Mediet för att isolera gonokocker är torrt. Neisseria - Hem Ltd. Kultur för gonorré för att bestämma effektiviteten av behandlingen

Laboratoriemetoder används i stor utsträckning vid diagnos av sexuellt överförbara sjukdomar i det genitourinära systemet: gonorré, syfilis, trichomoniasis, etc. Förekomsten av sjukdomen kräver åtgärder för att identifiera orsaken till infektionen.

SVG-näringsmediet är avsett för isolering och odling av gonokocker när man studerar material från en patient. Varje kit är utformat för att förbereda 110 ml gonokockmedium, redo att användas.

Ställ in innehåll

Satsen för att erhålla näringsmediet bör förvaras vid en temperatur på 2 - 8 °C i högst 12 månader. Fast näringsmedium kan förvaras i provrör eller petriskålar i högst 7 dagar. Satsen för att förbereda näringsmediet innehåller:

• bas: agar, jästextrakt, pepton, stärkelse, salter;
• selektiv tillsats: koenzymer, erytrocytlysat, svampdödande medel, antibiotika, sockerarter;
• instruktioner för användning av satsen.

Metodik

Tekniken innehåller flera steg, som var och en måste ske i enlighet med vissa krav. Efter fullbordandet av alla stadier av sjukdomsdiagnostik med metoden för att odla patogenen på gonokockmedium, registreras resultaten efter 24 timmar, 48 timmar och 72 timmar. Vid akut gonorré observeras gonokocktillväxt under den första dagen, vid kronisk gonorré - upp till 72 timmar.

Beredning av en lösning av mediumbasen för kulturell diagnostik utförs genom att hälla basen i en behållare innehållande destillerat vatten (100 ml) för efterföljande svällning. Den resulterande suspensionen placeras i ett vattenbad och omrörs regelbundet tills basen är helt upplöst, sedan kokas lösningen i 2 minuter. En lösning av den selektiva tillsatsen framställs genom att lösa den i destillerat vatten (10 ml) under omrörning.

Ett färdigt näringsmedium bildas genom att tillsätta en lösning av en selektiv tillsats till en baslösning. Det resulterande mediet hälls i sterila petriskålar. Innan studien genomförs måste gonokockmediet förvaras i en timme vid en temperatur av 37 °C. Sedan inokuleras materialet i enlighet med hälsoministeriets order "Om föreningen av mikrobiologiska (bakteriologiska) forskningsmetoder som används i kliniska diagnostiska laboratorier vid medicinska institutioner."

Effektiviteten av den bakteriologiska forskningsmetoden i

bestäms till stor del av kvaliteten på näringsmediet. I

I vårt land är två typer mest testade och använda

näringsmedia: ascites-agar och ascites-fria näringsmedia.

Grunden för båda medierna är köttpentoneagar (MPA) från kött

kaniner eller färska oxhjärtan. Metod för dess framställning

enligt följande. Kaninkött är befriat från fett och

senor, passerade genom en köttkvarn eller hackade med en kniv,

vägs, fylls med dubbel volym kranvatten och i sådant

formen lämnas i kylen vid 4°C under en dag för extraktion.

Sedan värms massan till kokning, kokas i 10 minuter, kyls och

filtrera genom ostduk. Till filtratet tillsätt 2% agar-agar, 1%

pepton och 0,5 % natriumklorid, värm tills agar-agar löses upp

och sätt pH=7,5-7,6 (alkalisering är 20 %

natriumhydroxidlösning). Koka upp mediet, filtrera

genom ett bomullsgasfilter, hällt i sterila flaskor eller

kolvar och steriliserades i en autoklav i 15-20 minuter vid 0,5 atmosfärer

tryckmätare (112®).

Tekniken för att framställa MPA från färska bovina hjärtan är densamma som

bara koka massan av krossade hjärtan i vatten bör

producera 20 minuter istället för 10.

Det är möjligt att förbereda basen av näringsmediet utan pepton.

I det här fallet använder de ovanstående metod för att förbereda MPA, men

pepton är uteslutet från dess sammansättning, det hackade kaninköttet kokas

5 minuter istället för 10 och sterilisera mediet i en autoklav i 10

minuter vid 0,8 atmosfärer på tryckmätaren (117®).

Ascites agar

Ascitesvätska ska erhållas från patienter med

ascites orsakad av hjärtsvikt, och

produceras genom en trokar till en steril flaska och tillsätt 5 %

kloroform för anestesi. I 10 dagar blandas vätskan med

kloroform genom att rotera flaskan och sedan lämna den vid

rumstemperatur tills kloroformen har lagt sig helt på botten av flaskan

och rensa vätskan. Efter detta, om nödvändigt, transparent

ascitesvätska hälls i 50 ml sterila kolvar med

bomullspluggar och dagligen i 3 dagar placeras de i

vattenbad vid en temperatur av 56°C i 1 timme för att förånga kloroformen

genom en bomullsplugg. Efter att ha kontrollerat ascitesvätskan för

sterilitet den kan användas för berikning

näringsmedium för att isolera gonokocker i en koncentration av 1/3 och 1/4

volym av mediet, som bestäms experimentellt.

Recept på ascitesfria kulturmedier

1. MPA från kaninkött eller färska nötkreaturshjärtan

(pH=7,4-7,5) - 100 ml, kaseinhydrolysat för parenteral

proteinnäring - 2 ml, jästautolysat - 2 ml, vassle

boskapsblod - 20 ml (KDS-1 medium).

