Молекулярные эффекты действия ферментов. Ферменты. Особенности ферментативного катализа. Строение и структура ферментов Ферментативная реакция по типу "последовательных реакций"

Любая каталитическая реакция предполагает изменение скоростей как прямой, так и обратной реакции за счет снижения ее энергетики. Если хими­ческая реакция протекает с выделением энергии, то она должна начинаться спонтанно. Однако этого не происходит, потому что компоненты реакции должны быть переведены в активированное (переходное) состояние. Энергия, необходимая для перевода реагирующих молекул в активированное состояние, называется энергией активации .

Переходное состояние характери­зуется непрерывным образованием и разрывом химических связей, причем между переходным и основным состояниями существует термодинамическое равновесие. Скорость прямой реакции зависит от температуры и разности значений свободной энергии для субстрата в переходном и основном состоя­ниях. Эта разность называется свободной энергией реакции .

Достижение переходного состояния субстрата возможно двумя путями:

• за счет передачи реагирующим молекулам избыточ­ной энергии (например, за счет увеличе­ния температуры),
• за счет снижения энергии активации соответствующей химической реакции.

Основное и переходное состояния реагирующих веществ.

Ео, Ек - энергия активации реакции без и в присутствии катализатора; DG -

разность свободной энергии реакции.

Ферменты «помогают» субстратам принять переходное состояние за счет энергии связывания при образовании фермент-субстратного комплекса . Сни­жение энергии активации при фермента­тивном катализе обусловлено увеличе­нием числа стадий химического процес­са. Индуцирование ряда промежуточных реакций приводит к тому, что исходный активационный барьер дробится на несколько более низких барьеров, преодо­леть которые реагирующие молекулы могут гораздо быстрее, чем основной.

Механизм ферментативной реакции можно представить следу­ющим образом:

1. соединение фермента (Е) и субстрата (S) с образованием не­стойкого фермент-субстратного комплекса (ES): Е + S → E-S;
2. образование активированного переходного состояния: Е-S → (ES)*;
3. высвобождение продуктов реакции (Р) и регенерация фермен­та (Е): (ES)* → Р + Е.

Для объяснения высокой эффективности действия энзимов было предложено несколько теорий механизма ферментативного катализа. Наиболее ранней является теория Э. Фишера (теория «шаблона» или «жесткой матрицы »). Согласно этой теории фермент является жест­кой структурой, активный центр которой представляет собой «сле­пок» субстрата. Если субстрат подойдет к активному центру фермен­та как «ключ к замку», то произойдет химическая реакция. Эта тео­рия хорошо объясняет два типа субстратной специфичности фермен­тов - абсолютную и стереоспецифичность, но оказывается несостоя­тельной при объяснении групповой (относительной) специфичности ферментов.

Теория «дыбы» основана на представлениях Г. К. Эйлера, изучав­шего действие гидролитических ферментов. По этой теории фермент связывается с молекулой субстрата в двух точках, при этом происходит растяжение химической связи, перераспределение элек­тронной плотности и разрыв химической связи, сопровождающий­ся присоединением воды. Субстрат до присоединения к ферменту имеет «расслабленную» конфигурацию. После связывания с активным центром молекула субстрата подвергается растяжению и деформации (располагается в активном центре как на дыбе). Чем больше длина химических связей в субстрате, тем легче они разрываются и тем меньше энергия активации химической реакции.

В последнее время нашла широкое распространение теория «ин­дуцированного соответствия» Д. Кошланда, которая допускает высо­кую конформационную лабильность молекулы фермента, гибкость и подвижность активного центра. Субстрат индуцирует конформационные изменения молекулы фермента таким образом, что активный центр принимает необходимую для связывания субстрата простран­ственную ориентацию, т. е. субстрат подходит к активному центру как «рука к перчатке».

Согласно теории индуцированного соответствия механизм взаи­модействия фермента и субстрата следующий:

1. фермент по принципу комплементарности распознает и «ловит» молекулу субстрата. В этом процессе белковой молекуле помога­ет тепловое движение ее атомов;
2. аминокислотные остатки активного центра смещаются и под­страиваются по отношению к субстрату;
3. химические группировки ковалентно присоединяются в активном центре - ковалентный катализ.

