Культивирование вирусов в куриных эмбрионах. Культивирование на куриных эмбрионах Заражение в кровеносные сосуды ХАО

Большинство известных вирусов обладают способностью размножаться в курином эмбрионе (рис.4). Используют эмбрионы в возрасте от 8 до 14 дней в зависимости от вида вируса, способа заражения и задач исследования. Вирусы гриппа культивируются в 9-10, оспо вакцины - в 12, паротита - в 7-дневных куриных эмбрионах. Размножение вируса в куриных эмбрионах происходит в разных частях зародыша, что связано с особенностями тропизма вируса . Методику выращивания вируса в курином эмбрионе широко используют при промышленном культивировании.

Строение куриного эмбриона и способы его заражения: 1 - в амнион ; 2 - в аллантоисную полость; 3 - в желточный мешок. (Микробиология и иммунология. Под редакцией Воробьева А.А. - М. - 1999).

Самая наружная внезародышевая оболочка, примыкающая к скорлупе или материнским тканям и поэтому служащая местом обмена между зародышем и окружающей его средой, называется Хорионом. У видов, откладывающих яйца, основная функция хориона — осуществление дыхательного газообмена. У млекопитающих хорион участвует в дыхании и питании, выделении, фильтрации и синтезе веществ. У примитивных организмов хорион - вторичная оболочка, а у продвинутых - оболочка плода. Полость между хорионом и амнионом - хорионамниотическая.

Амнион (греч. Amnion), Амниотический мешок или Водная оболочка — одна из зародышевых оболочек у эмбрионов пресмыкающихся, птиц, млекопитающих.

Эволюционно амнион возник для защиты эмбрионов от высыхания при развитии вне водной среды. Поэтому позвоночных животных, откладывающих яйца (рептилии и птицы), а также произошедших от рептилий млекопитающих относят к группе амниот («Животные с яйцевыми оболочками»). Предшествующие классы и надклассы позвоночных (головохордовые, круглоротые, рыбы, земноводные) откладывают икру в водную среду, поэтому им не требуется водная оболочка. Эти классы животных объединяют в группу анамний. В отличие от анамний амниотам не требуется водная среда для размножения и раннего развития, поэтому амниоты не привязаны к водоемам. В этом состоит эволюционная роль амниона.

При родах млекопитающих водная оболочка лопается, воды вытекают, а остатки амниона на теле новорождённого часто называют «рубашечкой», которая повсеместно с давних времён является знаком удачи и прочих суеверий (отсюда, в частности, русская поговорка про тех, кто «в рубахе родился»).

Аллантоис (от греч. allantoeid?s — колбасовидный) — эмбриональный орган дыхания высших позвоночных животных; зародышевая оболочка, развивающаяся из задней кишки эмбриона. Кроме того, аллантоис участвует в газообмене зародыша с окружающей средой и выделении жидких отходов. Аллантоис, вкупе с другими эмбриональными оболочками — амнионом и хорионом, является определящим признаком высших позвоночных животных — млекопитающих, птиц и рептилий.

У яйцекладущих птиц и рептилий аллантоис развивается вокруг эмбриона вдоль стенок скорлупы. В своём внешнем слое, называемым мезодермой , он создаёт разветвлённую сеть кровеносных сосудов, с помощью которых происходит взаимодействие с внешней средой. У млекопитающих аллантоис входит в состав пуповины.

Существует несколько способов заражения развивающегося куриного эмбриона: на хорионаллантоисную оболочку, в аллантоисную и амниотическую полости, желточный мешок, тело эмбриона.

Заражение на хорионаллантоисную оболочку применяется для выделения и культивирования вирусов, образующих на оболочках бляшки (вирусы вакцины, натуральной оспы, простого герпеса). Перед заражением яйца просвечивают с помощью овоскопа, карандашом очерчивают границу воздушного пространства и хорионаллантоисной оболочки. Поверхность яйца над воздушным пространством и в месте заражения протирают спиртом, прожигают, обрабатывают йодом и делают отверстие в полости воздушного мешка.