2. MPA från kaninkött eller färska nötkreaturshjärtan

(pH=7,4-7,5) - 100 ml, 5% hemohydrolysatlösning - 2 ml,

jäst autolysat - 2 ml, nötkreatursblodserum

boskap - 20 ml (GDS-2 medium).

3. MPA från kaninkött eller färska nötkreaturshjärtan

(pH=7,4-7,5) - 100 ml, medium 199 för vävnadskulturer utan

antibiotika - 20 ml, jästautolysat - 2 ml, blodserum

nötkreatur - 20 ml (medium 199-SDS).

4. MPA från kaninkött eller färska nötkreaturshjärtan

(pH=7,4-7,5) - 100 ml, färsk kycklingäggula - 10 ml,

nötkreatursblodserum - 20 ml (JS-medium).

Äggula erhålls sterilt från kycklingägg

omedelbart innan du bereder mediet. För detta,

Efter att ha förbehandlats med alkohol, öppnas skalet med en steril

pincett och häll innehållet i ägget i en steril tratt. Efter

Efter att vitan har runnit ut överförs äggulan som finns kvar i tratten till

sterila behållare och en mätpipett tar det som krävs

produktion av näringsmedium volym äggula.

Framställningen av jästautolysat är som följer.

Bagerijäst krossas och läggs i en flaska större än

volymen jäst som tas är 4 - 5 gånger och lämnas för autolys för två

dagar i torkskåp eller termostat vid 60°C. Sedan tjock

den bruna massan späds med en trippel volym varmt kranvatten

vatten, blanda väl och centrifugera två gånger i 10 minuter kl

1000 rpm (tills vätskan klarnar). Supernatant

vätskan dräneras, 0,5% natriumklorid tillsätts till den, justerad

pH till 7,4-7,5 och autoklavera i 30 minuter vid 1 atmosfär

tryckmätare (120°). Förvaras i små förpackningar i kylen kl

Jästautolysat kan ersättas med en 1,5 % lösning

foder jästextrakt (EKD) i samma mängd (2 ml) 1,5 %

EKD-lösning framställs i laboratoriet av torr EKD genom att lösa den i

sterilt destillerat vatten. Tillagad på detta sätt

det flytande extraktet hälls i sterila rör och steriliseras i

autoklavera vid 0,5 atmosfär på tryckmätaren i 20 minuter.

I alla ovanstående näringsmedia, blodserum

boskap kan ersättas med normala infödda

serum för bakteriologiska odlingsmedier, som

är samma serum, men med tillsats av ett konserveringsmedel.

Beredning av anrikat medium

MPA, som finns i en flaska eller kolv, smälts i vatten

bad, kyl till 56-58° och tillsätt ingredienser till det

förhållanden som anges tidigare i recepten. Berikad med MPA 3-3,5

ml hälls i sterila rör, mediet klipps och fuktas

0,5 ml steril köttpeptonbuljong eller isotonisk

natriumkloridlösning efter att den härdat. För kontroll

För att säkerställa sterilitet placeras mediet i en termostat vid 35-37°C per dag.

Alla ovanstående ascitesfria medier, förutom äggmedier, är genomskinliga,

Det är lätt att särskilja kolonier av mikroorganismer på dem. onsdag,

berikad med ägg, den är grumlig, den är gul, växt på

Dess kolonier, i synnerhet gonokocker, är dåligt särskiljbara. Dock tillväxt

gonococcus är rikligt på detta medium och dess kolonier kan lätt vara

upptäckt genom att behandla tillväxt med en 1% lösning

dimetylparafenylendiamin eller annat oxidasreagens,

som färgar gonococcus kolonier rött, bra

kontrasterande mot miljöns gula bakgrund. Användning av äggula

miljöer utan att behandla tillväxten av mikroorganismer med ett oxidasreagens är det inte

Kvaliteten på varje ny serie av laboratorienäringsmedium

produktionen måste kontrolleras genom att så på den

patologiskt material från patienter med bakterioskopisk

gonokocker hittades.

Hållbarheten för MPA i kylskåp vid 4°C bör inte överstiga 1

månad, berikad miljö - 7 dagar.

På grund av det faktum att för ovanstående miljö är en kort tidsperiod möjlig

lagring har en produktionsmetod utvecklats

lyofiliserat ascitesfritt näringsmedium, som är under

med titeln "Näringsmedium för isolering av gonokocker, torr"

Finns i två flaskor: del I (medium bas) och del II

(anrikningsmedel). Att förbereda arbetsmiljön i del I

du måste tillsätta 100 ml sterilt destillerat vatten och värma upp

i ett vattenbad vid 100° tills innehållet i flaskan är helt upplöst

(inom 30 minuter). Extra tid för att hålla mediet i vatten

Det finns inget behov av ett bad, eftersom detta minskar dess kvalitet. Del II inkluderar

24 ml sterilt destillerat vatten (upplösning av anrikning

ämnen uppstår omedelbart). Sedan, om villkoren är uppfyllda

sterilitet, del II överförs till del I, kyls till 56°C,

blandade, hällde i sterila rör, klippte och

återfukta som beskrivits tidigare.

Det torra mediet framställs av kaninkött eller nötkreaturshjärtan,

förutom de berikande ämnen som anges i recept 1 (KDS-1 medium)

den innehåller orotsyra i en koncentration av 1 μg/ml. onsdag

hög kvalitet, bekväm för användning i bakteriologiska

laboratorier, eftersom för att omvandla en torr miljö till en arbetsmiljö krävs det

endast sterilt destillerat vatten.

