HO CH NH 2 2.20 9.21 10.46 سرین S HO 2.19 9.21 ترئونین T HO * CH CH 3 2.09 9.10 سیستئین C HS 1.92 OC HS 1.92 اسید 9.09.7 10.9. 3.36 گلوتامیک اسید E HOOC 2.10 10.47 4.07 آسپاراژین N H 2 N C O 2.14 8.72 گلوتامین Q H 2 N C O 2.17 9.13 لیزین K H 2 N 2.16 9.06 10.54 آرژنین R H 2 N C NH 1.82 8.99 12.48 NH هیستیدین 12.48 NHHistidine H 2 N3 N8 C S 2.13 9.28 5

6 بسته به ماهیت زنجیره های جانبی، اسیدهای آمینه به دو گروه تقسیم می شوند: اسیدهای آمینه با گروه های آلیفاتیک غیر قطبی (آب گریز) یا آروماتیک. اسیدهای آمینه با گروه های R قطبی (آب دوست). گروه اول شامل 8 اسید آمینه است: آلانین، والین، لوسین، ایزولوسین، متیونین، پرولین، فنیل آلانین، تریپتوفان. هفت اسید آمینه حاوی گروه هایی در زنجیره جانبی هستند که می توانند بار منفی یا مثبت را حمل کنند: اسیدهای آسپارتیک و گلوتامیک در pH 7.0 بار منفی دارند. لیزین، آرژنین، هیستیدین اسیدهای آمینه پایه ای هستند که زنجیره های جانبی آنها می تواند بار مثبت داشته باشد. در شرایط قلیایی، گروه های جانبی تیروزین و سیستئین پپتیدهای HPLC می توانند بار منفی داشته باشند.جداسازی مخلوط پپتیدها کار بسیار دشواری است. در حال حاضر RP HPLC مهمترین روش برای جداسازی پپتیدها است. پپتیدها مواد قطبی هستند که از برهمکنش آنها با سطح آبگریز فاز ساکن جلوگیری می کند و منجر به برهمکنش با گروه های باقیمانده سیلانول می شود. به منظور کاهش اثر متقابل با گروه های سیلانول، اسیدها یا نمک های قوی به شوینده اضافه می شود. برای کاهش قطبیت پپتیدها، کروماتوگرافی باید در مقادیر pH پایین (زیر 3) انجام شود. اگر این اصول رعایت شود، HPLC ثابت می کند که یک روش بسیار انعطاف پذیر برای جداسازی پپتیدها است. این به دلیل این واقعیت است که این روش با سرعت جداسازی بالا، تکرارپذیری نتایج و توانایی تجزیه و تحلیل مقادیر میکروگرم مواد مشخص می شود. مزیت دیگر RP HPLC توانایی جمع آوری کسری در حجم کمی از حلال های فرار است که تجزیه و تحلیل طیف سنجی جرمی بیشتر را ساده می کند. به عنوان یک قاعده، 0.1٪ اسیدهای تری فلوئورواستیک و فرمیک به عنوان حلال های فرار استفاده می شود. تری فلورواستیک اسید در ناحیه UV تا 205 نانومتر شفاف است که در کروماتوگرافی مخلوط های پیچیده یک مزیت بزرگ است. علاوه بر این، پپتیدها در اسید تری فلورواستیک بسیار محلول هستند. شستشوی پپتیدها از فازهای معکوس معمولاً در حالت گرادیان با افزودن یک اصلاح کننده آلی انجام می شود. رایج ترین اصلاح کننده آلی استونیتریل است. در ناحیه UV تا 200 نانومتر شفاف است و گزینش پذیری خوبی دارد. 6

عامل دیگری که باعث استفاده گسترده از RP HPLC برای تجزیه و تحلیل پپتیدها می شود، توانایی پیش بینی رفتار کروماتوگرافی آنها است. پیش بینی حجم نگهداری و طیف UV پپتیدها در RP HPLC. می توان با دانستن ترکیب اسید آمینه آنها، که اولین بار توسط J. Meek بیان شد، پیش بینی کرد. حفظ پپتیدها در فاز معکوس با آبگریزی باقی مانده اسیدهای آمینه موجود در ترکیب آنها تعیین می شود. اسیدهای آمینه با زنجیره های آروماتیک یا آلیفاتیک بزرگ، عوامل اصلی ماندگاری هستند. بر اساس موارد فوق، میک پیشنهاد کرد که حجم احتباس پپتیدها در فاز معکوس به عنوان مجموع سهم باقیمانده‌های اسید آمینه تشکیل دهنده پپتید محاسبه شود. او یک مدل خطی (افزودنی) "حفظ ترکیب" پیشنهاد کرد: VR = V 0 + Z N* + Z C* + Z i (1) که در آن VR حجم نگهداری پپتید؛ v 0 حجم آزاد ستون است. Z N * و Z C * به ترتیب سهم -NH2 و - یا گروه های پایانی اصلاح شده پپتید هستند. Z i سهم i-امین اسید آمینه (ثابت احتباس) است. میک 25 پپتید را تحت شرایط گرادیان RP HPLC کروماتوگرافی کرد و با حل مشکل معکوس، ثابت نگهداشت اسید آمینه را محاسبه کرد. ضرایب همبستگی وابستگی VR (محاسبه)=f(vR (تبصره)) 0.997 (در ph 2.1) و 0.999 (در ph 7.4) بود. علی‌رغم ضرایب همبستگی بالا، این مدل با معنای فیزیکی در تضاد است، زیرا ثابت‌های احتباس اسید آمینه به‌دست‌آمده از این طریق، تفاوت‌های واقعی را در آبگریزی آنها منعکس نمی‌کنند و برخی از مشارکت‌ها دارای مقادیر منفی هستند. علاوه بر این، حقایق زیادی وجود دارد که بر اساس آن، با افزایش تعداد باقی مانده‌های اسید آمینه در یک پپتید، سطح تماس آبگریز آن با فاز معکوس، که احتباس را تعیین می‌کند، به صورت غیرخطی افزایش می‌یابد. نویسندگان این کار همچنین این فرض را مطرح کردند که حجم نگهداری پپتیدها از مجموع سهم باقی مانده های اسید آمینه محاسبه می شود. برای محاسبه حجم نگهداری پپتیدها، آنها مدل زیر را پیشنهاد کردند: VR = A* ln (1+ Z j * n j) + B (2) 7

8 که در آن Z j پارامتر حفظ تجربی است که بر اساس آبگریزی اسیدهای آمینه محاسبه می شود. ثابت های A و B؛ n j تعداد باقی مانده اسید آمینه j در پپتید است. این مدل همبستگی خوبی بین حجم احتباس پپتید محاسبه شده و تجربی فراهم می کند. نقطه ضعف مدل این است که فقط برای یک سیستم کروماتوگرافی خاص (شیب خطی با شیب معین، سرعت جریان ثابت، فازهای متحرک و ثابت) معتبر است. بنابراین، کاربرد این مدل بسیار محدود است. بنابراین، نویسندگان کار مورد بررسی، مدل دیگری را بر اساس تئوری شستشوی گرادیان پیشنهاد کردند، که به فرد اجازه می‌دهد تا حجم نگهداری پپتیدها را برای طیف وسیع‌تری از سیستم‌های کروماتوگرافی محاسبه کند. با توجه به اینکه سطح موجود تماس آبگریز پپتید با فاز ساکن متناسب با وزن مولکولی آن به توان 2/3 متفاوت است، نویسندگان تابعی را برای محاسبه حجم نگهداری پپتیدها انتخاب کردند: VR = f (3 ) که در آن a، b، c ثابت هستند بسته به خواص یک سیستم کروماتوگرافی خاص به طور تجربی از داده های کروماتوگرافی 15 پپتید انتخاب شده برای این منظور تعیین شدند. ضریب همبستگی وابستگی VR (محاسبه)=f(vR (تبصری)) 0.98 بود. یک اشکال مهم که استفاده از این روش را محدود می‌کند، نیاز به محاسبه ثابت‌های a، b و c برای یک سیستم کروماتوگرافی خاص از آزمایش‌های اولیه با پپتیدهای مدل است که یک روش بسیار کار فشرده است. این کار حجم احتباس و طیف UV پپتیدها را با یک توالی اسید آمینه شناخته شده محاسبه کرد، که قبلاً سهم اسیدهای آمینه را در پارامترهای فوق تعیین کرده بود. مقادیر این مشارکت‌ها به‌طور تجربی از کروماتوگرام‌های محلول‌های اسیدهای آمینه منفرد به‌دست‌آمده با تشخیص نورسنجی چند طول موجی تحت شرایط مشابهی که تحت آن پپتیدها کروماتوگرافی شدند، پیدا شد. نویسندگان کار معادله زیر را برای محاسبه حجم احتباس پپتیدها پیشنهاد کردند: VR = 209 [(Z i) + Z C*+N* + V 0 ] 1/3 990 (4) که در آن Z i ضریب حفظ است. اسید آمینه "i"؛ V 0 حجم آزاد ستون؛ Z C*+N* ثابت کل گروههای انتهایی پپتید است. هنگام محاسبه طیف UV پپتیدها، طیف پپتید به عنوان مجموع طیف تمام عناصر ساختاری آن در نظر گرفته شد. برای آزمایش روش پیشنهادی 8 مورد وجود داشت

9، 30 پپتید کروماتوگرافی شدند و ضریب همبستگی بین حجم نگهداری محاسبه شده و تجربی یافت شده 0.95 بود. روش پیشنهادی برای محاسبه طیف UV پپتیدها نیز قدرت پیش‌بینی رضایت‌بخشی دارد. در این کار، استونیتریل و محلول آبی پرکلرات لیتیوم (0.2 مولار LiCLO M HClO 4)، که یک ماده غیرفرار است، به عنوان شوینده استفاده شد که شناسایی طیف سنجی جرمی بعدی پپتیدها را بسیار دشوار می کند. بنابراین، برای ما مناسب به نظر می رسید که روشی با استفاده از فاز متحرک ترکیب استونیتریل - اسید تری فلورواستیک ایجاد کنیم، که همه اجزای آن مواد فرار هستند و با تجزیه و تحلیل طیف سنجی جرمی تداخل ندارند. 9