На месте заражения скорлупу удаляют так, чтобы не повредить подскорлупную оболочку, которую затем прокалывают короткой стерильной иглой, чтобы не повредить хорионаллантоисную оболочку. Воздух из полости воздушного мешка отсасывают. Вирусный материал (0,05 - 0,2 мл) наносят на хорионаллантоисную оболочку туберкулиновым шприцем с короткой иглой или пастеровской пипеткой. Отверстие в скорлупе закрывают стерильным покровным стеклом или тем же выпиленным кусочком скорлупы и по краям заливают расплавленным парафином. Зараженные эмбрионы располагают на подставке горизонтально и инкубируют в термостате. Вскрытие эмбрионов производится не раньше 48 часов инкубации. На зараженной оболочке обнаруживаются беловатые непрозрачные пятна разной формы (бляшки).

Заражение в аллантоисную полость . Вирус, введенный в аллантоис, размножается в эндодермальных клетках, переходя затем в аллантоисную жидкость. Заражение осуществляют следующим способом: в скорлупе над воздушной камерой острием скальпеля или ножниц производят прокол, после чего через отверстие в вертикальном направлении вводят иглу со шприцем, которая проходит через хорионаллантоисную оболочку и попадает в аллантоисную полость, материал вводится в объеме 0,1 мл и отверстие заливают парафином.

Заражение в желточный мешок. С этой целью используют эмбрионы 5 - 10-дневного возраста. Наиболее употребительны два метода заражения. По первому материал вводится через воздушное пространство. В центре яйца делают отверстие, помещают его на подставку тупым концом вправо и через отверстие в вертикальном направлении вводят иглу, надетую на шприц, игла проходит через хорионаллантоисную оболочку, аллантоисную полость в желток. В желточный мешок можно ввести от 0,1 до 0,5 мл вируссодержащего материала. После заражения отверстие в скорлупе заливают парафином, и эмбрион помещают в термостат. По второму методу на границе воздушного пространства с той стороны, где лежит желток (стороны, противоположной от эмбриона), делают прокол скорлупы, через который вводят инфекционный материал. Направление иглы должно быть к центру яйца.

Куриный эмбрион, инфицированный вирусным материалом, ставят в инкубатор на 2-3 дня, в зависимости от характера внесенного вируса. Для развития вирусов из проб, взятых у больного (например, смывов из носоглотки, использующихся при диагностировании гриппа), куриный эмбрион представляет хорошую среду. По типу изменений, скажем в тканях хорионаллантоисной оболочки, можно непосредственно определить, с каким вирусом мы имеем дело. Очень характерные изменения дают вирусы оспы и герпеса. Некоторые вирусы очень интенсивно размножаются в различных тканях куриного эмбриона и дают исходный материал для приготовления вирусных антигенов, необходимых при лабораторной диагностике вирусных заболеваний. Вирусы, размноженные в курином эмбрионе, были использованы как исходный материал для получения восемнадцати видов прививочных вакцин.

Несмотря на положительные стороны культур клеток, получивших столь широкое распространение в современных вирусологических лабораториях, куриный эмбрион во многих случаях сохранил свое первенствующее значение и по-прежнему служит классическим материалом для работы. Индикация вируса в курином эмбрионе производится по гибели эмбриона, положительной реакции гемагглютинации на стекле с аллантоисной или амниотической жидкостью, по образованию фокусных поражений («бляшек») на хорион-аллантоисной оболочке, а также в РГА.

Многие вирусы, поражающие человека и животных, могут в большей или меньшей степени размножаться в курином эмбрионе. Наличие плотной скорлупы защищает эмбрион от попадания микроорганизмов из внешней среды.

Метод культивирования вирусов в куриных эмбрионах используют при лабораторной диагностике вирусных инфекций, а также для изготовления вирусных вакцин и диагностических препаратов. Но этот метод имеет недостатки: 1) невозможно наблюдать в динамике за патологическими изменениями, происходящими в эмбрионе после заражения его вирусом; 2) при вскрытии эмбриона, зараженного вирусом, часто не обнаруживается видимых изменений и приходится выявлять наличие вируса в тканях, в жидкостях эмбриона, пользуясь другими вирусологическими методами (например, реакцией гемагглютинации); 3) метод культивирования в куриных эмбрионах пригоден не для всех вирусов. Несмотря на имеющиеся недостатки метод сравнительно прост, удобен и дешев и широко используется в вирусологических исследованиях. Наибольшее значение он имеет при работе с ортомиксовирусами, герпесвирусами, поксвирусами.