Att använda ett ascitesfritt näringsmedium med tillsats av

antibiotika och orotsyra ger bra resultat med

bakteriologisk diagnostik, inklusive extragenetisk

gonorré: gonorré i tonsillerna och svalget, ändtarmen. Antibiotika

läggs till för att undertrycka tillväxten av åtföljande gonokocker

bakterieflora, vilket ökar intensiteten av gonokocktillväxt,

underlättar upptäckten av enstaka kolonier och isolering i ren

kultur. Tillsätt 20,0 U/ml polymyxin M-sulfat och 6,2 U/ml

ristomycinsulfat; istället för det senare kan du använda

lincomycinhydroklorid - 2 mcg/ml. Orotsyra injiceras i

sammansättningen av näringsmediet i en mängd av 1 μg/ml.

För att göra detta, ta ett prov av orotsyra 1 mg (1000 μg) och

utspädd i 1,0 ml sterilt destillerat vatten (get

arbetslösning innehållande 1000 mcg som kan förvaras i

kylskåp i 10 dagar) och steriliseras i ett vattenbad 15

minuter, ta sedan 0,1 ml av den resulterande lösningen och tillsätt den till

100 ml berikat näringsmedium. Miljö med antibiotika

måste användas samtidigt med antibiotikafritt medium

(ett provrör med ett medium med antibiotika, det andra utan dem), eftersom

även om det är sällsynt finns det stammar av gonokocker som är känsliga för

ovanstående antibiotika.

Lagringsmedium (transport).

Konserveringsmediets sammansättning: 1) 1 liter destillerat vatten,

klorfri, 30 g agar-agar; 2) 900 ml destillerad

klorfritt vatten, 2 ml tioglykolsyra, 12 ml 1M

natriumhydroxidlösning, 100 ml 20 % vattenlösning av natrium

monosubstituerat fosfat, 20 ml 1% kloridlösning

kalcium. Den sista blandningen (2) tillsätts till den nyberedda

agar (1), justera pH till 7,3-7,4, häll 10 ml av mediet i

sterila provrör, steriliserade med strömmande ånga i 1 timme.

Bomullspinnar på träpinnar eller stavar

rostfritt stål med en diameter på ca 2 mm, monterad i bomull

korkar, koka i 20 minuter i fosfatbuffert, pH = 7,4, och

impregnera i 24 timmar i en 1% vattenhaltig suspension tunt

krossat kol. Efter torkning, bomullspinne

korrigerad, införd i bakteriologiska rör

lämplig diameter (lika med diametern på provrören med mediet) och

Sterilisera i en autoklav i 20 minuter vid 1 atmosfär (temperatur

För att förbereda fosfatbuffert, förbered två lösningar: 1

lösning - 28,4 g natrium löst i 1 liter destillerat vatten

disubstituerat fosfat (0,2M); 2 lösning - i 1 l

lös 27,8 g citronsyra (0,1 M) i destillerat vatten.

Blanda 181,7 ml av lösning 1 och 18,3 ml av lösning 2.

Produktion av grödor med hjälp av konserveringsmedia

utförs enligt följande. Läkare undersöker en patient

tar bort en tampong från provröret, för in den på platsen för sjukdomen på

några sekunder för blötläggning (du kan göra några

rörelser medurs och moturs), tar bort den utan att röra den

omgivande föremål i ett provrör med konserveringsmedium. Överst

Med hjälp av en bomullsplugg stängs provröret med en gumminippel. Innan du skickar

material till det bakteriologiska laboratoriet, kulturerna förvaras vid 4°C

i kylen under en minsta period, men inte mer än ett dygn. Samtidigt

ta patologiskt material och göra utstryk för

bakterioskopisk undersökning, som skickas till

laboratorium tillsammans med kultur. I det bakteriologiska laboratoriet

omedelbart efter mottagandet av svabbar med patologiskt material

tas bort från lagringsmediet och används för att så på ytan

lutande näringsmedium i provrör. Varje tampong gör

ympning på ett näringsmedium i två provrör. Sådd på ytan

näringsmediet ska produceras i en sicksackrörelse

längs mediets yta, rotera pinnen. Om diametern på provrören är

konserveringsmediet och näringsmediet liknar varandra, du kan använda en pinne

efter inokulering, lämna i det andra provröret i kontakt med

näringsmedium. Grödorna placeras i en termostat och odlas kl

36-37е i en exsickator. Observera att vid användning

konserveringsmiljö, tillväxt av gonokocker kan ske senare än i

direkt ympning av patologiskt material på näringsämne

Arbeta med grödor

Odling av gonokocker kan göras i provrör eller

Petriskålar; den första metoden ger betydande besparingar

miljö. För att öka andelen inokulering av gonokocker, inokulerade

näringsmedia placeras i en termostat i en exsickator med 20%

reaktioner mellan svavelsyra och natriumbikarbonat: i en exsickator

en volym på 5 liter placeras glas med 50 ml 10% svavelsyra, in

Gonokocker är bönformade, arrangerade i form av diplokocker, omgivna av en mikrokapsel, har inga flageller och bildar inte sporer, liknande meningocker. Cellväggen har ett yttre membran, vars proteiner är indelade i tre grupper efter deras funktionella betydelse. Gonokocker kännetecknas av närvaron av pili, som skiljer sig från varandra i sina antigena egenskaper (16 antigena varianter). Gonokocker odlas på näringsmedia som innehåller naturligt protein (blodserum, ascitesvätska). De växer bättre vid 3-5% CO2. Transparenta kolonier med släta kanter bildas på ascitagarus. Av kolhydrater är det bara glukos som fermenteras, katalas och cytokromoxidas bildas - enzymer som är typiska för Neisseria.