Последовательность событий в ферментативном катализе можно описать следующей схемой. Вначале формируется субстрат-ферментный комплекс. При этом происходит изменение конформаций ферментной молекулы и молекулы субстрата, последняя фиксируется в активном центре в напряженной конфигурации. Так формируется активированный комплекс, или переходное состояние , - высокоэнергетическая промежуточная структура, которая энергетически менее устойчива, чем исходные соединения и продукты. Важнейший вклад в суммарный каталитический эффект вносит процесс стабилизации переходного состояния -взаимодействия между аминокислотными остатками белка и субстратом, находящимся в напряженной конфигурации. Разность значений свободной энергии для исходных реагентов и переходного состояния соответствует свободной энергии активации (ΔG #). Скорость реакции зависит от величины (ΔG #) : чем она меньше, тем больше скорость реакции, и наоборот. По сути DG представляет собой «энергетический барьер», который требуется преодолеть для осуществления реакции. Стабилизация переходного состояния понижает этот «барьер» или энергию активации. На следующем этапе происходит сама химическая реакция, после чего образовавшиеся продукты освобождаются из фермент-продуктного комплекса.

Можно выделить несколько причин высокой каталитической активности ферментов, которые обеспечивают снижение энергетического барьера реакции.

1. Фермент может связывать молекулы реагирующих субстратов таким образом, что их реакционноспособные группы будут располагаться поблизости друг от друга и от каталитических групп фермента (эффект сближения ).

2. При образовании субстрат-ферментного комплекса достигаются фиксация субстрата и его оптимальная для разрыва и образования химических связей ориентация (эффект ориентации ).

3. Связывание субстрата приводит к удалению его гидратной оболочки (существует на растворенных в воде веществах).

4. Эффект индуцированного соответствия субстрата и фермента.

5. Стабилизация переходного состояния.

6. Определенные группы в молекуле фермента могут обеспечивать кислотно-основный катализ (перенос протонов в субстрате) и нуклеофильный катализ (формирование ковалентных связей с субстратом, что приводит к образованию более реакционноспособных структур, чем субстрат).

Одним из примеров кислотно-основного катализа является гидролиз гликозидных связей в молекуле муреина с помощью лизоцима. Лизоцим представляет собой фермент, присутствующий в клетках различных животных и растений: в слезной жидкости, слюне, курином белке, молоке. Лизоцим из куриных яиц имеет молекулярную массу 14 600 Да, состоит из одной полипептидной цепи (129 аминокислотных остатков) и имеет 4 дисульфидных мостика, что обеспечивает высокую стабильность фермента. Рентгеноструктурный анализ молекулы лизоцима показал, что она состоит из двух доменов, образующих «щель», в которой находится активный центр. Вдоль этой «щели» связывается гексосахарид, причем для связывания каждого из шести сахарных колец муреина на ферменте имеется свой участок (А, В, С, D, E и F) (рис. 6.4).

Молекула муреина удерживается в активном центре лизоцима в основном благодаря водородным связям и гидрофобным взаимодействиям. В непосредственной близости к месту гидролиза гликозидной связи расположены 2 аминокислотных остатка активного центра: глутаминовая кислота, занимающая 35-е положение в полипептиде, и аспарагиновая кислота - 52-е положение в полипептиде (рис. 6.5).

Боковые цепи этих остатков располагаются на противоположных поверхностях «щели» в непосредственной близости к атакуемой гликозидной связи - примерно на расстоянии 0,3 нм. Остаток глутамата находится в неполярном окружении и не ионизирован, а остаток аспартата- в полярном окружении, его карбоксильная группа депротонирована и участвует в качестве акцептора водорода в сложной сети водородных связей.

Процесс гидролиза осуществляется следующим образом. Протонирован карбоксильная группа остатка Glu-35 предоставляет свой протон гликозидному атому кислорода, что приводит к разрыву связи между этим атомом кислорода и С 1 -атомом сахарного кольца, располагающегося в участке D (стадия общего кислотного катализа). В результате образуется продукт, включающий в себя сахарные кольца, находившиеся в участках E и F, который может высвободиться из комплекса с ферментом. Конформация сахарного кольца, расположенного в участке D, искажается, принимая конформацию полукресла , в которой пять из шести атомов, образующих сахарное кольцо, лежат практически в одной плоскости. Эта структура соответствует конформации переходного состояния. При этом С 1 -атом оказывается положительно заряженным и промежуточный продукт носит название карбоний-иона (карбкатиона). Свободная энергия переходного состояния уменьшается за счет стабилизации карбоний-иона депротонированной карбоксильной группой остатка Asp-52 (рис. 6.5).