1.3.1. Строение куриного эмбриона

Куриный эмбрион покрыт известковой оболочкой – скорлупой, к которой изнутри примыкает скорлупная оболочка. В тупом конце яйца она раздваивается и заключает в себе воздушное пространство. Под скорлупной оболочкой находится хорионаллантоисная оболочка, в тупом конце яйца она проходит по внутренней стороне скорлупной оболочки, замыкающей воздушное пространство, эта оболочка богата кровеносными сосудами и служит эмбриону органом дыхания. Изнутри к ней прилегает аллантоисная полость, которая является органом выделения и защищает зародыш от высыхания и травм. Аллантоисная полость окружает зародыш, находящийся в полости амниона, которая наполнена околоплодной жидкостью. Через желточный канатик зародыш соединён с желточным мешком – основным источником питательных веществ.

Для успешного культивирования вирусов в организме развивающихся куриных эмбрионов требуется определённый температурный режим (36 0 -38 0), влажность (50-70%), а также достаточная вентиляция. Заражают куриные эмбрионы определённого возраста, инкубированные от 6 до 13 дней в зависимости от вида вирусов и метода заражения. Необходимо подготовить: подставку для яйца, пузырьки со спиртом и йодом, пробирку со стерильным парафином, покровные стёкла, пакетики стерильной ваты и марли, завёрнутую в бумагу стерильную посуду, стерильные шприцы, иглы, пинцеты, препаровальные иглы. Инструменты помещают в стаканчик со спиртом, где они находятся в течение всей работы, перед каждой манипуляцией их дополнительно стерилизуют обжиганием в пламени горелки. Руки перед работой тщательно моют, рекомендуется надеть маску из марли.

Для работы отбирают жизнеспособные эмбрионы, просвечивая инкубированные яйца в овоскопе. Жизнеспособный эмбрион подвижен, кровеносные сосуды оболочки заполнены кровью. Отобранные яйца тщательно дезинфицируют на тупом конце (или на боковой стороне яйца): скорлупу протирают спиртом, смазывают йодом, повторно обрабатывают спиртом и обжигают.

1.3.2. Заражение куриного эмбриона на хорионаллантоисную оболочку

Для заражения используют куриные эмбрионы 10-12-дневного возраста. Основные этапы заражения:

1. Яйцо помещают на подставку в вертикальном положении так, чтобы воздушный мешок находился наверху, проводят стерилизацию скорлупы на тупом конце яйца.

2. Над центром воздушного мешка делают прокол скорлупы с помощью препаровальной иглы.

3. в образовавшееся отверстие вводят браншу ножниц и вырезают окно в скорлупе около 1,5 см в диаметре.

4. Через отверстие осторожно надрывают иглой внутренний листок скорлупной оболочки и отслаивают на небольшом участке (0,5-1 см 2).

5. Производят заражение хорионаллантоисной оболочки путём нанесения на неё 0,1-0,2 мл вируссодержащего материала с помощью пастеровской пипетки или шприца.

6. Окошко в скорлупе закрывают специальной эластичной плёнкой или стерильным покровным стеклом и прикрепляют расплавленным парафином.

Заражённые эмбрионы помещают в термостат в вертикальном положении и инкубируют в течение 2-3 суток, после чего производят вскрытие по следующим правилам:

1. Яйцо помещают на подставку так, чтобы воздушное пространство было наверху, проводится стерилизация места вскрытия.

2. Стерильными ножницами срезают скорлупу по границе воздушного пространства.

3. Пользуясь пинцетом, снимают скорлупную оболочку по границе. Обнажённую хорионаллантоисную оболочку подрезают вдоль края скорлупы. Через образовавшееся отверстие выливают всё содержимое яйца в чашку или лоток.

4. Оставшуюся внутри скорлупы хорионаллантоисную оболочку осторожно извлекают пинцетом и помещают в стерильную чашку с физиологическим раствором. Здесь её расправляют и изучают изменения, поместив чашку на тёмный фон.