Antigener

Den antigena strukturen hos gonokocker är variabel. Detta beror på närvaron av många antigena varianter av pili, som bildas under utvecklingen av infektion.

Patogenicitet och patogenes

Gonokocker fäster vid det cylindriska epitelet i urinröret, den vaginala delen av livmoderhalsen, ändtarmen, ögats bindhinna, såväl som spermier och protozoer (Trichomonas, amöba). Adhesion uppstår på grund av pili och proteiner i cellväggens yttre membran. En karakteristisk egenskap hos gonokocker är deras förmåga att penetrera leukocyter och föröka sig i dem. Lipooligosackariddelen av cellväggen har en toxisk effekt. Kapselpolysackarider hämmar fagocytos. Förbinder med villi av det cylindriska epitelet i urinrörets slemhinna, och hos kvinnor, den endocervikala kanalen, gonokocker tränger in i cellerna med deltagande av proteiner i cellväggens yttre membran. Detta leder till utveckling av akut uretrit, cervicit och skador på livmoderhalsen, bihang (rör, äggstockar) hos kvinnor, sädesblåsor och prostatakörtel hos män. Med extragenital lokalisering kan gonokocker skada ändtarmen och tonsillerna och även orsaka blenorré (konjunktivit) hos nyfödda. Infektion uppstår under passagen av födelsekanalen hos en mor med gonorré.

Immunitet

Med gonorré uppstår ett humoralt immunsvar. De resulterande antibakteriella antikropparna har emellertid inte skyddande egenskaper. Under sjukdomsförloppet bildas IgA, som undertrycker fästningen av patogenens pili till cellerna i urinrörets slemhinna. De kan dock inte skydda slemhinnan från efterföljande infektion av andra generationer av gonokocker, vilket är förknippat med en förändring i deras antigena struktur. Detta leder till återinfektioner och skov, samt att sjukdomen blir kronisk.

Gonokockinfektioner

Orsaksmedlet för gonorré och blenorré N.gonorrhoeae (preliminärt klassificerad som gonococcus) tillhör familjen Neisseriaceae, släktet Neisseria. I utstryk från patientutsöndringar har gonokocker formen av kaffebönor, är gramnegativa och är placerade i par både inuti leukocyter (ofullständig fagocytos) och utanför cellerna. Enligt deras morfologiska egenskaper är de väldigt lika meningokocker. Gonokocker kännetecknas av polymorfism - det finns små och stora celler, sällan stavformade.De är väldigt kräsna när det gäller näringsmedier. De växer bättre på media som innehåller blod, serum och ascitesvätska. Gonokocker innehåller protein- och polysackaridantigener, enligt vilka de är uppdelade i 16 serovarer, men de är ännu inte fastställda i rutinmässiga bakteriologiska laboratorier. För den mikrobiologiska diagnosen av gonokockinfektioner används bakterioskopiska, bakteriologiska, serologiska och allergiska metoder.

Ta material för forskning

För att kunna utföra bakteriologisk och bakterioskopisk diagnostik med värdighet och god kvalitet är det viktigt att korrekt ta kliniskt material. Som regel bör det utföras av en läkare Hos män undersöks utsöndringen av urinröret, parauretralkanalerna, ändtarmen och, om indikerat, material från orofarynx, liksom utsöndringen av prostatakörteln efter dess massage. Du kan också undersöka sediment och "trådar" av urin, men gonokocker upptäcks mycket mer sällan i dem. Innan du tar material från urinröret ska patienten inte kissa på 4-5 timmar och inte använda antimikrobiella läkemedel och desinfektionsmedel. Urinrörets yttre öppning torkas först av med en steril bomullspinne fuktad med en 0,85 % natriumkloridlösning, sedan med en torr bomullspinne. Utstryk är inte gjorda av gödsel, som flyter fritt, utan från material som tas genom att skrapa från urinrörets slemhinna med en bakteriologisk slinga eller en speciell Volkmann-sked. För mindre flytningar är det nödvändigt att utföra en preliminär urinrörsmassage. Hos kvinnor tas material från urinröret, paraurethral passager, livmoderhalsen, ändtarmen och, om så är indicerat, från orofarynx. Först rengörs slidan från sekret, urinröret masseras och materialet avlägsnas genom att skrapa med en bakteriologisk slinga eller en Volkmann-sked. Livmoderhalsen torkas först av med en steril bomullspinne för att ta bort slemproppen. Utsläpp från livmoderhalskanalen tas med en bakteriologisk slinga eller pincett. Material från det distala ändtarmen tas med hjälp av en Volkmann-sked på ett blindt sätt, d.v.s. utan någon förberedelse av patienten, eller med användning av ett rekoskop eller rektalspekulum. I detta fall tas materialet som studeras direkt från den synliga platsen för lesionen Med orofaryngeal gonorré, slem De tas från orofarynx med sterila bomullspinnar på speciella hållare gjorda av ståltråd.För att diagnostisera lenorré avlägsnas konjunktivutsöndringen med en bakteriologisk slinga. I sällsynta fall kompliceras gonorré av gonosepsis, endokardit eller artrit. Då är materialet för juslidzhenya blod eller ledvätska. Med hänsyn till gonokockernas höga känslighet för temperaturfluktuationer, levereras materialen som studeras till laboratoriet i speciella termosar eller påsar med en värmedyna.