10 3. HPLC تجربی بر روی کروماتوگرافی Milichrome A-02 روی یک ستون 2x75 میلی متری با فاز ProntoSIL C 18 AQ (Bischoff Analysentechnik und Geräte GmbH، آلمان) تحت شرایط زیر انجام شد: شوینده A: 0.01 مولار اسید تری فلورواستیک؛ شوینده B: استونیتریل. گرادیان خطی: 40 دقیقه از 5 تا 100% B. سرعت جریان: 100 میکرولیتر در دقیقه. دمای ستون: 40 درجه سانتیگراد; تشخیص: در 210، 220، 230، 240، 250، 260، 280 و 300 نانومتر، τ = 0.18 ثانیه. حجم نمونه: 4 میکرولیتر راه حل برای آزمایش سیستم کروماتوگرافی: KBr - 0.2 mg/ml. یوریدین - 0.2 میلی گرم در میلی لیتر؛ کافئین - 1 میلی گرم در میلی لیتر؛ m-nitroaniline - 0.1 میلی گرم در میلی لیتر؛ o-نیتروآنیلین-0.1 میلی گرم در میلی لیتر؛ حلال 2% استونیتریل در آب. همه معرف ها با کسر جرمی از ماده اصلی حداقل 98٪. اسیدهای آمینه (Serva، آلمان)، استونیتریل "گرید 0" (NPF "Kriochrome"، سنت پترزبورگ)، و اسید تری فلورواستیک بی آب (ICN Biomedicals، USA) در کار استفاده شد. نمونه های پپتید با مهربانی توسط V.V ارائه شد. ساموکوف (NPO "وکتور"، نووسیبیرسک) و I.V. نازیموف (IBCh RAS، مسکو). غلظت اسیدهای آمینه در محلول های کروماتوگرافی 0.2 1 mg/ml، پپتیدها 0.1 2 mg/ml بود. کروماتوگرام ها با استفاده از برنامه Multichrome (Ampersend JSC، مسکو) پردازش شدند. برای محاسبه VR، نواحی پیک‌های کروماتوگرافی هنگام شناسایی در 8 طول موج (S λ) و نمایش گرافیکی کروماتوگرام‌های پپتیدی، از برنامه "CHROM P" (موسسه کروماتوگرافی ZAO "EkoNova"، نووسیبیرسک) استفاده شد. خطی سازی منحنی نشان داده شده در شکل 1 با استفاده از برنامه Microsoft Excel (Microsoft Corporation) انجام شد. 10

11 4. نتایج و بحث آنها 4.1. پایش پایداری سیستم کروماتوگرافی پایداری سیستم کروماتوگرافی با استفاده از روشی که توسط روش تنظیم شده بود، پایش شد. محلول آزمایش کروماتوگرافی شد و 14 پارامتر از کروماتوگرام های به دست آمده محاسبه شد، که هر یک شاخص خاصی از سیستم کروماتوگرافی را کنترل می کند: VR حجم بدون یون برمید ستون. نسبت طیفی S 280 / S 250 یوریدین؛ دقت تنظیم آشکارساز در محدوده 250 تا 280 نانومتر. نسبت طیفی S 260 / S 280 محدوده خطی کافئین آشکارساز. نسبت طیفی S 260 /S 230 m - مناسب بودن نیترونیتروآنیلین شوینده A. پیک o-نیتروآنیلین برای کنترل استفاده شد: انحراف VR گرادیان از یک شکل معین، نسبت های طیفی، دقت تنظیم آشکارساز در محدوده 210 تا 300 نانومتر، عدم تقارن پیک نقض 10% در بسته بندی ستون، دقت دوز نمونه S 210. اندازه‌گیری‌های دوره‌ای پارامترهای کروماتوگرافی و طیفی محلول مدل به ما امکان می‌دهد تکرارپذیری عملکرد سیستم کروماتوگرافی مورد استفاده را تأیید کنیم. نتایج آزمایش در جدول 2 نشان داده شده است. جدول 2. نتایج آزمایش سیستم کروماتوگرافی، n = 8. پارامتر ماده 11 مقدار متوسط ​​پارامتر S r (%) برومید V R، µl 148 1.0 Uridine S 280 /S 250 0.53 1.3 Caffe S 260 /S 280 0.73 0.6 m-نیتروآنیلین S 260 /S 230 0.80 1.0 o-نیتروآنیلین V R، میکرولیتر، 6 S 220 /S 210 1.71 0.5 S 230 /S 210 1.720 / S 210 1.710 60 /S 210 0.58 0.9 S 250 /S 210 0.40 1.4 S 280 /S 210 0.59 0.9 S 300 /S 210 0.32 1.2 A 10% 1.05 1.1 سیگنال خروجی (پیک ناحیه e.21p، S. میکرولیتر 25.00 1.4

12 مقادیر بدست آمده از Sr به ما اجازه می دهد تا در مورد پایداری سیستم کروماتوگرافی توصیف شده نتیجه گیری کنیم. محاسبه حجم احتباس پپتید. پپتیدهای GG و GGG تحت شرایط مشخص شده در بخش 3. ضرایب حفظ اسید آمینه با استفاده از معادله محاسبه شده است: Z i = V Ri V 0 Z C*+N* (5) که در آن V Ri حجم نگهداری اسید آمینه "i" است. V 0 حجم آزاد ستون (حجم حفظ Br -، در این سیستم کروماتوگرافی 148 میکرولیتر بود). Z C+N ثابت کل گروه های انتهایی پپتید است. Z C+N با استفاده از معادله محاسبه شد: Z C*+N* = V R (G) V 0 ((6) که در آن V R (G) حجم نگهداری گلیسین، میکرولیتر؛ V R (GGG) و v R (GG) است. حجم احتباس پپتیدهای GGG و GG است، میکرولیتر مجموع ضرایب نگهداری گروه‌های انتهایی [(-NH 2) + (-CONH 2)] برابر با مجموع ضرایب نگهداری گروه‌ها در نظر گرفته شد [(- NH 2) + (-)]. داده های کروماتوگرافی و ثابت های نگهداری محاسبه شده عناصر ساختاری پپتیدها در جدول 3 آورده شده است. , μl Z i, μl کد V R, μl Z i, μl N P S V G M Q Y D I H L T F E W K GG C GGG A (C*+N*) پایان - 25 R

13 مدل خطی "نگهداری ترکیب" برای پیش بینی حجم نگهداری پپتیدها در چارچوب مدل خطی پیشنهاد شده در کار، حجم نگهداری 28 پپتید (جدول 4) را محاسبه کردیم و داده های به دست آمده را با داده های تجربی مقایسه کردیم (شکل 1). جدول 4. حجم احتباس پپتید به طور تجربی پیدا و محاسبه شده است (مدل خطی). پپتید V R (مصرف)، میکرولیتر V R (محاسبه)، میکرولیتر 1 GG GGG AS GRGDS TKPR WAGGDASGE GL MY KPVGKKKRRPVKVYP W-D-YGGDASGE W-D-AGGDA NCMLDY SYSMEHFRWGDA NCMLDY SYSMEHFRWKGDAFW-D-VGRF RVYIHPF YGGFLRRIRP KLK YGGFM DRVYIHPF QATVGDINTERPGMLDFTGK ELYNKRPRRPYIL DRVYIHPFHL Y-D-AGFL RPKPQQFFGLM -NH PQQFFGLM-NH GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ-NH

14 ولت VR R (محاسبه)، میکرولیتر VR (توضیحات)، R µl شکل. 1. مقایسه حجم نگهداری پپتید به طور تجربی پیدا شده و محاسبه شده. محاسبه مقادیر VR طبق رابطه (1) انجام شد. همانطور که از داده های به دست آمده مشاهده می شود، مدل خطی نتایج رضایت بخشی را فقط برای پپتیدهای نسبتا آبدوست می دهد. برای پپتیدهای آبگریز، مقادیر محاسبه شده به طور قابل توجهی بالاتر از مقادیر تجربی است. نتایج مشابهی در کار مدل «حفظ ترکیب» غیرخطی خطی‌سازی منحنی نشان‌داده‌شده در شکل. 1 معادله را نشان می دهد: VR = 173 [(n Z i) + V 0] 1/3 785 (7) مقایسه مقادیر محاسبه شده و حجم های نگهداری تجربی یافت شده برای 28 پپتید در جدول 5 و شکل نشان داده شده است.

15 ولت R (محاسبه)، میکرولیتر VR VR (مقطع)، µl V R شکل. 2. مقایسه حجم نگهداری پپتید به طور تجربی یافت شده و محاسبه شده. محاسبه مقادیر VR طبق رابطه (7) انجام شد. 15

16 جدول 5. حجم احتباس پپتید به صورت تجربی پیدا و محاسبه شده است (مدل غیرخطی). پپتید V R (مصرف)، میکرولیتر V R (محاسبه)، میکرولیتر 1 GG GGG AS GRGDS TKPR WAGGDASGE GL MY KPVGKKKRRPVKVYP W-D-YGGDASGE W-D-AGGDA NCMLDY SYSMEHFRWGDA NCMLDY SYSMEHFRWKGDAFW-D-VGRF RVYIHPF YGGFLRRIRP KLK YGGFM DRVYIHPF QATVGDINTERPGMLDFTGK ELYNKRPRRPYIL DRVYIHPFHL Y-D-AGFL RPKPQQFFGLM -NH PQQFFGLM-NH GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ-NH ضریب همبستگی وابستگی VR (محاسبه.)=f(v R (exp.)) 0.96 بود. ضمیمه کروماتوگرام های تجربی و محاسبه شده یک مخلوط مدل از 11 پپتید را نشان می دهد. 16