Для получения из хорионаллантоисной оболочки материала, содержащего вирус, её нужно измельчить ножницами и затем растереть в ступке с кварцевым стеклом, добавив солевой раствор. Полученную суспензию центрифугируют при 2000 об/мин в течение 10-15 минут и надосадочная жидкость используется в качестве вируссодержащего материала.

Рис. 3. Заражение куриных эмбрионов

1.3.3. Заражение в аллантоиную полость

Для заражения берут эмбрионы 10-11-дневного возраста. Основные этапы заражения:

1. Яйцо помещают на подставку тупым концом кверху и проводят стерилизацию скорлупы над воздушным пространством.

2. В центре тупого конца делают прокол скорлупы с помощью препаровальной иглы.

3. В отверстие вводят иглу шприца, содержащего разведение вируса. Иглу продвигают в вертикальном направлении на 2-3 мм ниже уровня воздушного мешка и затем вводят 0,1-0,2 мл материала.

4. Отверстие в скорлупе заделывают с помощью расплавленного стерильного парафина.

Заражённые эмбрионы выдерживают в термостате обычно в течение 2 суток. Перед вскрытием яйца помещают на ночь в холодильник при 4 0 С. Вскрытие производится в следующем порядке:

1. Яйцо устанавливается на подставке так, чтобы воздушный мешок находился наверху, скорлупу над ним стерилизуют.

2. С помощью ножниц скорлупу срезают немного выше границы воздушного пространства.

3. Осторожно удаляют пинцетом скорлупную оболочку, после чего хорионаллантоисную оболочку прокалывают пастеровской пипеткой в том месте, где нет сосудов, и насасывают аллантоисную жидкость.

4. Аллантоисную жидкость переносят в стерильную пробирку, а часть засевают в бульон для проверки на бактериологическую стерильность.

Эмбрионы используют в возрасте от 8 до 14 дней в зависимости от вида вируса, способа заражения. Размножение в куриных эмбрионах происходит в разных частях зародыша.Способы заражения: на хорионаллантоисную оболочку, в аллотоисную и амниотическую, желточный мешок, тело эмбриона.

29.Тканевые культуры.

В зависимости от техники приготовления 3 вида клеток:

Однослойные способны размножаться на поверхности химически нейтрального стекла в виде монослоя;

Суспензионные, размн-я во всем объеме питательной среды;

Органные-цельные кусочки органов и тканей, сохраняющие исходную структуру.

Приготовление первичной культуры клеток складываются из нескольких этапов: измельчение ткани, разъединение клеток, отмывание полученной суспензии от трипсина.

Индикация:

- цитопатичекое действие- видимые под микроскопом морфологические изменения клеток, вплоть до отторжения от стекла.

Вирусные включения- это скопление вирусных частиц или отделение компонентов вирусов в цитоплазме или ядре клеток.

Бляшки-ограниченные участки, состоящие из дегенеративных клеток. Они видны как светлые пятна на фоне окрашенных клеток.

Цветная проба

Гемадсорбция-способность культур клеток адсорбировать на своей поверхности эритроциты.

Интерференция.

30.Классификация, хим.Состав бактериофагов.

Бактериофаги- вирусы бактерий, обладающие способностью проникать в бактериальные клетки, вызывать их растворение. Имеют форму головастика, некоторые кубической нитевидной формы. Состоят из икосаэдрической головки и хвостого отростка. Внутри хвостого отростка цилиндрический стержень,снаружи- чехол, отросток заканчивается шестиугольной базальной пластинкой с короткими шипами. Фаги состоят из нуклеиновой кислоты и белка. У фагов имеющих форму сперматозойда, двунитчатая ДНК плотно упакована в виде спирали внутри головки. Белки входят в состав оболочки. Кроме структурных белков обнаружены внутренние белки, связанные с нуклеиновой кислотой и белки-ферменты, участвующие во взаимодействии фага с клеткой.

31. Процесс взаимодействия вирулентных фагов и чувствительной к ним бактериальной клетки

Вирулентные фаги могут только увеличиваться в количестве посредством литического цикла. Процесс взаимодействия вирулентного бактериофага с клеткой складывается из нескольких стадий: адсорбции бактериофага на клетке, проникновения в клетку, биосинтеза компонентов фага и их сборки, выхода бактериофагов из клетки.