Bakterioskopisk undersökning

Bakterioskopisk undersökning är den vanligaste, men mindre känsliga metoden för laboratoriediagnostik av gonorré och blenorré jämfört med isolering av faktiska kulturer. Detta gäller särskilt för det kroniska sjukdomsförloppet, när testmaterialet innehåller en liten mängd gonokocker. Men med korrekt insamling av material, upprepade undersökningar av patienter, användning av provokationsmetoder och kvalificerad bedömning av utstryk, gör bakterioskopisk undersökning det ganska ofta möjligt att snabbt och korrekt diagnostisera sjukdomen.Två tunna, enhetliga utstrykspreparat görs från materialet som studeras. Den ena är färgad med metylenblått, den andra är färgad med Gram-metoden. I frånvaro av metylenblått kan ett utstryk färgas med en 1% vattenlösning av kristallviolett eller 0,5% lösning av briljantgrönt i 1 minut. En slutsats om närvaron av gonokocker görs baserat på deras egenskaper: gramnegativ färg, diplokockerstruktur, form av kaffebönor, placering inuti leukocyter. Under påverkan av antibiotika och andra kemoterapiläkemedel, såväl som vid kronisk gonorré, morfologin och färgen på gonokocker kan ändras. Enskilda celler får olika former och storlekar (de så kallade Asch-formerna). Dessutom kan testmaterialet innehålla gramnegativa kocker som liknar gonokocker från släktet Veillonella. Detta begränsar i viss mån det diagnostiska värdet av den primära mikroskopimetoden De bästa och mest tillförlitliga resultaten erhålls med immunfluorescensmetoden. Tunna utstryk från patientens sekret fixeras i brännarlågan. Fluoresceinisotiocyanatmärkt antigonokockserum appliceras på dem i 1 timme vid 35 ° C i en fuktig kammare. Efter detta tvättas utstrykarna två gånger med en buffertlösning, buffrade med glycerol appliceras och täcks med täckglas. När gonokocker interagerar med märkta antikroppar, är ett karakteristiskt sken runt bakteriecellerna synligt under ett fluorescerande mikroskop.

Bakteriologisk forskning

Indikationer för isolering av rena kulturer av gonokocker är upprepade negativa bakterioskopiresultat, närvaron av mikroorganismer som är misstänkta för gonokocker, men inte morfologiskt identifierade, samt för att tillförlitligt fastställa botemedlet av sjukdomen. Det är mycket viktigt att placera grödorna i termostaten omedelbart. Om det är omöjligt att utföra odlingar på platsen för insamling av materialet, kan du hänga en bomullspinne i ett provrör med Stewarts transportmedium, vilket säkerställer bevarandet av livsdugligheten hos gonokocker under leverans till laboratoriet. ut enligt standardschemat i ett av de speciella näringsmedierna i provrör eller petriskålar (CDS, Bailey, blod- eller serumagar, torrt näringsmedium från Kharkov-företaget "Biolek" för produktion av bakteriella och medicinska preparat). För diagnostisk odling av gonokocker i många länder används också "choklad"-agar. De bästa medierna är de baserade på kaninköttsagar eller färska nötkreaturshjärtan. Att lägga till 20 enheter/ml polymyxin och 2 μg/ml lincomycin till dem ökar signifikant frekvensen av inokulering av gonokocker, eftersom dessa läkemedel hämmar tillväxten av andra bakterier. Före sådd värms alla medier i en termostat i 15-20 minuter. Skålar och provrör med kulturer placeras i exsickatorer, där en atmosfär av 20 % CO2 skapas. Kolonier växer vanligtvis inom 18-24 timmar, men sen tillväxt är också möjlig. Sedan hålls grödorna i en termostat (i en exsickator!) i upp till 8 dagar, varvid tillväxtens utseende kontrolleras dagligen. De uppvuxna kolonierna av gonokocker har en rund, något konvex form, släta kanter, en glänsande yta och en slem konsistens. De är genomskinliga, som daggdroppar, nästan färglösa, även om vitaktiga varianter också kan förekomma. De resulterande kolonierna undersöks makroskopiskt och mikroskopiskt. I utstryk finns gonokocker i par, tetrader och kluster. Typiska kolonier subodlas på serumagar-lutningar för att isolera en ren kultur. Den slutliga identifieringen utförs med hänsyn till de morfologiska, kulturella, enzymatiska och antigena egenskaperna. Biokemiskt är gonokocker lite aktiva. På vasslemedier med 1,5% av olika kolhydrater sönderdelas de endast glukos, men inte maltos och sackaros.Oxidasaktiviteten hos isolerade kulturer bestäms genom att applicera en 1% lösning av dimetylparafenylendiamin på kolonierna (efter mikroskopi). Oxidaspositiva kolonier blir först röda och senare svarta.Differentiering av gonokocker från andra arter av släktet Neisseria är av särskild betydelse vid diagnosen orofaryngeal gonorré. Som bekant finns det alltid ett stort antal gramnegativa Neisseria på slemhinnan i tonsillerna, munnen och nasofarynxen - representanter för den normala mänskliga mikrofloran. Pålitliga metoder för att identifiera gonokocker är immunfluorescens, latex och koaglutinationsreaktioner, samt bestämning av enzymatiska egenskaper. Det är absolut nödvändigt att utföra en kvalitativ bestämning av mikroorganismers känslighet eller resistens mot antibiotika med agar-diffusionsmetoden med hjälp av skivor. För att öka frekvensen av att hitta gonokocker i utstryk under primärmikroskopi och mer tillförlitlig isolering av renkulturer, särskilt i fall av trögt, kroniskt sjukdomsförlopp, metoder för att provocera gonorré används , det vill säga en artificiell förvärring av den patologiska processen, som ett resultat av vilket ett större antal gonokocker uppträder i sekretet. De viktigaste av dessa metoder är: a) kemisk - instillation av en 0,5% lösning av silvernitrat i urinröret hos män, smörjning av livmoderhalskanalen med en 2-5% lösning av silvernitrat; b) mekanisk - införande av en direkt bougie in i urinröret i 10 minuter, eller främre uretroskopi; c) biologisk - intramuskulär injektion av gonovaccin i en mängd av 500 miljoner mikrobiella kroppar eller pyrogenal 200 MTD; d) näringsmässig - konsumtion av salt, kryddig mat; e) termisk - uppvärmning av könsorgan med en induktotermisk ström, f) fysiologisk - ta utstryk under menstruation Det är ännu bättre att kombinera flera metoder för provokation, till exempel kemiska, näringsmässiga och biologiska. Nyligen har polymeraskedjereaktion använts för att mer tillförlitligt identifiera orsaksmedlet av gonorré. Det låter dig identifiera patogenen i fall av kronisk gonorré, när bakterioskopisk och bakteriologisk undersökning inte ger positiva resultat.