17 4.3. محاسبه طیف UV پپتیدها ضرایب طیفی خاص عناصر ساختاری پپتیدها از کار گرفته شد، زیرا در سیستم کروماتوگرافی که ما استفاده می کنیم، محاسبه صحیح نسبت های طیفی توسط پیک های سیستمیک و همچنین حفظ ضعیف اسیدهای آمینه آبدوست و پپتیدهای کوتاه مختل می شود. مقادیر ضرایب طیفی خاص در جدول 6 آورده شده است. جدول 6. ضرایب طیفی عناصر ساختاری جذب کننده UV پپتیدها به عنوان مساحت پیک های کروماتوگرافی در C = 1 میلی متر و حجم نمونه 4 میکرولیتر، ( e.o.p. μl). λ، نانومتر W F Y H C M R Q N E D N*+C* PS که در آن S C*+N* ضرایب طیفی مجموع گروههای (-NH+ -) پپتید، SPS جذب پیوند پپتیدی. ویژگی های طیفی پپتیدها به عنوان مساحت پیک های کروماتوگرافی آنها در C = 1 میلی مولار و حجم نمونه 4 میکرولیتر با استفاده از رابطه: a λ پپتید = a λ N*+C* + (m-1) a محاسبه شد. λ λ PS + a i (9) که در آن m مجموع تعداد باقی مانده‌های اسید آمینه در پپتید است، λ N*+C* ناحیه پیک شرطی گروه‌های انتهایی پپتید است و λ PS همان مقدار خاص است. جذب پیوند پپتیدی در طول موج λ λ، و i ویژگی های طیفی باقی مانده اسید آمینه برای طول موج λ است. مقادیر موجود در رابطه (9) به صورت زیر بدست آمد. ویژگی های طیفی خاص عناصر ساختاری پپتیدها در طول موج λ=210 نانومتر (a 210 i) به عنوان مساحت پیک های کروماتوگرافی آنها برای محلولی با غلظت 1 میلی مولار و حجم نمونه 4 میکرولیتر محاسبه شد. به معادله: a 210 i = a 210 AA a 210 N*+C *، (10) که در آن AA 210 منطقه اوج اسید آمینه است. a 210 N*+C* ناحیه پیک معمولی گروه های انتهایی پپتید است. مقدار 210 N*+C* برابر با 210 Leu در نظر گرفته شد، زیرا گروه های NH2 تنها کروموفورهای Leu در محدوده طول موج نانومتر هستند. 17

18 جذب ویژه پیوند پپتیدی (a 210 PS) به عنوان تفاوت بین جذب ویژه پپتیدهای GGG و GG محاسبه شد: a 210 PS = a GGG a GG (11) ویژگی های طیفی برای طول موج λ با استفاده از معادله محاسبه شد. : a λ i = a 210 i (S λ / S 210)، (12) که در آن S λ / S 210 نسبت های طیفی اسیدهای آمینه و پپتیدهای GG و GGG هستند که نسبت مناطق پیک در طول موج λ به منطقه اوج در λ = 210 نانومتر. جدول 7 مقایسه ای از نسبت های طیفی محاسبه شده S λ / S 210 برای 28 پپتید با آنهایی که به صورت تجربی به دست آمده را نشان می دهد. نسبت‌های طیفی به‌دست‌آمده و محاسبه‌شده تجربی از پپتیدها در تطابق نسبتاً خوبی با یکدیگر هستند. در بیشتر موارد، تفاوت ها بیشتر از 0.06 نیست. برای برخی از پپتیدها (5، 9، 12، 16، 18، 22، 23، 26، 27)، تفاوت های قابل توجه تری در نسبت های طیفی پیش بینی شده و تجربی مشاهده می شود. دلایل این تفاوت ها نیاز به تحقیقات بیشتری دارد. جدول 7. مقایسه مقادیر تجربی و محاسبه شده نسبت های طیفی پپتیدها. مقدار پپتید نسبت های طیفی S λ /S 210 برای طول موج λ(nm): Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp

19 مقدار پپتید نسبت های طیفی S λ /S 210 برای طول موج λ(nm): Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp Vych Exp

20 مقدار پپتید نسبت های طیفی S λ / S 210 برای طول موج λ(nm): Vt Exp V V Exp از داده های به دست آمده مشخص است که روش توصیف شده برای محاسبه حجم نگهداری پپتیدهای با ترکیب شناخته شده و طیف UV آنها در شرایط گرادیان RP HPLC قدرت پیش بینی رضایت بخشی دارد و ممکن است در مطالعات مربوط به جداسازی مخلوط پپتیدها مفید باشد. 20

21 5. نتیجه گیری 1. روشی توسعه داده شده است که پیش بینی حجم احتباس پپتیدها با ترکیب شناخته شده را در حالت گرادیان RP HPLC روی کروماتوگرافی Milicrome A-02 با استفاده از یک فاز متحرک فرار مناسب برای معرفی مستقیم فراکسیون های جدا شده ممکن می سازد. به یک طیف سنج جرمی 2. روشی برای محاسبه جذب نوری پپتیدها در طول موج های 210، 220، 230، 240، 250، 260، 280 و 300 نانومتر به طور مستقیم در فاز متحرک که برای جداسازی پپتیدها استفاده می شود، ایجاد شده است. 3. روش های توسعه یافته برای 28 پپتید مدل آزمایش شدند. ضریب همبستگی حجم های نگهداری محاسبه شده با مقادیر تجربی مربوطه 96/0 بود. اختلاف بین نسبت‌های طیفی محاسبه‌شده و تجربی به‌دست‌آمده S λ / S 210 بیش از 0 نبود، منابع 1. Reznikov V.A., Shteingarts V.D. آمینو اسید. نووسیبیرسک: NSU, S. Dawson R., Elliott D., Elliott W., Jones K. Handbook of a biochemist. مسکو: میر، ص. 3. اووچینیکوف یو.آ. شیمی بیورگانیک مسکو: روشنگری، ص. 4. کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا در بیوشیمی (ویرایش Henschen A.). مسکو: میر، ص. 5. میک جی.ال. //Proc. Natl. آکادمی علمی ایالات متحده آمریکا. 1980، V. 77. شماره 3. P Sakamoto Y.، Kawakami N.، Sasagawa T. // J. Chromatogr V P Sasagawa T.، Okuyama T.، Teller D.C. // J. Chromatogr V P Browne C.A., Bennet H.P.J., Solomon S. // Anal. Biochem V.124. P Meek J.L.، Rossetti Z.L. // J. Chromatogr V P Azarova I.N., Baram G.I., Goldberg E.L. // شیمی بیورگانیک. در مطبوعات. 11. غلظت انبوه مواد جاذب UV. روش انجام اندازه گیری با استفاده از کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا. FR Irkutsk

22 7. پیوست آزمایشی (A) و کروماتوگرام محاسبه شده (B) مخلوطی از 11 پپتید. تعداد پپتید مطابق با جدول A 0.5 e.o.p nm B nm حجم، میکرولیتر

وزارت آموزش و پرورش و علوم فدراسیون روسیه آژانس فدرال آموزش و پرورش دانشگاه دولتی نووسیبیرسک دانشکده علوم طبیعی گروه: پایان نامه شیمی تحلیلی

سخنرانی 1: ساختار اولیه پروتئین ها - اسیدهای آمینه 1 تنوع پروتئین ها بسیاری از عملکردهای بیولوژیکی بدن توسط پروتئین ها انجام می شود. این توابع شامل حمل و نقل و ذخیره سازی اکسیژن (هموگلوبین).

273 UDC 543. 544 جداسازی انانتیومرهای مشتق از اسیدهای آمینه روی β-سیکلودکسترین امین شده با روش کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا I. A. Ananyeva, E. N. A. Shapoval.

1. پیوندهای کووالانسی در پروتئین ها و آنزیم ها. مثال بزن. بلیط 1 2. اساس جداسازی پروتئین ها به روش شکنش در حضور غلظت های مختلف نمک چیست؟ این روش چه ناخالصی هایی را از بین می برد؟

مبحث 23. آمین ها. اسیدهای آمینه و پپتیدها محتوای موضوع: آمین ها، طبقه بندی و نامگذاری آنها. روش های تهیه و خواص شیمیایی آمین ها. آنیلین، ساختار الکترونیکی آن. وابستگی خواص اساسی

T.P. واویلووا A.E. مدودف کتاب درسی شیمی بیولوژیکی بیوشیمی حفره دهان وزارت آموزش و پرورش و علوم فدراسیون روسیه توصیه شده توسط موسسه آموزشی بودجه دولتی آموزش عالی حرفه ای "اولین دانشگاه دولتی پزشکی مسکو به نام

موسسه فیزیک و فناوری مسکو (دانشگاه دولتی) گروه فیزیک مولکولی و بیولوژیکی روش های تحقیق فیزیکی سخنرانی 9 کروماتوگرافی مایع روش ها و فناوری

وزارت بهداشت فدراسیون روسیه مقاله داروسازی Indapamide FS.2.1.0017.15 Indapamide Indapamidum Replaces FS 42-0303-08 N-[(2RS)-2-Methyl-ino-1-H] 3-سولفاموئیل-4-کلروبنزامید

آمینو اسید. پپتیدها. پروتئین ها اسیدهای آمینه اسیدهای کربوکسیلیک هستند که در آن یک یا چند اتم هیدروژن با گروه های آمینه در رادیکال هیدروکربنی جایگزین می شوند. بسته به موقعیت نسبی

بیوشیمی ویرایش شده توسط عضو مسئول آکادمی علوم روسیه، پروفسور E.S. نسخه 5 SEVERINA، کتاب درسی اصلاح شده و توسعه یافته توصیه شده توسط انجمن آموزشی و روش شناسی پزشکی و دارویی

1 آمینو اسیدها و پروتئین ها ساختار، خواص مارپیچ ها در بسیاری از زمینه ها یافت می شوند: در معماری، در ماکرومولکول های پروتئین ها، اسیدهای نوکلئیک و حتی در پلی ساکاریدها (Loretto hapel، Santa Fe، NM/Sarbo)

وزارت آموزش و پرورش و علوم مؤسسه آموزش عالی ایالتی فدرال روسیه "دانشگاه دولتی تحقیقات ملی نووسیبیرسک" دانشکده علوم طبیعی

APP NOTE-16/2016LC قابلیت های تحلیلی کروماتوگرافی مایع MaestroHPLC با آشکارساز پراکندگی نور تبخیری با دمای پایین MAESTRO ELSD با استفاده از مثال تعیین اسیدهای آمینه در هیدرولیز

8. سوالات 1. کروماتوگرافی را تعریف کنید. 2. چه ویژگی های کروماتوگرافی امکان دستیابی به جداسازی بهتر مواد با خواص مشابه را نسبت به سایر روش های جداسازی فراهم می کند. 3. فهرست کنید

وزارت آموزش و پرورش و علوم بودجه دولتی فدراسیون روسیه مؤسسه آموزش عالی حرفه ای «دانشگاه فنی دولتی نیژنی نووگورود به نام R.E.