Первоначально бактериофаги прикрепляются к фагоспецифическим рецепторам на поверхности бактериальной клетки. Хвост фага с помощью ферментов, находящихся на его конце (в основном лизоцима), локально растворяет оболочку клетки, сокращается и содержащаяся в головке ДНК инъецируется в клетку, при этом белковая оболочка бактериофага остается снаружи. Инъецированная ДНК вызывает полную перестройку метаболизма клетки: прекращается синтез бактериальной ДНК, РНК и белков. ДНК бактериофага начинает транскрибироваться с помощью собственного фермента транскриптазы, который после попадания в бактериальную клетку активируется. Синтезируются сначала ранние, а затем поздние иРНК, которые поступают на рибосомы клетки-хозяина, где синтезируются ранние (ДНК-полимеразы, нуклеазы) и поздние (белки капсида и хвостового отростка, ферменты лизоцим, АТФаза и транскриптаза) белки бактериофага. Репликация ДНК бактериофага происходит по полуконсервативному механизму и осуществляется с участием собственных ДНК-полимераз. После синтеза поздних белков и завершения репликации ДНК наступает заключительный процесс - созревание фаговых частиц или соединение фаговой ДНК с белком оболочки и образование зрелых инфекционных фаговых частиц.

Заражение на хорионаллантоисную оболочку. Этот метод является одним из наиболее употребительных. Основное преимущество его в том, что ряд вирусов при размножении на хорионаллантоисной оболочке вызывают ее характерные изменения, образуя очаги поражения в виде беловатых пятен-бляшек различной морфологии.

Для заражения используют эмбрионы 10-12-дневного возраста. Обычно к хорионаллантоисной оболочке проникают, сделав отверстие в скорлупе над воздушным мешком или же на боковой стороне яйца.

Основные этапы заражения на хорионаллантоисную оболочку со стороны воздушного пространства:

1. Яйцо помещают на подставку в вертикальном положении
так, чтобы воздушный мешок находился наверх}"; проводят
тщательную стерилизацию скорлупы на тупом конце яйца.

2. Над центром воздушного мешка делают прокол скорлупы
с помощью препаровальной иглы.

3. В образовавшееся отверстие вводят браншу ножниц и
вырезают окно в скорлупе около 1,5см в диаметре. (При этом
нельзя допускать попадания кусочков скорлупы внутрь яйца).

4. Через сделанное отверстие виден внутренний листок
скорлупной оболочки, его осторожно надрывают глазным
пинцетом или иглой и отслаивают на небольшом участке (0,5-1
см 2), обнажив хорионаллантоисную оболочку.

5. Производят заражение хорионаллантоисной оболочки
путем нанесения на нее 0,1-0,2 мл вируссодержащего материала
(например вируса осповакцины) с помощью пастеровской пипетки
или шприца.

6. Окошко в скорлупе закрывают специальной эластичной
пленкой, стерильным покровным стеклом или стеклянным
колпачком. Для прикрепления стекла и колпачка к скорлупе
пользуются расплавленным парафином.

Зараженные эмбрионы помещают в термостат в вертикальном положении и инкубируют в течение 2-3 суток, после чего производят вскрытие по следующим правилам:

1. Яйцо помещают на подставку так, чтобы воздушное
пространство было наверху, проводится стерилизация места
предстоящего вскрытия путем соответствующей обработки
спиртом и йодом.

2. Удалив пленку, покровное стекло или колпачек,
стерильными ножницами срезают скорлупу по границе воздушного
пространства.

3. Пользуясь пинцетом, снимают скорлупную оболочку.
Обнаженную хорионаллантоисную оболочку (на которой могут
быть видимые изменения) подрезают вдоль края скорлупы. Через
образовавшееся отверстие выливают все содержимое яйца в чашку
или лоток.

4. Оставшуюся внутри скорлупы хорионаллантоисную
оболочку осторожно извлекают пинцетом и помещают в
стерильную чашку с физиологическим раствором. Здесь ее
расправляют и изучают изменения, поместив чашку на темный
фон.