Serologisk diagnos

Serologisk diagnos av gonorré utförs relativt sällan, främst i dess kroniska förlopp, när bakterioskopiska och bakteriologiska studier inte ger positiva resultat. Under moderna förhållanden utförs enzymimmunanalys, RNGA och Bordet-Gengou-reaktioner (BRS). Antigenerna för dessa reaktioner är: värmedödat polyvalent gonokockvaccin, ultraljudsinaktiverat vaccin, protein- och polysackaridfraktioner av gonokocker, samt pyridinantigen. ELISA och RNGA är mycket specifika och tillförlitliga serologiska reaktioner. Jämfört med tidigare har RSK tappat sin roll något. Det har inget praktiskt värde vid diagnos av akut gonorré, eftersom det behandlas före bildandet av en betydande mängd antikroppar. Det är i allmänhet olämpligt för att fastställa tillförlitligheten av ett botemedel. Bordet-Gengou-reaktionen är viktig vid serodiagnos av kronisk gonorré, särskilt i dess komplicerade former (gonosepsis, metrit, artrit, prostatit, etc.) Det diagnostiska värdet av allergitest är något devalverat av att de är positiva för många år efter gonorré. För att sätta upp dem injiceras 0,1 ml färskt gonokockvaccin (100 miljoner mikrobiella celler i 1 ml) intradermalt. Efter 24 timmar observeras hyperemi, ibland med svullnad i mitten.

Behandling och förebyggande

För kemoterapi av gonorré används antibiotika: beta-laktamer (penicilliner, cefalosporiner) och andra antibiotika. Vaccinell förebyggande av gonorré utförs inte på grund av bristen på effektiva vacciner. För att förhindra blenorré får alla nyfödda en lösning av en av de listade antibiotika instillerad på ögats bindhinna.

Denna agar med tillsats av blod, hemoglobin eller andra tillsatser rekommenderas för selektiv isolering av gonokocker.

Förening**:

** Sammansättningen har verifierats och justerats för att uppfylla de erforderliga parametrarna

Förberedelse:

Blanda 7,2 g pulver i 100 ml destillerat vatten för att framställa ett medium med dubbel styrka. Värm till koka för att helt lösa upp partiklarna. Sterilisera genom autoklavering vid 1,1 atm (121°C) i 15 minuter. Kyl till 50°C och tillsätt aseptiskt separat beredd 100 ml 2% steril hemoglobinlösning (FD022) och GC-tillskott (FD021). Blanda noggrant och häll i petriskålar. För att ge selektiva egenskaper kan antibiotika som ingår i följande tillsatser tillsättas till mediet: VNC (FD023), VCNT (FD024), Linco T (FD026), Vanco (FD028).

För att förbereda chokladagar, förbered ett medium med normal koncentration genom att röra 3,6 g pulver i 100 ml destillerat vatten. Sterilisera, tillsätt upp till 5 % (v/v) sterilt defibrinerat blod och värm mediet vid 80°C i 10 minuter.

Princip och utvärdering av resultatet:

Denna agar med tillsats av blod eller hemoglobin och andra tillsatser rekommenderas för selektiv isolering och odling av kräsna mikroorganismer som gonokocker och Haemophilus influenzae-bakterier. Johnston utvecklade chokladagar på vilken tillväxt kunde uppnås inom 24 timmar Neisseria gonorrhoeae(1). Senare förbättrade andra författare (2) mediet genom att introducera hemoglobin i dess sammansättning.