1 ویژگی های ساختار، واکنش پذیری و روش های سنتز اسیدهای آمینه. پروتئین ها ترکیبی که دارای هر دو گروه عاملی اسیدی و گروه آمینه است، یک آمینو اسید است. اسید-باز

استفاده از ستون‌های کروماتوگرافی حذف اندازه Agilent AdvanceBio SEC برای تجزیه و تحلیل بیودارویی مقایسه ستون‌های چند تولیدکننده برای بهبود کیفیت داده بررسی کلی فنی

"آزمایشگاه کارخانه. تشخیص مواد" 4. 2007. جلد 73 23 UDC 543.544 تعیین اسیدهای آمینه در داروها با HPLC فاز معکوس با تشخیص آمپرومتریک M. G.

UDC 615.22.074: 543.544.5.068.7.062 اعتبار سنجی روش های تعیین کمی از trimetazidine dihydrochloride در 0.02 گرم قرص E. V. Kompantseva ، G. A. Martirosova ، M. G. Tsybulina Pyatatigorsk حالت

کروماتوگرافی فلش آماده سازی مدرن قسمت 2 * دکتر A. Abolin، "Galakhim" [ایمیل محافظت شده] P.-F. Icarus، Interchim (فرانسه) ما همچنان به انتشار مطالب در مورد روش های مدرن آماده سازی ادامه می دهیم

ضمیمه گواهی 44071 ورق 1 در مورد تایید نوع ابزار اندازه گیری شرح نوع ابزار اندازه گیری کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا "Milichrome A-02"، "Alphachrom A-02" ("Alphachrom A-02")

استاندارد دولتی روسیه موسسه تحقیقات سیبری شرقی موسسه اندازه گیری های فیزیکی و فنی و رادیو تکنیکال گواهی گواهی MVI 02-2002 روش شناسی برای انجام اندازه گیری های غلظت جرم

بخش 1 تعیین فواصل تکاملی و نرخ های تکامل توالی اسیدهای آمینه 1.1. مبانی نظری فاصله تکاملی بین توالی اسیدهای آمینه (p, d) میانگین

01/2016:20255 2.2.55. نقشه برداری پپتیدی نقشه برداری پپتیدی روشی برای شناسایی پروتئین ها، به ویژه پروتئین هایی است که توسط DNA نوترکیب تولید می شوند. روش شامل شیمیایی یا آنزیمی است

وزارت آموزش و پرورش و علوم فدراسیون روسیه بودجه دولتی فدرال موسسه آموزش عالی "دانشگاه دولتی تحقیقات ملی ساراتوف"

ترکیب پروتئین ها: اصول تشکیل 1. پیوندهایی که ترکیب مولکول های پروتئین را تعیین می کنند پیوندهای کووالانسی: پپتید دی سولفید برهمکنش های غیر کووالانسی: برهمکنش های یونی پیوند هیدروژنی

آژانس آموزش فدرال موسسه آموزشی دولتی آموزش عالی حرفه ای "دانشگاه ایالتی اورال به نام. صبح. گورکی" IONC "اکولوژی و مدیریت طبیعت"

وزارت بهداشت فدراسیون روسیه مقاله داروسازی Ketorolac trometamol FS.2.1.0022.15 Ketorolac trometamol Ketorolacum trometamolum Replaces GF XII, part 1, FS 2-5-72, FS 2-5-72 -1H- pyrrolysine-1-carboxylate

موسسه فیزیک و فناوری مسکو (دانشگاه دولتی) گروه فیزیک مولکولی و بیولوژیکی روش های تحقیق فیزیکی سخنرانی 8 آشکارسازها در کروماتوگرافی کروماتوگرافی مایع

وزارت بهداشت فدراسیون روسیه مقاله داروسازی Meloxicam FS.2.1.0025.15 Meloxicam Meloxicamum Instead of GF XII, part 1, FS 42-0254-07 4-Hydroxy-3-methylazy-(2-5-methylazy-1 -2- yl)-1،1-دیوکسو-1λ

آکادمی ملی علوم بلاروس RUE "مرکز تحقیقات و عملی آکادمی ملی علوم بلاروس برای غذا" فن آوری های نوآورانه در صنایع غذایی مواد و علمی کاربردی XI بین المللی

ویژگی های کلی کار ارتباط کار در حال حاضر، روش کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) به طور گسترده ای برای شناسایی و تعیین محتوای مواد آلی پیچیده استفاده می شود.

اعتبار سنجی روش های تحلیلی: کاربرد عملی. Pisarev V.V.، Ph.D., MBA، معاون مدیر کل شرکت واحد فدرال ایالتی "مرکز علمی دولتی آنتی بیوتیک ها"، مسکو (www.pisarev.ru) مقدمه

2.2.29. کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) یک روش جداسازی مبتنی بر توزیع متفاوت مواد بین دو غیرقابل اختلاط است.

وزارت آموزش و پرورش و علوم تحقیقات ملی روسیه دانشگاه دولتی تامسک دانشکده شیمی برنامه کار مشروح رشته روش های کروماتوگرافی تجزیه و تحلیل جهت آموزش

استفاده از محصولات Agilent Bond Elut Plexa برای کاهش سرکوب یون و بهبود کروماتوگرافی مایع - طیف‌سنجی جرمی (LC-MS) دستورالعمل‌های حساسیت دارویی

وزارت بهداشت فدراسیون روسیه مقاله داروسازی Carbamazepine FS.2.1.0020.15 Carbamazepine Replaces FS 42-2803-96; کاربامازپینوم به جای GF XII، قسمت 1، FS 42-0240-07 5H-Dibenzazepine-5-carboxamide

سخنرانی 22 اسیدهای آمینه. کار سنجاب بهترین راه برای لذت بردن از زندگی است. I. کانت نامگذاری اسیدهای آمینه. اسیدهای آمینه طبیعی کایرالیته اسیدهای آمینه که پروتئین ها را تشکیل می دهند. خواص اسیدی،

APP NOTE-10/2016LC قابلیت های تحلیلی کروماتوگرافی مایع MaestroHPLC با آشکارساز آرایه دیودی و آشکارساز فتومتریک با طول موج های ثابت (LED) با استفاده از مثال تعیین

سخنرانی شیمی 3 آلفا اسیدهای آمینه، پپتیدها، پروتئین ها. این سخنرانی توسط پروفسور ارائه می شود. Belavin Ivan Yuryevich 2. آلفا-آمینو اسیدها، پپتیدها، پروتئین ها-آمینو اسیدها پروتئین ها تنظیم کننده های زیستی منبع انرژی آلفا-آمینواسیدهای ناهمکار

کار آزمایشگاهی 11. مکانیسم های فرآیندهای ژنتیکی مولکولی اساسی هدف درس: آشنایی با ترکیب DNA و RNA، فرآیندهای همانندسازی، رونویسی و ترجمه با استفاده از مثال حل معمولی

APP NOTE-34/2018LC قابلیت های تحلیلی کروماتوگرافی مایع HPLC Maestro با آشکارساز آرایه دیودی با استفاده از مثال تعیین محتوای ترکیبات فنلی و فوران در کنیاک ها بر اساس

آزمایش داروهای ترکیبی با دوز ثابت برای ناخالصی ها با استفاده از محلول Agilent 129 Infinity II HDR-DAD Impurity Analyzer

APP NOTE-18/2017LC قابلیت های تحلیلی کروماتوگرافی مایع MaestroHPLC با آشکارساز آمپرومتریک با استفاده از مثال تعیین کاتکول آمین ها در پلاسمای خون Yashin A. Ya. دانشیار، مهندس پیشرو

GOST R 51435-99 آب سیب، آب سیب غلیظ و نوشیدنی های حاوی آب سیب. روش برای تعیین محتوای پاتولین با استفاده از کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا. OKS 67.160.20

نقد و بررسی طرف رسمی در مورد پایان نامه میخائیل وادیموویچ شاشکوف "مطالعه فازهای مایع ثابت بسیار قطبی بر اساس مایعات یونی برای کروماتوگرافی گازی مویرگی" برای مسابقه

پپتیدها، طبیعی یا مصنوعی. ترکیباتی که مولکول های آنها از بقایای اسید آمینه ای ساخته شده اند که توسط پیوندهای پپتیدی (آمیدی) C(O) NH به یکدیگر متصل شده اند. این مولکول همچنین ممکن است حاوی یک جزء غیر اسید آمینه (به عنوان مثال، یک باقیمانده کربوهیدرات) باشد. بر اساس تعداد باقی مانده های اسید آمینه موجود در مولکول های پپتید، دی پپتیدها، تری پپتیدها، تتراپپتیدها و غیره متمایز می شوند. پپتیدهای حاوی حداکثر 10 اسید آمینه باقی مانده نامیده می شوند. الیگوپپتیدهای حاوی بیش از 10 اسید آمینه پلی پپتید پلی پپتید Pri با مول. متر بیش از 6 هزار نام. پروتئین ها