Для получения из хорионаллантоисной оболочки материала, содержащего вирус, ее нужно измельчить ножницами и затем растереть в ступке с кварцевым стеклом, добавив солевой раствор. Полученную суспензию центрифугируют при 2000 об/мин в течение 10-15 минут и надосадочную жидкость использую! в качестве вируссодержащего материала (требуется обязательная проверка на отсутствие бактериального загрязнения).

Заражение в аллантоисную полость. Этот метод

отличается своей простотой и ценен тем, что способствует значительному накоплению вируса. Для заражения обычно берут эмбрионы 10-И - дневного возраста. Основные этапы заражения в аллантоисную полость:

}. Яйцо помещают на подставку тупым концом кверху и проводят стерилизацию скорлупы над воздушным пространством.

2. В центре тупого конца делают прокол скорлупы с
помощью препаровальной иглы.

3. В отверстие вводят иглу шприца, содержащего разведение
вируса (например вируса гриппа). Иглу продвигают в
вертикальном направлении на 2-3 мм ниже уровня воздушного
мешка и затем вводят ОД-0,2 мл материала.

4. Отверстие в скорлупе заделывают с помощью
расплавленного стерильного парафина.

Заражённые эмбрионы выдерживают в термостате обычно в течение 2 суток. Перед вскрытием яйца помещают на ночь в холодильник при 4°. Вскрытие производится в следующем порядке:

1.Яйцо устанавливают на подставке так, чтобы воздушный мешок находился наверху, скорлупу над ним стерилизуют;

2. С помощью ножниц скорлупу срезают немного выше
границы воздушного пространства.

3. Осторожно удаляют пинцетом скорлупнуюоболочку, после
чего хорионаллантоисную оболочку прокалывают пастеровской
пипеткой в том месте, где нет сосудов, и насасывают аллантоисную
жидкость (ее удается набрать 5-6 мл).

4. Аллантоисную жидкость переносят в стерильную
пробирку, а часть засевают в бульон для проверки на
бактериологическую стерильность.

Метод заражения в аллантоисную полость часто применяют для культивирования вируса гриппа, а также паротита и осповакцины.

Заражение в полость амниона

Этот метод более труден для выполнения и применяется несколько реже предыдущих. Особенностью его является то, что при заражении некоторыми пневмотропными вирусами (например, вирусами гриппа, паротита), последние размножаются не только в клетках оболочки амниона, но и в дыхательных путях и легочной ткани эмбриона, куда проникает инфицированная жидкость. Для заражения используют эмбрионы 7-12 - дневного возраста. Заражение в амниотическую полость проводят открытым методом, когда для введения материала в скорлупе делается сравнительно большое отверстие, или же закрытым методом, когда заражение производят через прокол скорлупы.

Первый из них более травматичен, второй - менее надежен, так как, действуя вслепую, не всегда удается ввести иглу в полость амниона.

Техника открытого метода заражения:

1. Яйцо помещают на подставку и проводят стерилизацию
скорлупы в области тупого конца.

2. Над центром воздушного пространства в скорлупе
ножницами вырезают окошко величиной 2 см в поперечнике (как
для заражения на хорионаллантоисную оболочку).

3. Осторожно снимают внутренний листок скорлупной
оболочки с помощью пинцета, обнажая подлежащую
хорионаллантоисную оболочку.

Прорезают ножницами небольшое отверстие в
хорионаллантоисной оболочке в том месте, где нет кровеносных сосудов, и вводят в прорез глазной пинцет. Пинцетом захватывают оболочку амниона и вытягивают амниотический мешок над поверхностью хорионаллантоисной оболочки.

5. Удерживая- амниотическую оболочку в этом положении,
производят заражение в полость амниона, вводя шприцем 0,1-
0,2 мл разведения вируса.

6. Отверстие в скорлупе закрывают стерильным колпачком
или покровным стеклом, пользуясь для их фиксации и
герметизации яйца расплавленным парафином.

Зараженные эмбрионы инкубируют в течение 2 суток, выбраковывая погибшие в течение первых суток (наблюдения ведут через окошко в скорлупе). После вскрытия эмбрионы выдерживают в течение ночи в холодильнике при 4° С.