На следующем этапе в реакцию вступает молекула воды, которая замещает диффундирующий из области активного центра дисахаридный остаток. Протон молекулы воды переходит к Glu-35, а гидроксильный ион (ОН -) к атому С 1 карбоний-иона (стадия общего основного катализа). В результате второй фрагмент расщепленного полисахарида становится продуктом реакции (конформация кресла) и уходит из области активного центра, а фермент возвращается в исходное состояние и готов осуществить следующую реакцию расщепления дисахарида (рис.6.5).

Свойства ферментов

Характеризуя свойства ферментов, в первую очередь оперируют понятием «активность». Под активностью фермента понимают такое его количество, которое катализирует превращение определенного количества субстрата в единицу времени. Для выражения активности препаратов ферментов используют две альтернативные единицы: международную (Е) и «катал» (кат). За международную единицу активности фермента принято то его количество, которое катализирует превращение 1 мкмоль субстрата в продукт за 1 мин в стандартных условиях (обычно оптимальных). Один катал обозначает количество фермента, катализирующее превращение 1 моль субстрата за 1 с. 1 кат=6*10 7 Е.

Часто ферментные препараты характеризуются удельной активностью, которая отражает степень очистки фермента. Удельная активность - это число единиц активности фермента на 1 мг белка.

Активность ферментов в очень сильной степени зависит от внешних условий, среди которых первостепенное значение имеют температура и рН среды. Повышение температуры в интервале 0-50° С обычно приводит к плавному увеличению ферментативной активности, что связано с ускорением процессов формирования субстрат-ферментного комплекса и всех последующих событий катализа. Однако дальнейшее повышение температуры, как правило, сопровождается увеличением количества инактивированного фермента за счет денатурации его белковой части, что выражается в снижении активности. Каждый фермент характеризуется температурным оптимумом - значением температуры, при котором регистрируется наибольшая его активность. Чаще для ферментов растительного происхождения температурный оптимум лежит в пределах 50-60° С, а животного - между 40 и 50° С. Ферменты термофильных бактерий характеризуются очень высоким температурным оптимумом.

Зависимость активности ферментов от значений рН среды также имеет сложный характер. Для каждого фермента характерен оптимум рН среды, при котором он проявляет максимальную активность. При удалении от этого оптимума в одну либо другую сторону ферментативная активность снижается. Это объясняется изменением состояния активного центра фермента (уменьшением или увеличением ионизации функциональных групп), а также третичной структуры всей белковой молекулы, которая зависит от соотношения в ней катионных и анионных центров. Большинство ферментов имеют оптимум рН в области нейтральных значений. Однако есть ферменты, проявляющие максимальную активность при рН 1,5 (пепсин) или 9,5 (аргиназа).

Активность ферментов подвержена значительным колебаниям в зависимости от воздействия ингибиторов (вещества, снижающие активность) и активаторов (вещества, увеличивающие активность). Роль ингибиторов и активаторов могут выполнять катионы металлов, некоторые анионы, переносчики фосфатных групп, восстановительных эквивалентов, специфические белки, промежуточные и конечные продукты метаболизма и др. Эти вещества могут попадать в клетку извне либо вырабатываться в ней. В последнем случае говорят о регуляции активности ферментов - неотъемлемом звене в общей регуляции метаболизма.