Agar innehåller en speciell pepton - en näringskälla för mikroorganismer. Stärkelse hjälper till att neutralisera giftiga ämnen som produceras av Neisseria, och fosfater motverkar pH-förskjutningen till följd av bildandet av aminer, vilket också kan påverka mikroorganismernas tillväxt och livsduglighet. Hemoglobin fungerar som en källa till faktor X för hemofila bakterier. En annan tillsats berikar mediet med faktor V (NAD, nikoninamidadenindinukleotid), nödvändig för Haemophilus influenzae, samt aminosyror, vitaminer, järnjoner etc., vilket stimulerar tillväxten av patogena neisseria.

Använd inte bomullspinne för att samla upp material. Sådd utförs omedelbart efter insamling av materialet. Det måste göras så att det finns zoner med tät och gles tillväxt. Ympningen inkuberas vid 37°C i en atmosfär av 5-10% koldioxid och 70% luftfuktighet. Alla misstänkta kolonier bör testas med biokemiska och/eller serologiska tester.

Kvalitetskontroll:

Pulver utseende:

Homogent friflytande ljusgult pulver.

Densitet av det färdiga mediet:

Ett medium bildas motsvarande i densitet en 1,0 % agargel.

Färg och transparens för det färdiga mediet:

Mediets bas är ljusgul till färgen, transparent eller lätt opaliserande. Efter att hemoglobin tillsatts blir mediet chokladbrunt och ogenomskinligt om en gel bildas i petriskålarna.

Miljöns surhet:

Vid 25°C har den vattenhaltiga lösningen (3,6 % vikt/volym) ett pH på 7,2 ± 0,2.

Kulturella egenskaper:

Tillväxtegenskaper för referensstammen efter 40-48 timmar vid 35-37°C på chokladagar framställd på denna basis, i närvaro av en atmosfär av 5-10% koldioxid och 70% luftfuktighet.

Neisseria gonorrhoeae tillhör familjen Neisseriaceae, släktet Neisseria. Gonokocker upptäcktes av Neisser 1879 och hela familjen fick sitt namn efter honom.

Morfologi. Gonokocker är diplokocker som består av två bönformade kocker som ligger konkava mot varandra (påminner om kaffebönor). Storleken på gonokocker är 1,2-1,3 × 0,7-0,8 mikron. De är polymorfa; tillsammans med stora finns det mycket små, oregelbundet formade L-formade bakterier. Gonokocker är orörliga och sporrar inte. En kapselformad substans finns i det patologiska materialet (pus). Gram negativ. Under påverkan av droger och andra ämnen förändras de snabbt: grampositiva former uppstår. I patologiskt material är de lokaliserade intracellulärt (i en leukocyt), men kan vara utanför cellen. De kan hittas i form av individuella kocker (se fig. 4).

Odling. Gonokocker är aeroba. Mycket krävande på näringsmedia. De växer på media som innehåller naturligt protein (mänskligt) - blod, serum, vid en temperatur på 37 ° C och ett pH på 7,2-7,4. Medierna måste vara nyberedda och fuktiga. Sådd bör göras omedelbart efter att materialet tagits. På ett serummedium bildar gonokocker små kolonier 1-2 mm, transparenta, glänsande med släta kanter, som liknar daggdroppar. Det finns ingen hemolys i blodmedium. I vasslebuljong ger de en lätt grumlighet och en hinna som lägger sig i botten av provröret. Om tillväxten är dålig efter 24 timmar, lämnas grödorna i termostaten för den andra dagen.

Enzymatiska egenskaper. Sackarolytiska egenskaper är svagt uttryckta. Gonokocker bryter bara ner ett socker - glukos, och producerar syra. De har inte proteolytiska egenskaper.

Toxinbildning. Gonokockers cellvägg innehåller ett giftigt ämne - lipopolysackarid (lite studerad).

Antigen struktur. Den antigena strukturen är heterogen och förändras lätt under påverkan av miljöfaktorer. Det finns ingen allmänt accepterad uppdelning av gonokocker i serovarier och serotyper.

Motståndskraft mot miljöfaktorer. I den yttre miljön är gonokocker inte särskilt stabila. Vid en temperatur på 56-60° C dör de. Vid en temperatur på 40° C minskar deras livsduglighet kraftigt. Låga temperaturer och torkning förstör dem snabbt. Men de förblir i pus i upp till 24 h. Desinfektionslösningar - 1% fenollösning, kvicksilverklorid 1:1000 dödar gonokocker inom några minuter. Gonokocker är särskilt känsliga för silversalter - en 1% silvernitratlösning dödar dem omedelbart. UV-strålar dödar dem inom några minuter.

Djurkänslighet. Djur är inte känsliga för gonokocker. Men intraperitoneal injektion av gonokocktoxin i vita möss orsakar deras död.

Smittkällor. En person med gonorré.

Överföringsvägar. Kontakta hushållet (sexuellt), mindre ofta genom kontaminerade föremål (handduk, svampar, etc.).

Sjukdomar hos människor. Gonorré och blenorré.

Patogenes. Den naturliga värden för gonokocker är en sjuk person. Gonokocker penetrerar genom urinrörets slemhinnor (hos kvinnor, urinröret och livmoderhalsen). Gonokockers patogenicitetsfaktor är närvaron av pili, som, som förbinder sig med mikrovilli i det cylindriska epitelet, underlättar penetrationen av gonokocken i epitelcellen, vilket orsakar en akut inflammatorisk process i slemhinnan.

Kliniskt manifesteras gonorré av smärta under urinering, flytning av pus från urinröret och slidan. Sjukdomen är akut, men blir ibland kronisk. Gonokocker kan orsaka gonorré konjunktivit - blenorré (purulent inflammation i ögonslemhinnan hos nyfödda). Gonokocker penetrerar sällan från urinröret till andra organ, men ibland kan de orsaka artrit, endokardit, etc.