مرجع تاریخیبرای اولین بار، پپتیدها از هیدرولیزهای پروتئین آنزیمی جدا شدند. اصطلاح "پپتیدها" توسط E. Fischer پیشنهاد شد. اولین پپتید مصنوعی توسط T. Curtius در سال 1881 بدست آمد. E. Fischer در سال 1905 اولین روش عمومی را برای سنتز پپتیدها توسعه داد و تعدادی الیگوپپتید را سنتز کرد. ساختمان ها موجودات شاگردان E. Fischer E. Abdergalden، G. Leike و M. Bergman به توسعه شیمی پپتید کمک کردند. در سال 1932، ام. برگمن و ال. اسیدهای آمینه محافظت شده با N (N-carbobenzoxyamino acids) به طور گسترده برای به دست آوردن پپتیدهای مختلف مورد استفاده قرار گرفتند، که با موفقیت برای مطالعه تعدادی از مشکلات کلیدی در شیمی و بیوشیمی این B-B، به عنوان مثال، برای مطالعه ویژگی سوبسترا استفاده شد. پروتئولیتیک آنزیم ها پپتیدهای طبیعی (گلوتاتیون، کارنوزین و غیره) ابتدا با استفاده از اسیدهای N-carbobenzoxyamino سنتز شدند. یک دستاورد مهم در این زمینه در ابتدا شکل گرفت. دهه 50 P. Vaughan و همکاران، سنتز پپتیدها با استفاده از روش انیدرید مخلوط (روشهای سنتز پپتید در زیر به تفصیل مورد بحث قرار گرفته است). در سال 1953، V. Du Vigneault اولین هورمون پپتیدی، اکسی توسین را سنتز کرد. بر اساس مفهوم سنتز پپتید فاز جامد که توسط P. Merrifield در سال 1963 توسعه یافت، نمونه های اتوماتیک ایجاد شدند. سنتز کننده های پپتید روش‌های سنتز آنزیمی کنترل‌شده پپتیدها توسعه فشرده‌ای را دریافت کرده‌اند. استفاده از روش های جدید، سنتز هورمون انسولین و غیره را ممکن ساخت.

موفقیت های مصنوعی شیمی پپتید با پیشرفت در توسعه روش‌هایی برای جداسازی، خالص‌سازی و آنالیز پپتیدها مانند کروماتوگرافی تبادل یونی، الکتروفورز تجزیه تهیه شد. رسانه، فیلتراسیون ژل، کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC)، ایمونوشیمیایی. روش‌های تجزیه و تحلیل گروه‌های انتهایی و روش‌های برش گام به گام پپتیدها نیز توسعه زیادی یافته‌اند. به طور خاص، سیستم های خودکار ایجاد شد. آنالایزر اسید آمینه و اتوماتیک دستگاه هایی برای تعیین ساختار اولیه پپتیدها - به اصطلاح. ترتیب دهنده ها

نامگذاری پپتیدباقیمانده اسید آمینه پپتیدهای آزاد. گروه a-amino نامیده می شود ترمینال N، و حامل رایگان است. گروه a-کربوکسیل - ترمینال C. تصویر نام پپتیداز نام می آید بقایای اسید آمینه موجود در ترکیب آن، به ترتیب ذکر شده است، با شروع از N ترمینال. در این مورد از نام های بی اهمیت استفاده می شود. اسیدهای آمینه، که در آنها پایان "in" با "sil" جایگزین می شود. حذف باقی مانده C ترمینال، نامیده می شود که با نام منطبق است. اسید آمینه مربوطه تمام باقی مانده های اسید آمینه موجود در پپتیدها با شروع از N-پایانه شماره گذاری می شوند. برای ثبت ساختار اولیه پپتیدها (توالی اسید آمینه)، نامگذاری سه حرفی و یک حرفی برای باقی مانده اسیدهای آمینه به طور گسترده استفاده می شود (به عنوان مثال، Ala Ser -Asp Phe -GIy alanyl-seryl-asparagyl-phenylalanyl-glycine).

ساختار.پیوند پپتیدی دارای خواص یک پیوند تا حدی دوگانه است. این در کاهش طول این پیوند (0.132 نانومتر) در مقایسه با طول یک پیوند ساده CN (0.147 نانومتر) آشکار می شود. ماهیت تا حدی دوگانه پیوند پپتیدی باعث می شود که آزادانه آن غیرممکن شود چرخش جانشین ها به دور آن بنابراین، گروه پپتید مسطح است و معمولاً دارای یک پیکربندی ترانس (f-la I) است. بنابراین، ستون فقرات زنجیره پپتیدی مجموعه ای از صفحات سفت و سخت با یک مفصل متحرک ("لولا") در محلی است که قسمت های نامتقارن قرار دارند. اتم های C (در فاز I با یک ستاره نشان داده می شوند).

در محلول های پپتیدی، تشکیل ترجیحی conformers خاص مشاهده می شود. با طولانی شدن زنجیره، عناصر منظم ساختار ثانویه (a-helix و b-structure) پایداری بارزتری (مشابه پروتئین ها) به دست می آورند. تشکیل یک ساختار ثانویه به ویژه برای پپتیدهای معمولی، به ویژه اسیدهای پلی آمینه مشخص است.

خواص. الیگوپپتیدها از نظر خواص مشابه اسیدهای آمینه هستند، پلی پپتیدها مشابه پروتئین ها هستند. الیگوپپتیدها معمولاً کریستالی هستند. موادی که با حرارت دادن تجزیه می شوند. تا 200 300 0 C. آنها به خوبی محلول هستند. در آب، دیل. توتخ و قلیایی، تقریباً بدون سول. در سازمان r- خرده فروشان استثنا: الیگوپپتیدهای ساخته شده از بقایای اسید آمینه آبگریز.

الیگوپپتیدها دارای خواص آمفوتریک هستند و بسته به اسیدیته محیط، می توانند به شکل کاتیون، آنیون یا زویتریون وجود داشته باشند. پایه ای باندهای جذب در طیف مادون قرمز برای گروه NH 3300 و 3080 سانتی متر-1، برای گروه C=O 1660 سانتی متر-1 است. در طیف UV، باند جذب گروه پپتیدی در محدوده 180-230 نانومتر است. ایزوالکتریک نقطه (pI) پپتیدها به طور گسترده ای متفاوت است و به ترکیب باقی مانده اسیدهای آمینه در مولکول بستگی دارد. مقادیر pK a پپتیدها تقریباً می باشد. 3، برای -N H 2 تقریبا. 8.

شیمی. خواص الیگوپپتیدها با عملکردهایی که دارند تعیین می شود. گروه ها و همچنین ویژگی های پیوند پپتیدی. شیمی آنها تبدیل به وسیله حداقل مشابه نسبت اسید آمینه مربوطه هستند. به من می دهند. واکنش بیورت و واکنش نین هیدرین. دی پپتیدها و مشتقات آنها (به ویژه استرها) به راحتی چرخه می شوند و دیکتوپی پرازین ها را تشکیل می دهند. تحت تأثیر 5.7 n.

پپتیدهای اسید هیدروکلریک ظرف 24 ساعت در دمای 105 درجه سانتیگراد به اسیدهای آمینه هیدرولیز می شوند.

سنتز.شیمی. سنتز پپتید شامل ایجاد یک پیوند پپتیدی بین گروه COOH یک اسید آمینه و NH 2 یک اسید آمینه یا پپتید دیگر است. مطابق با این، اجزای کربوکسیل و آمین فرآیند سنتز پپتید متمایز می شوند. برای انجام سنتز هدفمند و کنترل شده پپتیدها، ابتدا لازم است. حفاظت موقت از همه (یا برخی) عملکردها. گروه هایی که در تشکیل پیوند پپتیدی شرکت نمی کنند و همچنین به طور مقدماتی. فعال شدن یکی از اجزای سنتز پپتید. پس از اتمام سنتز، گروه های محافظ حذف می شوند. هنگام به دست آوردن پپتیدهای فعال بیولوژیکی، یک شرط ضروری جلوگیری از راسمی شدن اسیدهای آمینه در تمام مراحل سنتز پپتید است.

نایب. روش‌های مهم تشکیل پیوند پپتیدی هنگام اجرای r-tion در روش‌های r-re-activating. اترها، کربودی ایمید، انیدریدهای مخلوط و روش آزید.

روش استرهای فعال بر اساس پیش تشکیل یک مشتق استری از جزء کربوکسیل با وارد کردن یک بقایای الکلی حاوی یک جایگزین قوی الکترون‌کشنده در آن. در نتیجه، یک استر بسیار واکنش پذیر تشکیل می شود که به راحتی تحت تأثیر جزء آمینه سنتز پپتید در معرض آمینولیز قرار می گیرد. به عنوان یک فعال کننده استرها در سنتز پپتیدها، پنتا فلوئورو، پنتاکلر، تری کلرو و n-نیتروفنیل و تعدادی دیگر از استرهای اسیدهای آمینه محافظت شده و پپتیدها به طور گسترده استفاده می شوند.

روش carbodiimide تشکیل پیوند پپتیدی شامل استفاده از decomp است. کربودییمیدهای جایگزین Dicyclohexyl-carbodiimide به طور گسترده ای در سنتز پپتیدها استفاده می شود:

X و Y-resp. گروه‌های محافظ N و C با این معرف متراکم، سنتز پپتیدها در محیط‌های آبی امکان‌پذیر است، زیرا سرعت هیدرولیز و آمینولیز O-acyl isourea (II) به طور قابل توجهی متفاوت است. از ترکیبات مختلفی نیز در سنتز پپتیدها استفاده می شود. کربودییمیدهای محلول در آب (به عنوان مثال، N-dimethylaminopropyl-N"-ethylcarbodiimide).