Воздействующие на активность ферментов вещества могут связываться с активным и аллостерическим центрами фермента, а также вне этих центров. Частные примеры подобных явлений будут рассмотрены в главах 7- 19. Для обобщения некоторых закономерностей ингибирования активности ферментов следует указать, что эти явления в большинстве случаев сводятся к двум типам - обратимому и необратимому. В ходе обратимого ингибирования в молекулу фермента не вносится каких-либо изменений после его диссоциации с ингибитором. Примером служит действие аналогов субстрата , которые могут связываться с активным центром фермента, препятствуя взаимодействию фермента с истинным субстратом. Однако увеличение концентрации субстрата приводит к «вытеснению» ингибитора из активного центра, и скорость катализируемой реакции восстанавливается (конкурентное ингибирование ). Другой случай обратимого ингибирования представляет собой связывание ингибитора с простетической группой фермента, или апоферментом , вне активного центра. Например, взаимодействие ферментов с ионами тяжелых металлов, которые присоединяются к сульфгидрильным группам остатков аминокислот фермента, белок-белковые взаимодействия или ковалентая модификация фермента. Такое ингибирование активности называется неконкурентным .

Необратимое ингибирование в большинстве случаев основано на связывании так называемых «суицидных субстратов » с активными центрами ферментов. При этом между субстратом и ферментом формируются ковалентные связи, которые расщепляются очень медленно и фермент долго не способен выполнять свою функцию. Примером «суицидного субстрата» служит антибиотик пенициллин (глава 18, рис. 18.1).

Поскольку для ферментов характерна специфичность действия, их классифицируют по типу реакции, подвергающейся катализу. Согласно принятой в настоящее время классификации, ферменты группируют в 6 классов:

1. Оксидоредуктазы (окислительно-восстановительные реакции).

2. Трансферазы (реакции переноса функциональных групп между субстратами).

3. Гидролазы (реакции гидролиза, акцептором переносимой группы является молекула воды).

4. Лиазы (реакции отщепления групп негидролитическим путем).

5. Изомеразы (реакции изомеризации).

6. Лигазы, или синтетазы (реакции синтеза за счет энергии расщепления нуклеозидтрифосфатов, чаще АТР).

Номер соответствующего класса фермента закреплен в его кодовой нумерации (шифре). Шифр фермента состоит из четырех разделенных точками чисел, обозначающих класс фермента, подкласс, подподкласс и порядковый номер в подподклассе.

ЭТАПЫ ФЕРМЕНТАТИВНОГО КАТАЛИЗА

1. Формирование фермент-субстратного комплекса

Ферменты обладают высокой специфичностью и это позволило выдвинуть гипотезу, согласно которой активный центр фермента комплементарен субстрату, т.е. соответствует ему как «ключ замку». После взаимодействия субстрата «ключ» с активным центром «замок» происходят химические превращения субстрата в продукт.

Позднее был предложен другой вариант этой гипотезы – активный центр является гибкой структурой по отношению к субстрату. Субстрат, взаимодействуя с активным центром фермента, вызывает изменение его конформации, приводя к формированию фермент-субстратного комплекса. При этом субстрат также изменяет свою конформацию, что обеспечивает более высокую эффективность ферментативной реакции.

2. Последовательность событий в ходе ферментативного катализа

а. этап сближения и ориентации субстрата относительно активного центра фермента

б. образование фермент-субстратного комплекса

в. деформация субстрата и образование нестабильного комплекса фермент-продукт

г. распад комплекса фермент-продукт с высвобождением продуктов реакции из активного центра фермента и освобождением фермента

3. Роль активного центра в ферментативном катализе

В контакт с субстратом вступает лишь небольшая часть фермента, от 5 до 10 аминокислотных остатков, формирующих активный центр фермента. Остальные аминокислотные остатки обеспечивают правильную конформацию молекулы фермента для оптимального протекания химической реакции. В активном центре фермента субстраты располагаются так, чтобы участвующие в реакции функциональные группы субстратов находились в непосредственной близости друг к другу. Такое расположение субстратов снижает энергию активации, что определяет каталитическую эффективность ферментов.

Выделяют 2 основных механизма ферментативного катализа:

1. кислотно-основной катализ

2. ковалентный катализ

Концепция кислотно-основного катализа объясняет ферментативную активность участием в химической реакции кислотных групп (доноры протонов) и/или основных групп (акцепторы протонов). Аминокислотные остатки, входящие в состав активного центра, имеют функциональные группы, проявляющие свойства как кислот, так и оснований. Это цистеин, тирозин, серин, лизин, глутаминовая кислота, аспарагиновая кислота и гистидин.