Immunitet. Det finns ingen naturlig resistens mot gonokocker. Den överförda sjukdomen skapar inte heller immunitet. Den observerade fagocytosen är ofullständig.

Förebyggande. Hälsoutbildning. Öka den kulturella och hygieniska nivån. Det finns inget specifikt förebyggande. För att förhindra blenorré måste barn injiceras i konjunktivalsäcken omedelbart efter födseln med 1-2 droppar av en 30% albucid lösning.

Behandling. Antibiotika (penicillin, bicillin, streptomycin, etc.). Sulfonamidläkemedel används också. För den kroniska formen används gonokockvaccin.

Kontrollfrågor

1. Beskriv gonokockers morfologiska egenskaper.

2. Vilken är den enzymatiska aktiviteten och toxinproduktionen hos gonokocker?

3. Vad är resistensen hos gonokocker. För vilket läkemedel är gonokocker särskilt känsliga?

4. Vilka sjukdomar orsakas av gonokocker och deras patogenes.

Mikrobiologisk undersökning

Syfte med studien: identifiering av gonokocker och antigonokockantikroppar.

Material för forskning

1. Flytningar från urinrörets slemhinna hos män.

2. Utsöndring från slemhinnan i urinröret och livmoderhalsen hos kvinnor.

3. Purulent flytning från ögonen.

4. Blod för serum.

Notera. För bakterioskopisk och bakteriologisk undersökning tas material: 1) före start av antibiotikabehandling: 2) tidigast 10 dagar efter avslutad antibiotikabehandling; 3) tidigast 2 timmar efter den sista urineringen; 4) tidigast 2 timmar efter sköljning.

Grundläggande forskningsmetoder

1. Mikroskopisk (används främst för akuta former).

2. Mikrobiologisk.

3. Serologiska.

Studiens framsteg

Andra dagen av studien

Ta ut skördarna ur termostaten och inspektera dem. Studerar kolonier. De gör utstryk. Om det finns misstänkta gramnegativa diplokocker, subodlas kolonier på lutande medium i provrör (mediet måste vara nyberedd och innehålla en tillräcklig mängd kondensat) och testas för oxidas. För att göra detta appliceras en droppe 1% dimetylparafenylendiaminlösning på kolonin med en pipett; kolonierna ändrar färg från mörkbrun till svart.

Tredje dagen av studien

Kulturerna tas ut ur termostaten, utstryk görs av den lutande agaren, färgas med Gram och undersöks mikroskopiskt. Inokulera på Hiss media (laktos, glukos, mannitol och maltos). Dessa kolhydrater bör innehålla 30 % blodserum. De inokulerade provrören placeras i en termostat.

Fjärde dagen av forskning

Ta bort rören från termostaten, om det inte finns någon tillväxt, lämna dem i termostaten i ytterligare 1-2 dagar. Om det finns tillväxt beaktas resultaten (tabell 28).

Serologisk diagnos

Tredje sjukdomsveckan. I det kroniska sjukdomsförloppet och i tveksamma fall utförs RSC med hjälp av patientens serum (se kapitel 12). En dödad kultur av gonokocker, som framställs under industriella förhållanden, används som antigen. Du kan använda den indirekta hemagglutinationsreaktionen (se kapitel 12).

Kontrollfrågor

1. Vilket material används för att identifiera gonokocker och hur erhålls det?

2. Hur lång tid efter urinering (eller sköljning hos kvinnor) kan material tas för forskning?

3. Vilken forskningsmetod är den främsta för den akuta formen och vilken för den kroniska formen av gonorré?

4. När och vilket serologiskt test görs vid misstanke om gonorré?

5. Vilka mikroorganismer behöver skilja gonokocker från?

Få medicinen från din lärare. Studera det och skissa gonokockerna som finns inuti och utanför leukocyten med hjälp av Gram-färgning.

Kulturmedia

Gula medium. Till 100 ml MPA från kaninkött tillsätt 15 ml äggula (färskt kycklingägg), 6 ml fenolröd indikator, 1,5 ml socker löst i 1 ml sterilt destillerat vatten.

Näringsmedium ascites-agar. Till filtratet av buljongen framställd av kaninkött, tillsätt 2% agar, 1% pepton och 0,5% natriumklorid. Värm tills agarn löser sig, ställ in pH på 7,4-7,5 och alkalisera med 20 % natriumhydroxid. Mediet bringas att koka, filtreras, hälls i sterila flaskor och steriliseras i en autoklav i 15 minuter vid 115°C.

Recept för ascitesfria odlingsmedier (MPA pH 7,4-7,5).

1) köttvatten från kaninkött eller oxhjärtan - 100 ml

kaseinhydrolysat - 2 ml

jäst autolysat - 2 ml

nötkreatursblodserum - 20 ml

2) köttvatten från kaninkött eller oxhjärtan - 100 ml

5% lösning av hemohydrolysat - 2 ml

jäst autolysat - 2 ml

nötkreaturserum - 20 ml

3) köttvatten från kaninkött eller oxhjärtan - 100 ml

kycklingäggula - 10 ml

nötkreatursblodserum - 20 ml

Tillväxten av gonokocker på dessa medier är riklig. Gonokockkolonier kan upptäckas med ett oxidastest, där de blir röda och blir svarta.