روش انیدرید مخلوط بر اساس پیش تیمار است. فعال سازی جزء کربوکسیلیک سنتز پپتید با تشکیل یک انیدرید مخلوط با یک کربوکسیلیک یا اینورگ. سازمان بهداشت جهانی. نایب. آلکیل استرهای ترکیبات کلروفرمی (کلرید کربنیک) اغلب استفاده می شود، به ویژه اتیل و ایزوبوتیل اترها، به عنوان مثال:

ب - آمین سوم

هنگام سنتز پپتیدها با استفاده از این روش، انیدریدهای مخلوط اسیدهای آمینه N- آسیل و اسیدهای پیوالیک (تری متیل استیک) بسیار مؤثر هستند. با تشکر از قرار دادن قوی. با توجه به اثر القایی گروه ترت بوتیل، الکتروفیلی اتم کربوکسیل C در باقیمانده اسید پیوالین به طور قابل توجهی کاهش می یابد و این، همراه با استریک. موانع، ناخواسته را سرکوب می کند تشکیل وثیقه یورتان و آزاد. اسیدهای N-acylamino، لبه ها طبق این طرح انجام می شوند:

در یکی از انواع روش انیدرید مخلوط، 1-اتوکسی کربونیل-2-اتوکسی-1،2-دی هیدروکینولین به عنوان یک عامل متراکم استفاده می شود. این ارتباط است. به راحتی یک واسطه با جزء کربوکسیل سنتز پپتید تشکیل می دهد. انیدرید مخلوط که به سرعت وارد محلول تراکم می شود و مواد ناخواسته کاملاً از بین می روند. توزیع جانبی

یک مورد خاص از روش انیدرید مخلوط، روش متقارن است. انیدریدها که در آنها از اسید آمینه انیدرید 2 O استفاده می شود استفاده از آنها امکان عدم تناسب یا آمینولیز نامناسب را از بین می برد.

روش سنتز آزید شامل فعال شدن جزء کربوکسیل با تبدیل آن به آزید یک اسید آمینه یا پپتید جایگزین N است:

به دلیل ناپایداری آزیدها آزاد هستند. فرم از محلول، به عنوان یک قاعده، جدا نیست. اگر به جای نیتریت های فلز قلیایی، آلکیل اترهای ترکیبات نیتروژن دار (به عنوان مثال، ترت بوتیل نیتریت) برای محلول با هیدرازید استفاده شود، می توان تراکم آزیدی را به صورت ارگ انجام داد. r-ritele; HN 3 حاصل با آمین های درجه سوم متصل می شود. تراکم آزید اغلب با عوارض ناخواسته پیچیده می شود. واکنش های جانبی (تبدیل هیدرازید نه به آزید، بلکه به آمید؛ محلولهیدرازید با آزید، که منجر به تشکیل 1،2-دیاسیل هیدرازین می شود. متناوب تشکیل ایزوسیانات، که در نتیجه بازآرایی کورتیوس می تواند منجر به مشتق اوره یا اورتان مربوطه و غیره شود). از مزایای روش آزید می توان به درجه کم راسمی شدن، امکان استفاده از سرین و ترئونین بدون محافظت از گروه های هیدروکسیل اشاره کرد.

برای تبدیل پپتیدهای محافظت شده با استفاده از پپتیدهای آزاد به پپتیدهای آزاد تبدیل می شوند روش های انسداد، که بر اساس راه حل هایی است که جدا شدن از تجزیه را تضمین می کند. گروه های محافظ که حفظ تمام پیوندهای پپتیدی در مولکول را تضمین می کنند. نمونه هایی از انسداد: حذف گروه اکسی کربونیل بنزیل کاتالیزور. هیدروژنولیز در اتمسفر فشار و دمای اتاق، حذف گروه ترت بوتیلوکسی کربونیل با اسیدولیز ملایم و همچنین هیدرولیتیک. جدا شدن گروه تری فلوئورواستیل تحت عمل رقیق. راه حل های پایه

هنگام سنتز پپتیدهای فعال بیولوژیکی، مهم است که راسمیزه شدن اتفاق نیفتد؛ لبه ها می توانند در نتیجه حذف برگشت پذیر H + از اتم C یک اسید آمینه N- آسیل یا پپتید رخ دهند. راسمی شدن توسط بازها و ترکیبات، دماهای بالا و ترکیبات قطبی ترویج می شود. نقش تعیین کننده توسط racemization ایفا می شود، کاتالیز شده توسط پایگاه ها، که می تواند از طریق به اصطلاح رخ می دهد. مکانیسم آزلاکتون یا از طریق انولیزاسیون طبق طرح زیر:

نایب. راه های مهم برای جلوگیری از راسمی شدن: 1) گسترش زنجیره پپتیدی در جهت از C-پایانه به انتهای Nبا استفاده از گروه های محافظت کننده N مانند ROC(O). 2) فعال سازی قطعات پپتید محافظت شده با N با پرولین C ترمینال یا باقی مانده گلیسین. 3) استفاده از روش آزید (در صورت عدم وجود پایه سوم اضافی و حفظ دمای پایین در محیط واکنش). 4) برنامه فعال. استرهای آمینو اسید، که آمینولیز آنها از طریق یک حالت گذار انجام می شود، تثبیت کننده. پل های هیدروژنی (به عنوان مثال، استرهای تشکیل شده با N-hydroxypiperidine و 8-hydroxyquinoline). 5) استفاده از روش کربودی ایمید با افزودنی های ترکیب N-هیدروکسی. یا دفتر لوئیس

در کنار سنتز پپتیدها در محلول ها، سنتز پپتیدها با استفاده از حامل های نامحلول اهمیت دارد. این شامل سنتز پپتید فاز جامد (روش یا روش مریفیلد) و سنتز پپتید با استفاده از معرف‌های پلیمری است.

استراتژی سنتز پپتید فاز جامد شامل تثبیت موقت زنجیره پپتیدی سنتز شده بر روی یک حامل پلیمری نامحلول است و طبق طرح زیر انجام می شود:

به لطف این روش، امکان جایگزینی روش های بسیار پیچیده و پر زحمت برای جداسازی و خالص سازی مواد واسطه وجود داشت. پپتیدها با عملیات شستشو و فیلتر کردن ساده، و همچنین کاهش فرآیند سنتز پپتید به دنباله ای استاندارد از روش های تکراری دوره ای که می تواند به راحتی خودکار شود. روش مریفیلد این امکان را فراهم کرد که به طور قابل توجهی روند سنتز پپتید را سرعت بخشد. بر اساس این روش، انواع مختلفی از انواع اتوماتیک سنتز کننده های پپتید

ارتباط بسیار سازنده است. سنتز فاز جامد پپتیدها با قابلیت جداسازی HPLC آماده‌سازی دسترسی به سطح کیفی جدیدی از شیمی را فراهم می‌کند. سنتز پپتیدها، که به نوبه خود، تأثیر مفیدی بر توسعه انواع مختلف دارد. آنها می گویند حوزه های بیوشیمی. زیست شناسی، مهندسی ژنتیک، بیوتکنولوژی، فارماکولوژی و پزشکی.

استراتژی سنتز پپتیدها با استفاده از معرف های پلیمری شامل اتصال موقت به وزن مولکولی بالا است. حامل فعال شد جزء کربوکسیل یا عامل متراکم کننده سنتز پپتید. مزیت این روش این است که معرف های متصل به پلیمر می توانند بیش از حد وارد شوند و جداسازی پپتیدهای سنتز شده از پلیمرهای نامحلول دشوار نیست.

نمونه ای از این سنتز عبور دادن جزء آمینو در یک توالی معین از چندین است. ستون هایی که هر کدام شامل یک پلیمر است

خلاصه

این بررسی بر روی مطالعات فارماکوکینتیک و فراهمی زیستی هنگام ایجاد داروهای اصلی جدید با ساختار پپتیدی متمرکز است. توجه زیادی به روش‌هایی برای تعیین کمی ترکیبات پپتیدی در بیومواد، مطالعه ویژگی‌های فارماکوکینتیک آنها، عوامل مؤثر بر فراهمی زیستی این مواد و برخی از داده‌های فارماکوکینتیک در مورد داروهایی با ساختار پپتیدی که در عمل پزشکی معرفی شده‌اند نیز ارائه شده است.

کلید واژه ها: فارماکوکینتیک، پپتیدهای کوتاه، فراهمی زیستی، مواد کمکی

معرفی

اختلالات اضطرابی اختلالات روانی هستند که با اضطراب عمومی پایدار، ترس بیمارگونه، تنش و عصبی بودن مشخص می شوند. در حال حاضر، شیوع بیماری های مرتبط با اختلالات اضطرابی از 13.6 تا 28.8 درصد در کشورهای غربی متغیر است و به دلیل سرعت بالای زندگی، تنش های محیطی و اجتماعی به طور مداوم در حال افزایش است.

با توجه به افزایش قابل توجه بیماری های مرتبط با اختلالات اضطرابی و افسردگی، توسعه و اجرای داروهای ضد اضطراب جدید مرتبط است. امروزه داروهایی که چنین اثر دارویی دارند عمدتاً توسط گروهی از ترکیبات بنزودیازپین نشان داده می شوند که با خستگی، خواب آلودگی، اختلال حافظه، وابستگی ذهنی و جسمی به مواد مخدر و سندرم ترک که کیفیت زندگی بیماران را کاهش می دهد مشخص می شود. یکی از این داروهای ضد اضطراب، بدون این عوارض جانبی، داروی آفوبازول است. موارد فوق نیاز به جستجوی سایر داروهای بسیار مؤثر را که عاری از عوارض جانبی بنزودیازپین ها هستند، تأیید می کند. علم توجه زیادی به پپتیدهای درون زا دارد. تا به امروز، نقش مهم نوروپپتید درون زا کوله سیستوکینین در پاتوژنز اختلالات اضطرابی مشخص شده است. مشخص شده است که کوله سیستوکینین، بر روی گیرنده های CCK-B واقع در سیستم عصبی مرکزی، فعالیت اضطراب زا را نشان می دهد - باعث ایجاد حملات هراس می شود، با سیستم مواد افیونی تعامل دارد و بنابراین می تواند اثر ضد درد داشته باشد. همچنین ممکن است کوله سیستوکینین در پاتوژنز افسردگی و اسکیزوفرنی نقش داشته باشد.

از آنجایی که نوروپپتیدهای درون زا پایداری آنزیمی پایینی دارند، در معرض هیدرولیز در دستگاه گوارش هستند و تنها پس از نفوذ از طریق BBB فعال هستند، نیاز به جستجو برای ضد اضطراب بالقوه (آنتاگونیست های گیرنده کوله سیستوکینین) با ساختار فشرده تر و محافظت شده وجود داشت. زمانی که به صورت سیستمیک تجویز شود موثر است.