Примером кислотно-основного катализа является окисление спирта с помощью фермента алкогольдегидрогеназы.

Ковалентный катализ основан на атаке «-» и «+» групп активного центра фермента молекулами субстрата с формированием ковалентной связи между субстратом и коферментом. Примером является действие сериновых протеаз (припсин, хемотрипсин) на гидролиз пептидных связей при переваривании белков. Ковалентная связь образуется между субстратом и аминокислотным остатком серина активного центра фермента.

Катализ – это процесс ускорения химической реакции под влиянием катализаторов, которые активно участвуют в ней, но к концу реакции остаются химически неизмененными. Катализатор ускоряет установление химического равновесия между исходными веществами и продуктами реакции. Энергия, необходимая для начала химической реакции, называется энергией активации . Она необходима, чтобы молекулы, участвующие в реакции, могли перейти в реакционно-способное (активное) состояние. Механизм действия фермента направлен на то, чтобы понизить энергию активации. Это достигается разделением реакции на отдельные шаги или этапы благодаря участию самого фермента. Каждый новый этап обладает более низкой энергией активации. Разделение реакции на этапы становится возможным благодаря образованию комплекса фермента с исходными веществами, так называемыми субстратами (S ). Такой комплекс называется фермент-субстратным (ES ). Далее этой комплекс расщепляется с образованием продукта реакции (Р) и неизмененного фермента (Е ).

E + S ES E + P

Таким образом, фермент – это биокатализатор, который путем образования фермент – субстратного комплекса разбивает реакцию на отельные этапы с более низкой энергией активации и тем самым резко повышает скорость реакции.

4. Свойства ферментов.

Все ферменты - белковой природы.

Ферменты обладают высокой молекулярной массой.

Они хорошо растворимы в воде, при растворении образуют коллоидные растворы.

Все ферменты - термолабильны, т.е. оптимум действия 35 – 45 о С

По химическим свойствам являются амфотерными электролитами.

Ферменты высокоспецифичны по отношению к субстратам.

Ферменты для своего действия требуют строго определенного значения рН (пепсин 1.5 – 2.5).

Ферменты обладают высокой каталитической активностью (ускоряют скорость реакции в 10 6 – 10 11 раз).

Все ферменты способны к денатурации по воздействием сильных кислот, щелочей, спиртов, солей тяжелых металлов.

Специфичность действия ферментов:

По специфичности действия ферменты делятся на две группы: обладающие абсолютной специфичностью и с относительной специфичностью.

Относительная специфичность наблюдается, когда фермент катализирует реакции одного типа с более чем одним структуроподобным субстратом. Например, пепсин расщепляет все белки с животного происхождения. Такие ферменты действуют на определенный тип химической связи, в данном случае на пептидную связь. Действие этих ферментов распространяется на большое число субстратов, что позволяет организму обойтись небольшим числом пищеварительных ферментов.

Абсолютная специфичность проявляется тогда, когда фермент действует лишь на одно-единственное вещество и катализирует лишь определенное превращение данного вещества. Например, сахараза расщепляет только сахарозу.

Обратимость действия:

Некоторые ферменты могут катализировать как прямую реакцию, так и обратную. Например, лактатдегидрогеназа, фермент катализирующий окисление лактата до пирувата и восстановление пирувата до лактата.

Последовательность событий в ферментативном катализе можно описать следующей схемой. Вначале формируется субстрат-ферментный комплекс. При этом происходит изменение конформаций ферментной молекулы и молекулы субстрата, последняя фиксируется в активном центре в напряженной конфигурации. Так формируется активированный комплекс, или переходное состояние , - высокоэнергетическая промежуточная структура, которая энергетически менее устойчива, чем исходные соединения и продукты. Важнейший вклад в суммарный каталитический эффект вносит процесс стабилизации переходного состояния -взаимодействия между аминокислотными остатками белка и субстратом, находящимся в напряженной конфигурации. Разность значений свободной энергии для исходных реагентов и переходного состояния соответствует свободной энергии активации (ΔG #). Скорость реакции зависит от величины (ΔG #) : чем она меньше, тем больше скорость реакции, и наоборот. По сути DG представляет собой «энергетический барьер», который требуется преодолеть для осуществления реакции. Стабилизация переходного состояния понижает этот «барьер» или энергию активации. На следующем этапе происходит сама химическая реакция, после чего образовавшиеся продукты освобождаются из фермент-продуктного комплекса.