Техника вскрытия эмбриона при заражении в амниотическую полость:

1. Простерилизовав место предстоящего вскрытия, срезают
скорлупу немного выше края воздушного мешка.

2. Прокалывают хорионаллантоисную оболочку
пастеровской пипеткой и удаляют аллантоисную жидкость.

3. Захватив пинцетом амниотический мешок, прокалывают
его оболочку иглой шприца или пастеровской пипеткой и
насасывают амнистическую жидкость (от 0,5 до 1,5 мл). У
зараженного эмбриона жидкость должна быть мутной, между тем
как у нормального эмбриона она прозрачна.

4. Взятую жидкость переносят в стерильную пробирку, 0,1-
0,3 мл ее засевают в бульон для контроля на бактериологическую
стерильность.

Большое значение в развитии вирусологии имело введение методов культивирования вирусов в куриных эмбрионах. Для репродукции вируса используют куриные эмбрионы 7-12-дневного возраста, инкубированные в термостате при 37 С. Необходимым условием для правильного развития зародыша является соблюдение определенной влажности воздуха, которую можно создать, поместив в термостат сосуд с водой. Культивирование вирусов в куриных эмбрионах проводится в разных местах эмбриона, который заражают:

1) на хорион-аллантоисную оболочку;

2) в аллантоисную полость;

3) в амниотическую полость;

4) в желточный мешок.

Заражение куриных эмбрионов проводят в боксе с использованием стерильных инструментов. Перед: заражением куриные эмбрионы двукратно протирают ватным тампоном, смоченным спиртом.

Заражение на хорион-аллантоисную оболочку . После дезинфекции яйца осторожно срезают кусочек скорлупы с тупого концы, снимают подскорлупную оболочку - при этом обнаруживается хорион-аллатиоисная оболочка. Инфекционный материал в количестве 0,1-0,2 мл при помощи шприца или пастеровской пипетки наносят па хорион-аллантоисную оболочку. После заражения отверсто закрывают колпачком и просвет между ним и куриным эмбрионом заливают парафином. На другой стороне яйца простым карандашом пишут название инфекционного материала и дату заражения.

Заражение в амниотическую полость. Яйцо овоскопируют и на боковой стороне выбирают участок, где хорион-аллантоис лишен крупных кровеносных сосудов. Этот участок отмечают карандашом. Яйца укладывают на подставку в горизонтальном положении, дезинфицируют и специальным стерильным копьем прокалывают отверстие и скорлупе на глубину 2-3 мм, через которое вводят на это же расстояние иглу с инфекционным материалом непосредственно в амниотическую полость. Для того чтобы вводимая жидкость не вытекала обратно, предварительно делают прокол над воздушным мешком. После чего оба отверстия заливают парафином.

Заражение в аллантоисную полость. Заражение производят и затененном боксе. Отмечают воздушное пространство, скорлупу над воздушным пространством дезинфицируют и через отверстие в скорлупе вводят по направлению к эмбриону иглу шприца с материалом. Если игла попала в аллантоисную полость, то наблюдается смещение тени эмбриона. После заражения отверстие заливают парафином.

Заражение, в желточный мешок. Скорлупу дезинфицируют. Яйцо помещают на подставку тупым концом вправо так, чтобы желточный меток был обращен вверх. Над воздушной камерой в центре прокалывают отверстие. Через отверстие в скорлупе в скорлупе в горизонтальном направлении на глубину 2-3 мм вводят иглу шприца, которая попадает в желточный мешок. Материал вводят в объёме 0,2-0,3 мл. После введения материала отверстие парафинируют.

Температурный режим и длительность инкубации зависят от биологических свойств данного вируса. Инфицированные яйца ежедневно проверяют, овоскопируют для проверки жизнеспособности эмбриона. Если эмбрионы погибают в первые сутки, то причиной этого обычно бывает травма при заражении. Такие яйца выводят из опыта. Наличие вируса в заражённом эмбрионе определяют по характерным изменениям хорион-аллантоисной оболочки зараженного куриного эмбриона. Вирусы, не обладающие гемагпотинирующей активностью, выявляют с помощью РСК. Для выявления вируса в аллантоисной или амниотической жидкостях зараженных эмбрионов ставят РГА.