بر اساس فرضیه توسعه یافته توسط Gudasheva T.A. در سال 1985، در مورد امکان شبیه سازی ساختار یک نمونه اولیه غیر پپتیدی با فعالیت نوروتروپیک خاص، و همچنین قطعه فعال پپتید اصلی با فعالیت مشابه، یک دی پپتید ضد اضطراب جدید GB-115 (N-phenyl-N) -هگزانویل-L-گلیسیل-L آمید) سنتز شد -تریپتوفان) رتروآنالوگ کوله سیستوکینین-4 است. فعالیت دارویی این ترکیب ثابت شده است: به طور تجربی ثابت شده است که GB-115 خواص ضد اضطراب، ضد الکل، ضد افسردگی و ضد درد را نشان می دهد. هنگامی که به صورت خوراکی تجویز شد، GB-115 حداکثر فعالیت ضد اضطراب خود را در دوز 0.1 میلی گرم بر کیلوگرم نشان داد. این دارو واکنش اضطراب زایی ناشی از خروج اتانول را با دوز 0.2 میلی گرم بر کیلوگرم متوقف می کند. حداکثر فعالیت ضد درد در دوز mg/kg 10 و اثر ضد افسردگی در دوز 0.025-0.05 mg/kg، داخل صفاقی ظاهر می‌شود.

انجام مطالعات فارماکوکینتیک تجربی یک دارو گامی ضروری برای ارتقاء بیشتر آن در عمل پزشکی است. بهبود پارامترهای فارماکوکینتیک اجازه می دهد تا یک شکل دوز بهینه ایجاد شود که با درجه و سرعت جذب مناسب، ویژگی های توزیع، مسیرهای متابولیسم و ​​دفع متمایز شود. ارزیابی فراهمی زیستی نسبی به فرد اجازه می دهد تا به نفع یک شکل دوز با بهترین پارامترهای فارماکوکینتیک برای ترکیب مورد مطالعه انتخاب کند.

فارماکوکینتیک یک علم مدرن و به سرعت در حال توسعه است که ویژگی های نفوذ دارو به بدن، توزیع، تبدیل زیستی و حذف را مطالعه می کند. مطالعه این فرآیندها، از جمله ارزیابی کمی آنها، هدف اصلی فارماکوکینتیک است.

مطالعه فارماکوکینتیک مواد فعال فارماکولوژیک جدید در آزمایشات یک مرحله اجباری در تحقیق، توسعه و اجرای آنها در عمل پزشکی است. اثربخشی دارو مستقیماً به فرآیندهای جذب، توزیع و دفع داروها از بدن بستگی دارد.

داده های فارماکوکینتیک تعیین مسیر و روش تجویز، محل نفوذ دارو، رژیم دوز تقریبی و همچنین راه های اصلی حذف دارو را ممکن می سازد.

جذب، توزیع، متابولیسم و ​​دفع یک ترکیب دارویی فرآیندهای به هم پیوسته ای هستند. همه آنها تحت تأثیر عوامل زیادی قرار دارند: سرعت جذب بستگی به شکل دوز دارو، غلظت ماده فعال، pH محیطی که ماده در آن حل می شود، حرکت روده و وضعیت سطح جذب دارد. حوزه. شاخص های توزیع و تبدیل زیستی دارو تحت تأثیر جنسیت، سن، وضعیت جسمی بدن بیمار و همچنین وضعیت سیستم های آنزیمی بدن است که اغلب به دلیل تفاوت های فردی است. بنابراین، سرعت متابولیسم برخی از داروهای روانگردان می تواند از 6 تا 30 ساعت در بیماران مختلف متغیر باشد. حذف متابولیت ها از بدن می تواند تحت تأثیر بیماری های همزمان و همچنین تأثیر سایر داروها قرار گیرد.

برای ارزیابی فرآیندهای مختلف فارماکوکینتیک داروها در بدن حیوانات و انسان، پارامترهای فارماکوکینتیک مربوطه، از جمله فراهمی زیستی (F، %) - بخشی از دوز دارو که پس از تجویز خارج عروقی به جریان خون سیستمیک می رسد، محاسبه می شود.

توجه به شرایط انجام آزمایشات فارماکوکینتیک در آزمایشات پیش بالینی ترکیبات فعال دارویی جدید مهم است.

عوامل فارماکولوژیک مورد مطالعه به عنوان هدف تحقیق در نظر گرفته می شوند که در عمل بالینی بر روی حیوانات سالم انجام می شود: موش، موش، خرگوش، سگ، میمون و دیگران که وزن آنها نباید با استاندارد برای هر گونه متفاوت باشد. بیش از 10 درصد

انواع اصلی مواد بیولوژیکی عبارتند از پلاسمای سرم خون، خون کامل، اندام ها و بافت های مختلف، ادرار، مدفوع.

مسیر مصرف بر اساس شکل دارو تعیین می شود که بر اساس مطالعات فارماکوکینتیک برای مطالعات فارماکولوژیک بیشتر توصیه می شود. روش های تجویز می تواند متفاوت باشد: داخل وریدی، داخل صفاقی، عضلانی، زیر جلدی، خوراکی و غیره. این دارو به صورت خوراکی در حیوانات با استفاده از لوله حلقی یا اثنی عشر در معده خالی برای جلوگیری از تداخل دارو با غذا تجویز می شود.

تجویز می تواند مکرر یا تکی باشد. با یک بار مصرف، مطالعه فارماکوکینتیک ماده فعال با حداقل سه سطح دوز ضروری است. این برای تأیید خطی بودن فارماکوکینتیک ضروری است.

مدت زمان آزمایش باید با زمانی 5 برابر بیشتر از نیمه عمر مطابقت داشته باشد.

تعداد حیوانات در هر نقطه (مقدار غلظت مربوطه) باید حداقل 5 باشد اگر از هر حیوان فقط یک نمونه از نمونه گرفته شود (در آزمایشات روی موش ها در صورت قطع سر: یک حیوان - یک نقطه).

یکی از مراحل مهم مطالعه فارماکوکینتیک و بیودارویی یک ترکیب فعال دارویی جدید، مطالعه فراهمی زیستی مطلق و نسبی آن است (به بخش «دسترسی زیستی داروها» مراجعه کنید).

• روشهای تحلیلی برای تعیین پپتیدها و مشتقات آنها

روش های مختلفی برای تعیین کمی و کیفی اسیدهای آمینه، پپتیدها و مشتقات آنها وجود دارد. و انتخاب منطقی روش بهینه برای تجزیه و تحلیل یک داروی بالقوه با ساختار پپتیدی ضروری است. این به ما امکان می دهد به تجزیه و تحلیل حساس دست یابیم و نتایج دقیق و قابل تکراری به دست آوریم که فارماکوکینتیک یک ترکیب خاص را نشان می دهد.

طبقه بندی:

• روش های کروماتوگرافی مایع:

کروماتوگرافی مایع لایه نازک

کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا

• کروماتوگرافی گازی
• روش های ایمونوشیمیایی تجزیه و تحلیل
• الکتروفورز مویرگی

1.2 کروماتوگرافی اسیدهای آمینه و پپتیدها

کروماتوگرافی یک روش فیزیکوشیمیایی برای جداسازی اجزای یک مخلوط تجزیه شده بر اساس تفاوت در ضرایب توزیع آنها بین دو فاز ثابت و متحرک است. امیدوار کننده ترین روش های کروماتوگرافی عبارتند از: کروماتوگرافی گازی (GC) و کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا (HPLC) در ترکیب با آشکارساز طیف سنجی جرمی - GC-MS و HPLC-MS. این روش‌ها با سرعتی سریع در حال توسعه هستند که با رشد وظایفی که در سال‌های اخیر مطرح شده‌اند همراه است: پروتئومیکس، متابولومیک، تجزیه و تحلیل سوخت‌های زیستی، تعیین نشانگرهای زیستی بیماری‌ها، ایجاد و کنترل کیفی داروها، کنترل کیفیت و ایمنی مواد غذایی. و همچنین تروریسم (تعیین مواد سمی، مواد مضر و رزمندگان) و تعیین سریع عواقب شرایط اضطراری.

1.2.1 روش های کروماتوگرافی مایع

1.2.1.1. کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا

HPLC یک روش فیزیکوشیمیایی برای جداسازی اجزای مخلوطی از مواد است که بر اساس توزیع متفاوت آنها بین دو فاز غیرقابل امتزاج، یکی متحرک و دیگری غیر متحرک است. بسته به قطبیت فازهای متحرک و ثابت، HPLC معمولاً به فاز عادی (فاز ثابت قطبی تر از متحرک است) و فاز معکوس (فاز ساکن قطبی کمتر از متحرک است) تقسیم می شود.

HPLC فاز معکوس اغلب برای جداسازی اسیدهای آمینه و پپتیدها استفاده می شود، زیرا اکثر آنالیت ها در فازهای متحرک آبی بسیار محلول هستند و در اکثر حلال های غیر قطبی حلالیت محدودی دارند. با این حال، HPLC فاز نرمال برای کروماتوگرافی مشتقات و پپتیدهای اسید آمینه با زنجیره کوتاه با آبگریزی کم استفاده می شود، که توسط فاز ثابت در HPLC فاز معکوس حفظ نمی شوند. HPLC فاز معکوس استاندارد طلایی برای جداسازی و خالص سازی پپتید قبل از استفاده از طیف سنجی جرمی در این زمینه بود. RP-HPLC نسبت به سایر روش های آنالیز کروماتوگرافی دارای مزایای زیر است: تکرارپذیری نتایج، قدرت جداسازی بالا، انتخاب پذیری (قابلیت تمایز پپتیدها با اختلاف یک اسید آمینه)، حساسیت، سرعت بالا در اجرا و استفاده از حجم کمی از حلال های فرار

گزینش پذیری و کیفیت آنالیز پپتید در HPLC فاز معکوس به انتخاب صحیح فازها بستگی دارد: متحرک و ثابت.