Можно выделить несколько причин высокой каталитической активности ферментов, которые обеспечивают снижение энергетического барьера реакции.

1. Фермент может связывать молекулы реагирующих субстратов таким образом, что их реакционноспособные группы будут располагаться поблизости друг от друга и от каталитических групп фермента (эффект сближения ).

2. При образовании субстрат-ферментного комплекса достигаются фиксация субстрата и его оптимальная для разрыва и образования химических связей ориентация (эффект ориентации ).

3. Связывание субстрата приводит к удалению его гидратной оболочки (существует на растворенных в воде веществах).

4. Эффект индуцированного соответствия субстрата и фермента.

5. Стабилизация переходного состояния.

6. Определенные группы в молекуле фермента могут обеспечивать кислотно-основный катализ (перенос протонов в субстрате) и нуклеофильный катализ (формирование ковалентных связей с субстратом, что приводит к образованию более реакционноспособных структур, чем субстрат).

Одним из примеров кислотно-основного катализа является гидролиз гликозидных связей в молекуле муреина с помощью лизоцима. Лизоцим представляет собой фермент, присутствующий в клетках различных животных и растений: в слезной жидкости, слюне, курином белке, молоке. Лизоцим из куриных яиц имеет молекулярную массу 14 600 Да, состоит из одной полипептидной цепи (129 аминокислотных остатков) и имеет 4 дисульфидных мостика, что обеспечивает высокую стабильность фермента. Рентгеноструктурный анализ молекулы лизоцима показал, что она состоит из двух доменов, образующих «щель», в которой находится активный центр. Вдоль этой «щели» связывается гексосахарид, причем для связывания каждого из шести сахарных колец муреина на ферменте имеется свой участок (А, В, С, D, E и F) (рис. 6.4).

Молекула муреина удерживается в активном центре лизоцима в основном благодаря водородным связям и гидрофобным взаимодействиям. В непосредственной близости к месту гидролиза гликозидной связи расположены 2 аминокислотных остатка активного центра: глутаминовая кислота, занимающая 35-е положение в полипептиде, и аспарагиновая кислота - 52-е положение в полипептиде (рис. 6.5).

Боковые цепи этих остатков располагаются на противоположных поверхностях «щели» в непосредственной близости к атакуемой гликозидной связи - примерно на расстоянии 0,3 нм. Остаток глутамата находится в неполярном окружении и не ионизирован, а остаток аспартата- в полярном окружении, его карбоксильная группа депротонирована и участвует в качестве акцептора водорода в сложной сети водородных связей.

Процесс гидролиза осуществляется следующим образом. Протонирован карбоксильная группа остатка Glu-35 предоставляет свой протон гликозидному атому кислорода, что приводит к разрыву связи между этим атомом кислорода и С 1 -атомом сахарного кольца, располагающегося в участке D (стадия общего кислотного катализа). В результате образуется продукт, включающий в себя сахарные кольца, находившиеся в участках E и F, который может высвободиться из комплекса с ферментом. Конформация сахарного кольца, расположенного в участке D, искажается, принимая конформацию полукресла , в которой пять из шести атомов, образующих сахарное кольцо, лежат практически в одной плоскости. Эта структура соответствует конформации переходного состояния. При этом С 1 -атом оказывается положительно заряженным и промежуточный продукт носит название карбоний-иона (карбкатиона). Свободная энергия переходного состояния уменьшается за счет стабилизации карбоний-иона депротонированной карбоксильной группой остатка Asp-52 (рис. 6.5).

На следующем этапе в реакцию вступает молекула воды, которая замещает диффундирующий из области активного центра дисахаридный остаток. Протон молекулы воды переходит к Glu-35, а гидроксильный ион (ОН -) к атому С 1 карбоний-иона (стадия общего основного катализа). В результате второй фрагмент расщепленного полисахарида становится продуктом реакции (конформация кресла) и уходит из области активного центра, а фермент возвращается в исходное состояние и готов осуществить следующую реакцию расщепления дисахарида (рис.6.5).