به عنوان یک فاز ثابت، از جاذب هایی استفاده می شود که سیلیکاژل اصلاح شده با مشتقات مختلف کلروسیلان هستند. این فاز دارای استحکام بالا و بی تفاوتی نسبت به حلال های آلی است. فاز معکوس با ویژگی های ماتریس - سیلیکاژل و ساختار رادیکال پیوند شده متمایز می شود که در ترکیب و ساختار قطعه کربن متفاوت است. هنگام کروماتوگرافی پپتیدها، انتخاب فاز معکوس با اندازه و آبگریزی پپتیدها تعیین می شود: برای پپتیدهای با زنجیره کوتاه، از پپتیدهای آبدوست، فازهای C8 (n-octyl) و C18 (n-octadecyl) برای بزرگ استفاده می شود. و آبگریز - فاز C3 (تری متیل یا دی متیل پروپیل)، C4 (n-بوتیل)، C6 (فنیل).

برای انتخاب صحیح فاز متحرک، لازم است pH، ترکیب و غلظت حلال آلی را در نظر بگیرید:

برای کاهش قطبیت پپتیدها و اطمینان از ماندگاری بهتر توسط جاذب، pH مایع شوینده باید در محدوده 2-3 باشد. همچنین برای افزایش زمان ماند پپتیدها، به اصطلاح اصلاح کننده ها یا معرف های جفت یونی (کنتریون ها) که قادر به تشکیل جفت های یونی با گروه های پپتیدی دارای بار مثبت هستند، وارد فاز متحرک می شوند. اصلاح کننده یونی اصلی در RP HPLC اسید تری فلورواستیک است. به راحتی با تبخیر از مایعات شستشو حذف می شود، پپتیدها را به خوبی حل می کند و در ناحیه با طول موج کوتاه شفاف UV است که در طول تشخیص پیک اضافی ایجاد نمی کند. اسید فرمیک نیز به عنوان یک اصلاح کننده استفاده می شود و جداسازی خوبی را فراهم می کند، اما استفاده از آن به دلیل جذب قوی در ناحیه UV محدود شده است.

تأثیر حلال آلی بر توانایی شستشوی فاز متحرک بسیار زیاد است. بنابراین قدرت شستشوی حلال به ترتیب زیر افزایش می یابد: آب - متانول - استونیتریل - اتانول - دی اکسان - تتراهیدروفوران - 2-پروپانول - 1-پروپانول. این توالی به دلیل کاهش قطبیت مواد آلی در این سری است. استونیتریل اغلب به عنوان یک جزء آلی فاز متحرک استفاده می شود، زیرا در ناحیه اشعه ماوراء بنفش تا 200 نانومتر شفاف است، ویسکوزیته پایینی دارد، بسیار فرار است، که در صورت لزوم، به راحتی آن را از مایع خروجی جمع آوری شده حذف می کند. کسری است و با گزینش پذیری خوب مشخص می شود.

جداسازی ترکیبات پپتیدی را می توان در شرایط ایزوکراتیک، جایی که غلظت حلال آلی ثابت است، یا با شستشوی گرادیان انجام داد که در این صورت غلظت حلال آلی در طول زمان افزایش می یابد. مواد مورد آزمایش به ترتیب افزایش آب گریزی شسته می شوند.

1.2.1.2. روش‌های تشخیص پپتیدها در کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا: تشخیص UV، طیف‌سنجی جرمی.

برای انجام دقیق تجزیه و تحلیل کمی و کیفی پس از جداسازی مواد دارویی توسط HPLC، لازم است از تجهیزاتی برای تشخیص آنها استفاده شود که به نوبه خود دارای الزامات زیر است: آشکارسازها باید دارای حساسیت بالا (سیگنال خوب، بدون نویز)، سرعت، محدوده دینامیکی خطی گسترده، پایداری، عدم تعامل با فاز متحرک.

یکی از رایج‌ترین روش‌های تشخیص در کروماتوگرافی مایع با کارایی بالا، اشعه ماوراء بنفش است که با حساسیت بالای آنالیز، سادگی و مقرون به صرفه بودن از نقطه نظر اقتصادی توضیح داده می‌شود. با این حال، تشخیص اشعه ماوراء بنفش نسبت به طیف سنجی جرمی روشی کمتر حساس است. آشکارسازهای UV امروزه با چهار نوع اصلی نشان داده می شوند:

• با طول موج ثابت؛
• با یک تک رنگ که به شما امکان می دهد طول موج را در محدوده خود تغییر دهید.
• با یک تک رنگ قابل تنظیم خودکار که امکان تشخیص چند کاناله و طول موجی را فراهم می کند.
• آشکارسازهای دیود ماتریس که امکان به دست آوردن اطلاعات طیفی کامل را در یک محدوده معین فراهم می کند.

به دلیل وجود برخی کروموفورها در ترکیب اسیدهای آمینه و همچنین خود پیوند پپتیدی، تشخیص ترکیبات پپتیدی با استفاده از اشعه ماوراء بنفش با استفاده از یکی از چهار نوع تجهیزات ذکر شده در بالا امکان پذیر شده است.

ترکیبات پپتیدی قادر به جذب اشعه ماوراء بنفش در سه ناحیه هستند:

بالای 250 نانومتر (λ=280 نانومتر)، که به دلیل وجود اسیدهای آمینه معطر در ترکیب مورد تجزیه و تحلیل - تریپتوفان (λ=278 نانومتر)، تیروزین (λ=275 نانومتر) و فنیل آلانین است.

در 210-250 نانومتر، چنین سیگنالی می تواند توسط اسیدهای آمینه دیگر با پیوندهای هیدروژنی درون و بین مولکولی در مولکول های پروتئین داده شود.

در 190 نانومتر، که با وجود پیوندهای پپتیدی توضیح داده می شود.

با این حال، تشخیص ترکیبات مورد مطالعه در طول موج‌های زیر 210 نانومتر به دلیل تأثیر حلال‌های مورد استفاده در HPLC، که جذب خاص خود را در طول موج‌های کوتاه‌تر از 210 نانومتر دارند و همچنین به دلیل وجود ناخالصی‌ها انجام نمی‌شود. بنابراین، هنگام تشخیص مواد پپتیدی، اغلب از محدوده طول موج بالای 250 نانومتر استفاده می شود. اگر ترکیبات حاوی کروموفورهایی نباشند که تابش فرابنفش را در این ناحیه جذب کنند، به روش مشتق‌سازی متوسل می‌شوند.

مشتق سازی اصلاح شیمیایی یک آنالیت برای تولید یک ترکیب مشتق است که خواص تحلیلی را بهبود بخشیده است. هنگام کار با HPLC-UV از طریق مشتق سازی، لازم است ترکیبی به دست آید که در طیف UV در منطقه ای مناسب برای تجزیه و تحلیل مواد بیولوژیکی ثبت شده باشد. بنابراین در کار رودنکو A.O. هنگام تعیین مهم ترین اسیدهای آمینه در ماتریس های بیولوژیکی پیچیده، از روش مشتق سازی 16 اسید آمینه استفاده شد. O-phthalaldehyde به عنوان یک عامل مشتق کننده استفاده شد.

روش تشخیص طیف سنجی جرمی شامل سه مرحله است: یونیزاسیون، جداسازی جرم به بار و تشخیص بعدی با استفاده از تحلیلگر جرم. برای تجزیه و تحلیل ترکیبات دارویی، از تکنیک های یونیزاسیون "نرم" استفاده می شود: یونیزاسیون الکترواسپری، و همچنین دفع لیزر به کمک ماتریس (MALDI). این روش‌ها حالت یونیزاسیون ملایم را نشان می‌دهند که مخصوصاً برای مولکول‌های زیستی ناپایدار حرارتی مهم است. با این حال، این نوع یونیزاسیون به اندازه کافی آموزنده نیستند، بنابراین اغلب به طیف سنجی جرمی پشت سر هم (MS/MS)، روشی برای ثبت قطعات آنالیت ها متوسل می شوند. به بیان دقیق تر، این روش شامل چند مرحله است: ابتدا ترکیبات مورد تجزیه و تحلیل به آرامی یونیزه می شوند، از اولین آنالیزور عبور می کنند، سپس انرژی آنها افزایش می یابد، به همین دلیل مولکول های مورد مطالعه قطعه قطعه می شوند و تجزیه کننده دوم جرم حاصل را ثبت می کند. طیف

برای تعیین کمی ترکیبات دارویی جدید، از انواع آنالایزرهای جرم زیر استفاده می شود:

چهار قطبی (آنالیزگر جرم بر اساس سه چهار قطبی)، که "استاندارد طلایی" در مطالعه ترکیبات دارویی جدید است.

زمان پرواز (TOF)، در صورت استفاده، حساسیت کمتری نسبت به زمانی که از آنالایزرهای چهار قطبی سه گانه استفاده می شود، به دست می آورد.

تشدید سیکلوترون یونی و تله یون مداری که آنالایزر جرمی با وضوح بالا هستند و به دلیل هزینه زیاد و پیچیدگی چنین دستگاه هایی تاکنون به ندرت مورد استفاده قرار می گیرند.

استفاده از تشخیص طیف سنجی جرمی در ترکیب با HPLC امکان دستیابی به نرخ بالای آنالیز، افزایش حد تشخیص ترکیبات دارویی و بهبود قابل توجهی پایداری و دقت مطالعات را فراهم کرده است.

• کروماتوگرافی لایه نازک

امروزه از TLC به میزان بسیار کمتری استفاده می‌شود، زیرا روش‌های پیشرفته‌تر جداسازی پپتید مانند HPLC، کروماتوگرافی ستونی مایع، کروماتوگرافی تبادل یونی، الکتروفورز ژل پلی آکریل آمید پروتئینی و الکتروفورز مویرگی در دسترس قرار گرفته‌اند. با این حال، TLC در زمان خود یک روش کمی، با تکنولوژی بالا، نسبتا ارزان و به راحتی قابل تکرار بود. کروماتوگرافی لایه نازک در دهه 80 رایج بود - اسیدهای آمینه از گیاهان، حیوانات و مایعات بیولوژیکی مختلف جدا شدند.